Неизлечимые повреждения костей являются всё увеличивающимся источником болезней у людей и являются важной медицинской проблемой [1,2]. Помимо увеличения популяции старых людей, где превалируют остеопороз, системное заболевание костей, характеризующиеся снижением костной массы и повышением риска переломов [3]. Растет масса костных болезней, нуждающихся в разработке терапевтических стратегий по регенерации костей.

Mesenchymal stem cells (MSCs) являются мультипотентными клетками, которые дифференцируются в зрелые клетки мезенхимных тканей, такие как жир и кости [4]. MSCs в качестве общих предшественников остеобластов и адипоцитов деликатно сбалансированы в отношении выбора своей судьбы [4]. Формирование новой кости и гомеостаз скелета у взрослых приписывается реципрокной регуляции MSCs в их остеогенный и адипогенный клоны [5]. Нарушение регуляции адипо-остеогенной дифференцировки MSCs в костном мозге может приводить к костным аномалиям и болезням костей [6]. Патологические состояния при остеопорозе увеличивают предопределение MSC в направлении адипогенного клона за счет остеобластной дифференцировки, что приводит к увеличению накопления жира в костном мозге и уменьшению костной массы [[6], [7], [8]]. Модуляция баланса между адипогенезом и остеогенезом представляет собой многообещающую альтернативную стратегию по улучшению регенерации скелета. Такая стратегия предоставляет также потенциал для анаболической терапии для предупреждения и лечения связанной с остеопорозом потери кости.

Транскрипционный контроль детерминации клонов MSC строго регулируется с помощью разных молекулярных факторов и сигналов [9]. Дифференцировка MSCs в остеобласты и адипоциты, как было установлено, контролируется с помощью двух ключевых транскрипционных факторов, Runx2 и PPARг [9,10]. MSCs, детерминированные к определенному клону клеток, могут далее регулироваться с помощью молекулярных сигналов внутри локальной части костного мозга в его микроокружении [11]. Аномально стимулированные или старые MSCs обнаруживают предпочтение дифференцироваться в адипоциты, чем остеобласты [12,13]. Идентификация специфических молекулярных переключений, которые управляют детерминацией клонов MSC является чрезвычайно важной для создания эффективных терапевтических подходов для борьбы с аберрантным предопределением клонов, ассоциированным с аномальной регенерацией скелета и патологических остеопорозных болезней [14].

Tribbles homolog 3 (Trb3) является членом семейства tribbles pseudokinases, которые обладают критическими метаболическими функциями в разных тканях, а также выполняют важные роли в клеточной дифференцировке путем регуляции активности разных транскрипционных факторов [[15-19]]. Предыдущие исследования показали, что Trb3 играет важную роль в регуляции передачи сигналов bone morphogenetic protein (BMP) [20]. Наше недавнее исследование показало, что малая молекула лекарства, индуцирующая Trb3 стимулирует дифференцировку остеобластов, происходящих из жира стволовых клеток и формирование кости in vivo [21,22]. Кроме того, Trb3, как было установлено, осуществляет супрессию синтеза липидов путем деградации acetyl coenzyme A (скорость-ограничивающего энзима для синтеза жирных кислот) [15] и супрессии дифференцировки адипоцитов в пре-адипоцитах посредством негативной регуляции транскрипционной активности PPARг [23]. Эти наблюдения подтверждают, что Trb3 является многообещающей молекулярной мишенью для регуляции адипо-остеогенной дифференцировки MSCs. Не было исследований прямой роли Trb3 в реципрокной регуляции между остеогенной и адипогенной дифференцировкой мезенхимных клеток в контексте регенерации кости. Более того, механизмы, с помощью которых Trb3 контролирует адипо-остеогенный баланс оставались неизвестны. Было предположено, что усиление переноса гена Trb3 может способствовать детерминации в остеогенный клон, что может быть важным для улучшения репарации кости.

