В последние годы быстрыми темпами развивается технология генотерапии она породила надежду на лечение редких болезней, приводя к трансформатируемому воздействию в области генотерапии. Технология Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9) редактирования генов заключается в бактериальной эндонуклеазе (Cas9) в комплексе с малой guide RNA, обнаруживающей последовательность в 20 нуклеотидов в ДНК мишени генома, с помощью этого комплекса специфически распознается сайт мишени с последовательностью protospacer adjacent motif (PAM) [1]. Расщепление этой геномной последовательности мишени генерирует разрыв двойной нити ДНК и инициирует аппарат клеточной репарации с использованием или без репарирующей матрицы. Исходом репарации ДНК является соотв. неточное редактирование (indels) или точное редактирование посредством соединения негомологичных концов или homology-directed repair (HDR) [2]. Кстати, согласно ClinicalTrial.gov базе данных National Institute of Health, свыше 20 клинических испытаний в фазе I сегодня находятся в работе и получены некоторые обещающие результаты. Обеспечение безопасности подхода CRISPR/Cas9 редактирования генов поэтому является первостепенным для своего применения ex-vivo или in vivo редактирования в клинике. Это связано с гарантией высокой специфичности и эффективности целенаправленного действия.

Внимание при терапевтическом редактировании генов в основном уделяется эффектам вне мишени и контролю за доставкой Cas9, чтобы гарантировать безопасность и эффективность целевого воздействия, неучтенным и важным аспектом CRISPR редактирования является появление конверсии митотических генов в сайте мишени. Конверсия гена заключается в том, что вследствие гомологичной рекомбинации перенос ДНК из одного места генома происходит без разрыва двойной нити ДНК, в др. место, где ДНК оказалась разрезана. Важность генной конверсии, в целом, заключается в использовании эндогенной репаративной матрицы для экспериментов генного редактирования стала ясна после публикации Ma et al. [3] их налюдений за эмбрионами человека. Эти эксперименты заключались в репарации доминантных мутаций в гене MYBPC3, ответственном за тяжелую врожденную гипертрофическую кардиомиопатию. Авт. репарировали мутации в геноме отца, используя HDR репарацию с доставкой Cas9 рибонуклеопротеина и репарационной матрицы в оплодотворенный эмбрион. Они сообщили о высокой пропорции репарированных аллелей, указывающих на успешность подхода. Неожиданно, авт. отметили, что некоторые отредактированные эмбрионы имеют материнский аллель на отцовской нити мишени, это указывает, что материнский аллель был использован в качестве репарационной матрицы для. Гипотеза, сформулированная авт. заключалась в том, что материнский аллель был обменян c помощью inter-homology репарации. Поскольку эта интерпретация всё ещё очень спорная [4, 5], то это привело к серии интригующих исследовательских вопросов. Как или почему аппарат репарации использует эндогенную репарационную матрицу после расщепления c помощью Cas9 и как такое преобладание эндогенной репарационной матрицы противоречит генной конверсии? Если конверсия генов является более преобладающей, чем первоначально предполагалось, то может ли стать возможным использование гомологичных регионов в геноме в качестве репарационной матрицы?

Чтобы выяснить эти важные вопросы, Javidi-Parsijani et al. [6] впервые исследовали частоту генной конверсии для beta-hemoglobin (HBB) и delta-hemoglobin (HBD). Мутации HBB ответственны за серповидно-клеточную болезнь или beta-талассемию, два тяжелые врожденные нарушения широко распространенные в популяции человека. Принимая во внимание большой интерес к терапевтическому целенаправленному действию на beta-globin, чтобы лечить тяжелые врожденные нарушения и учитывая эволюционную историю этого локуса, он стал идеальной мишенью для изучения скорости генной конверсии после редактирования генов. HBB и HBD находятся в одном и том же локусе и обнаруживают склонность к генной конверсии и к кроссинговеру асимметричным способом из HBD в HBB [7]. В основе данной гипотезы авт. лежит предположение, что при разрыве двойной нити ДНК Cas9 увеличивает скорость конверсии генов и репарирует эффективно, используя экзогенную матрицу.

