Аптамеры являются РНК последовательностью, которая может связывать малые молекулы лигандов с высокой специфичностью и сродством. Связывание лиганда часто приводит к конформационным изменениям, которые вызывают структурные изменения третичных складок РНК. Будучи связанными с так наз. экспрессионной платформой, конформационные изменения аптамеров могут быть использованы для влияния на экспрессию белков и действовать как переключатель рибосом (riboswitch). Этот генеральный замысел воспроизводит естественно возникающие выключения рибосом (riboswitches), там, где чувствительный к аптамеру домен обнаруживает связь с экспрессионной платформой, которая влияет на экспрессию генов [1]. Разные системы, отличающиеся использованием аптамеров и экспрессионных платформ, были преобразованы в последние годы, это позволило контролировать экспрессию генов у прокариот и эукариот за счет добавления внешних эффекторных молекул [2,3]. Эти РНК выключатели нуждаются лишь в небольшом кодирующем пространстве и оперируют без каких-либо дополнительных экспрессирующихся белков, делая их идеальными инструментами для регуляции генов в системах ограниченного размера.
Сегодня riboswitches могут быть использованы для вмешательства в экспрессию генов практически на каждой ступени жизненного цикла мРНК. Во время процессинга пре-мРНК аптамеры могут регулировать процесс сплайсинга [4o], тогда как на ст. трансляции они могут контролировать последовательность инициации трансляции [5] или запрограммированный сдвиг рибосомальной рамки [6]. Кроме того, стабильность мРНК может испытывать влияние благодаря доступности сайтов мишеней для microRNA (miRNA) [7o] или благодаря внесению лиганд-зависимых каталитических РНК (ribozymes) [8]. Поскольку аптамеры могут быть отобраны
in vitro с помощью Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment (SELEX) против широкого круга из разных лигандов [9], а изменения в генной экспрессии могут быть индуцированы с помощью минорных не касающихся мишени эффектов, то аптамеры привлекают повышенное внимание в качестве устройств генной регуляции.
Latest advances in aptamer selection via SELEX
Одним из главных узких мест в разработке искусственных базирующихся на аптамерах генных регуляторов является низкое количество in vivo пар функциональный аптамер - лиганд. Пока искусственные системы создавались с использованием главным образом за счет связывания thiamine pyrophosphate, связывания theophylline, связывания neomycin, связывания guanine и связывания tetracycline аптомеров, чтобы контролировать генную экспрессию у бактерий, дрожжей и в клетках млекопитающих, а недавно у Caenorhabditis elegans [8,10,11oo,12]. Из этих аптамеров, TPP-связывающие и guanine-связывающие аптамеры, происходят из естественно возникших riboswitches [13,14], тогда как theophylline-связывающие, neomycin-связывающие и tetracycline-связывающие аптамеры отбирались in vitro с использованием SELEX [15,16,17]. Однако, отбор in vitro аптамеров наталкивается на серьезные затруднения по идентификации последовательностей, которые не только соединяются с соотв. лигандом с высокой специфичностью, но и также способны к riboswitch активности in vivo. В последнее время многие последовательности аптамеров оказывались не функциональными in vivo в базирующемся на РНК устройстве переключения. Одной из потенциальных причин отсутствия подходящей конформации in vivo после связывания лиганда в порядке передачи ощущения (sensing) лиганда соседней экспрессионной платформой для нарушения экспрессии белка. Для исследования этой проблемы группа Suess недавно разработала новые аптамеры с riboswitch активностью против антибиотиков ciprofloxacin [18] и paromomycin [19oo], используя подход совместной сиквенс-активности (sequence-activity). Анализирующий NGS подход SELEX сопровождался in vivo скринингом у дрожжей, которые были обогащены пулами последовательностей после успешных раундов селекции in vitro, которые были клонированы в 5'-UTR от gfp+ репортерного гена Saccharomyces cerevisiae и были подвергнуты скринингу на изменения экспрессии eGFP. После последующей частичной рандомизации избранной последовательности и комбинации благоприятных мутаций, они оказывались способными генерировать ciprofloxacin riboswitch, что сопровождалось in vivo 7.5-кратным подавлением у дрожжей [18]. Кроме того, ciprofloxacin аптамер обнаруживал почти двухкратное увеличение активности в клетках HeLa после минимальных адаптаций последовательности.
Необходимость комбинировать скрининг на высокое сродство с достаточными конформационными изменениями, наконец, привело к созданию чувствительного к paromomycin аптамера группой Suess, используя модифицированный протокол селекции , наз. 'capture SELEX' [19oo,20]. Capture SELEX использует определенную 'docking sequence', которая вносится в рандомизированный пул РНК. Воспринимающая (docking) последовательность соединяется с комплементарным, лишенным подвижности олигонуклеотидом. Элюция с помощью лиганда высвобождает последовательность РНК, которая подвергается значительным конформационным изменениям после захвата олигонуклеотида (Figure 1). Ключевым преимуществом этого метода является отбор structure-switching аптамеров и использование не закрепленных и тем самым не модифицированных лигандов
Figure 1.
Library design and general work flow for capture SELEX.
The library consists of a randomized sequence flanked by a 5'-constant and 3'-constant region for primer binding. A docking sequence is inserted into the randomized pool for hybridization to a capture oligonucleotide and immobilization to streptavidin (SA) coated beads via a biotin tag (biotin TEG). The randomized regions 5' and 3' of the docking sequence are of different lengths and indicated by NN and NM, respectively. Within one cycle of capture SELEX the produced RNA is immobilized via hybridization to the capture oligonucleotide which is linked to a biotin and the whole complex is incubated with the streptavidin coated beads. After several washing steps, the target ligand is added to the captured pool and target-eluted, conformation-changing RNAs are recovered and amplified for the next round of selection. Итак, базирующиеся на РНК выключатели, могут быть предназначены для реакции на эффекторные соединения, используя чувствительные к лигандам аптамеры. Эти системы очень модулярные, поскольку аптамеры могут быть скомбинированы с разными экспрессионными платформами. Базирующиеся на РНК выключатели были сконструированы так, что это позволило им контролировать экспрессию генов в разных контекстах.