Каркасы из биоматериалов предоставляют разносторонние платформы для локальной и эффективной доставки гена в терапевтических подходах. Широкое разнообразие подходов по иммобилизации ген-терапевтических векторов на поверхности каркаса были разработаны, чтобы гарантировать, что векторы будут концентрироваться в областях дефектов и осуществлять долговременную экспрессию трансгена [[24-28]]. Ранее мы продемонстрировали, что PLGA каркасы с apatite покрытием (Ap-PLGA) являются предпочтительными субстратами для доставки биоактивных агентов для регенерации кости в моделях разных дефектов [[29-32]]. Однако, такой подход к доставке посредством неспецифической физической абсорбции может быть легко нарушен окружающими микроусловиями и приводить к преждевременному массовому высвобождению при низком связывающем сродстве in vivo, требуя дальнейших модификаций для усиления поверхностного связывания. Недавно, была разработана химия катехолов для иммобилизации биомолекул на поверхности каркаса более простым и эффективным способом благодаря способности фрагментов катехола соединяться с широким кругом органических или неорганических субстратов и служить в качестве линкеров между иммобилизирующими поверхностями и биомолекулами [[33-36]]. Желатин является гидролизованным коллагеном, главным структурным белком костной ткани и является привлекательным биополимером для преобразования костной ткани благодаря своим множественным соотв. свойствам, включая хорошую биосовместимость, низкую иммуногенность, клеточную адгезию и легкое застывание, (gelation) [[37-40]]. Т.о., gelatin, модифицированный с помощью catechol содержащих молекул, таких как кофейная кислота, может образовывать слой на Ap-PLGA каркасе для усиления генной доставки.

В данном исследовании мы установили, что Trb3 действует как ключевая молекула переключатель, предопределяющая детерминацию судеб MSC клонов путем регуляции программирования адипогенеза и остеогенеза. Механистические исследования далее проиллюстрировали, что Trb3 контролирует выбор клеточных судеб MSCs посредством кооперативной активации передачи сигналов BMP/Smad и Wnt/beta-catenin, двух главных сигналов, управляющих развитием скелета и формированием кости. Более того, локальная доставка Trb3 посредством создания нового геном активируемого гибридного каркаса существенно способствует регенерации кости и подавляет формирование жиром заполненных пустот кости у модельных грызунов с дефектами нижней челюсти. Эти находки предоставляют новую информацию о молекулярной регуляции детерминации клонов MSCs, и особенно о целенаправленном молекулярном переключении, контролирующем выбор между клонами адипоцитов и остеобластов.

MSCs человека (hMSCs) (Lonza, Vancouver) выращивали на human MesenCult^TM среде (STEMCELL Technologies, Vancouver). Для избыточной экспрессии Trb3, клетки были трансфицированы с помощью лентивирусных частиц, кодирующих Trb3 (Vectorbuilder, IL) или плазмид, экспрессирующих Trb3, используя lipofectamine 2000 (Invitrogen). Для нокдауна Trb3, клетки были трансфицированы с помощью Trb3 siRNA или лентивирусных частиц, содержащих shRNA, нацеленных на Trb3 (Santa Cruz Biotechnology, CA). hMSCs были получены от 4-х разных пациентов.

Чтобы исследовать эффекты Trb3 на детерминацию клонов MSC, мы использовали избыточную экспрессию экзогенного Trb3, используя лентивирусные частицы, кодирующие Trb3, мощно индуцирующие остеогенную дифференцировку hMSCs, на что указывало усиление активности ALP и минерализации, а также индукция экспрессии остеогенных генов, включая Osterix, Runx2, ALP и osteocalcin (OCN) (Fig. 1a–e). Напротив, нокдаун эндогенного Trb3 снижал способность hMSC к остеогенной дифференцировке с одновременным снижением экспрессии остеогенных генов.

Наши данные показали. что Trb3 стимулирует остеобластную дифференцировку, супрессируя в то же время адипогенную дифференцировку, указывая те самым, что Trb3 является критическим молекулярным переключателем детерминации клонов MSC. Механистически, Trb3 осуществляет свое про-остеогенное и анти-адипогенное действие посредством кооперативной активации передачи сигналов BMP/Smad и Wnt/β-catenin. Trb3 индуцировал достоверное формирование кости, сходное с нашими предыдущими находками относительно phenamil, малой молекулы BMP.

В данном исследовании мы установили, что Trb3 является ключевым молекулярным переключателем, контролирующим дифференцировку MSCs в адипоциты и остеобласты. Мы также установили, что Trb3 регулирует судьбу клонов MSC посредством стимуляции передачи сигналов BMP и Wnt. Более того, мы использовали обеспечиваемы каркасом локальный перенос Trb3, чтобы продемонстрировать практический подход для улучшения выздоровления кости у модельных грызунов с дефектом нижнечелюстной кости. Наши находки не предоставляют непосредственно новую молекулярную информацию по детерминации клонов MSC , но они являются многообещающими.