Авт. целенаправленно воздействовали на HBB, чтобы вызвать HDR, используя донорскую матрицу, гомологичную HBB, но несущую три молчащих мутации, включая одну в последовательности PAM, чтобы определить, действительно ли отрепарированный аллель происходит из экзогенной или эндогенной матрицы. Используя метод GFP репортера в HEK293T клетках, авт. оценили присутствие следов HBD (footprint) в HBB и величину экзогенной репарации в локусе HBB. Важно, что они впервые доказали, что наблюдаемая величина генной конверсии не обусловлена PCR вызываемой перетасовкой последовательностей или спонтанной конверсией генов. Интересно, что после секвенирования отредактированных клеток и оценки скорости генной конверсии в 4-х вариантах, уникально присутствующих в HBD, авт. установили, что скоростьь генной конверсии коррелирует со скоростью возникновения indel. Путем сравнения различных возможных эндогенных гомологичных регионов в beta-globin локусе, они также отметили, что минимум гомологии в 88-90% в последовательности необходим для генной конверсии. Наконец, путем редактирования HBD и HBB и обнаружения HBD и HBB footprints, авт. подтвердили, что наблюдаемая конверсия генов однонаправлена от HBD к HBB, указывая, что конверсия гена и в самом деле вызывается c помощью CRISPR/Cas9. Следовательно, авт. продемонстрировали, что HBD footprint в локусе HBB вызывается c помощью Cas9 расщепления.

Следующим злободневным вопросом стало, насколько эффективным может быть использование генной конверсии в качестве репарационной матрицы? Это будет важным вкладом в современные споры о том, действительно ли эндогенная матрица может быть использована для усиления эффективности HDR. Для усиления эффекта генной конверсии на HDR репарацию, авт. оценили конкурентноспособность между конверсией гена HBD в качестве эндогенной репарационной матрицы и экзогенной репарационной матрицей, доставляемой в клетки. Они установили, что экзогенные доноры оказались более предпочтительными для использования в качестве матрицы для HDR. Интересно, что величина генной конверсии была пропорциональна эффективности расщепления Cas9 по линейной закономерности. Дальнейшая квантификация аллелей c помощью amplicon секвенирования показала, что 1/10 часть аллелей возникала в результате генной конверсии или c помощью экзогенной матрицы. В целом эти эксперименты показали, что CRISPR/Cas9 индуцирует разрывы двойной нити, это способствует генерации indels, а также способствует экзогенной репарации c помощью HDR.

Javidi-Parsijani et al. сообщили и четко продемонстрировали, что помимо создания инсерций или делеций в месте расщепления, CRISPR/Cas9 может также обусловливать конверсию митотических генов между высоко гомологичными последовательностями. Это наблюдение подтверждает предыдущие сообщения и может частично объяснить присутствие эндогенной1 репарации после редактирования гена у модельных организмов, человеческих и мышиных эмбрионов [3, 8, 9]. Однако им еется очень много непонятного и важно изучить вопросы конверсии митотических генов после CRISPR редактирования. Важно понять, как расстояние между местом разрезания и гомологичной последовательностью влияет на скорость рекомбинации? Существуют ли мотивы последовательности, специфичные в ДНК мишени, важные для управления скоростью генной конверсии? Являются ли события внутрихромосомной рекомбинации предпочтительными в сравнении с межхромосомными событиями? Важны механизмы конверсии митотических генов, отличающиеся от механизмов HDR? Дополнитеельные оценки могут подтвердить эти наблюдения и позволить лучше понять детальные механизмы генной конверсии. Наконец, с целью генотерапии, помимо оценки эффектов вне мишени, квантификация генной конверсии может оказаться важной необходимостью, чтобы составить четкую картину мутагенеза в мишени после CRISPR/Cas9 редактирования, чтобы гарантировать безопасность и эффективность этого подхода.