Во время развития клетки накрепко получают корректную клеточную судьбу, чтобы дать жизнеспособный взрослый организм, несмотря на внутренние молекулярные шумы и изменчивость окружения. Обычно предполагается, что подавление такой изменчивости существенно для успешного развития. Однако, стохастичность выбора клеточной судьбы, когда клетки случайно воспринимают одну клеточную судьбу из ограниченного репертуара разных судеб, является краеугольным камнем многих онтогенетических процессов (Johnston and Desplan, 2010). Напр., гетерогенная и стохастическая экспрессия генов между клетками у эмбрионов мышей на ст. 4-х клеток влияет и ограничивает их клеточные судьбы (Goolam et al., 2016). Сходным образом, фоторецепторные клетки в сетчатке человека случайно экспрессируют ген рецептора красного, зеленого или голубого света (Smallwood et al., 2002; Roorda and Williams, 1999). При таких процессах стохастических решений, даже если каждый индивидуальный исход является случайным, относительные частоты разных клеточных судеб часто тонко контролируются.

Сегодня стохастический выбор клетками судеб лучше всего понимается в контексте одноклеточных организмов, у которых шумы генной экспрессии доминируют в качестве ключевого источника изменчивости, управляющей стохастическим выбором клеточных судеб (Losick and Desplan, 2008; Balaban, 2004; Maamar et al., 2007; S?el et al., 2006). Однако, остается неясным, как стохастический выбор клетками судеб регулируется во время развития животных, т.к. многоклеточные организмы демонстрируют уникальные ограничения по сравнению с одноклеточными организмами. Здесь стохастический выбор клетками судеб, точно скоординированный со временем развития, потенциально зависит от соседних клеток и базируется на внешних, долго действующих сигналах, обеспечиваемых небольшим количеством ключевых онтогенетических сигнальных путей. Как эти канонические сигнальные пути управляют стохастическим выбором клеточных судеб под строгим контролем частот клеточных судеб, является открытым вопросом.

Даже в ходе развития C. elegans это происходит в основном неизменным способом (Sulston et al., 1983), некоторый выбор клеточных судеб происходит стохастическим способом. Одним из таких выборов является спецификация компетентной группы vulval precursor cell (VPC), начиная с ранней L2 личиночной ст. (Myers and Greenwald, 2007; Gleason et al., 2002). Эта группа состоит из 6 эпидермальных клеток, наз. P3.p-P8.p, которые впоследствии формируют паттерн разных судеб клеток вульвы с помощью множественных сигнальных путей (Gupta et al., 2012; Hill and Sternberg, 1993; D M Eisenmann et al., 1998; Felix and Anne, 2012; Sternberg and Horvitz, 1986; Gleason et al., 2002). Становление VPC группы компетенции является частично стохастическим, т.к. P3.p клетка воспринимает судьбу VPC приблизительно в 30-80% случаев у дикого типа (N2) гермафродитов в зависимости от условий внешней среды (Braendle and Felix, 2008) (Fig. 1a), тогда как оставшиеся P3.p воспринимают гиподермальную судьбу благодаря слиянию с соседней синцитиальной гиподермальной клеткой, наз. hyp7 (Gidi Shemer and Podbilewicz, 2002; Sternberg and Horvitz, 1986). Более того, тенденция клетки P3.p сливаться или нет с данной линии зависит от отличий во внешнесредовых условиях и генетического фона (Braendle and Felix, 2008; J. B. Penigault and Felix, 2011a, Penigault and Felix, 2011b).

Fig. 1. Stochastic cell fate decisions in Pn.p cells. (A) Overview of the hyp7/fusion versus vulva precursor cell fate (VPC) decision in the P(3-8).p cells. Cells assuming hyp7/fusion fate fuse (indicated by the dashed line) with the hypodermal syncytium hyp7 and lose the AJM-1 apical junction marker (green). Cell fusion requires the expression of the fusogen EFF-1 and is inhibited by the Hox protein LIN-39 and Wnt signaling through the β-catenin BAR-1. BAR-1 accumulation is induced by binding of Wnt ligands, such as CWN-1 (purple) to Wnt receptors (magenta). (B) Measured hyp7/fusion frequencies in Pn.p cells in wild-type and mutant backgrounds. All strains carried either the ajm-1::GFP or ajm-1::mCherry reporter: full genotypes and N numbers are listed in Table 1. For the lin-39(0) strain, all Pn.p cells fused prematurely in the L1 stage. (C) AJM-1 dynamics in non-fusing (top) and fusing (bottom) P3.p cells carrying a dpy-7p:mCherry marker (circled in red) that labels the P3.p nucleus. Animals are also expressing GFP in the hyp7 cell, allowing for visualization of the influx of GFP in fused P3.p cells. Cell fusion occurred 6 h 20 m after the start of L2, as shown by the appearance of GFP from the hypodermal syncytium hyp7 in the P3.p nuclear area (region enclosed by yellow line). Simultaneously, AJM-1 showed a pronounced ruffling (see white arrow), followed by its removal from the apical edge of the P3.p cell. In contrast, no such AJM-1 dynamics or removal were observed in non-fusing cells assuming VPC fate. (D) Comparing GFP inflow from the hyp7 syncytium in fusing and non-fusing cells as a function of time after the start of the L2 larval stage. Shown is the ratio of GFP fluorescence intensity between P3.p and P4.p in the same animal, where P4.p never fused. The blue and red line corresponds to the non-fusing and fusing cell in (C). Symbols correspond to the time points shown in (C). Arrow indicates the time of AJM-1 ruffling and coincides exactly with inflow of GFP into the fusing cell. (E) Individual cell fusion times and box-and-whisker plots for P3.p (green) and P4.p cells (magenta) in different genetic backgrounds. Fusion time was determined by AJM-1 dynamics and is expressed as a fraction of the L2 larval stage duration (~8-12 h for all backgrounds). Significant differences exist in average fusion time between strains, (one-way ANOVA to determine a difference between all strains, followed by Student's t-test, * indicates P < 0.05 in the Student's t-test). (F) Distribution of difference in cell fusion time between P3.p and P4.p cells, where both cells fuse (data pooled for all genotypes with double fusions).

Путь Wnt является чрезвычайно консервативным сигнальным путем, который регулирует множество онтогенетических событий и клеточных судеб (Ohyama, 2006; Hudson et al., 2013; Hirabayashi, 2004; Mucenski et al., 2003; Lindstr?m et al., 2014; Clevers and Nusse, 2012). Предыдущие исследования выбора P3.p клетой судьбы показало, что частота клеточной судьбы чрезвычайно чувствительна к дозе Wnt лигандов, особенно cwn-1, подтверждая, что вариабельность в концентрации лиганда или в реакции P3.p клетки на Wnt лиганды может предоставлять источник шума, управляющего стохастическим выбором судьбы (J. B. Penigault and Felix, 2011a; J.-B. Penigault and Felix, 2011b). В каноническом пути присутствие Wnt лигандов приводит к накоплению ко-активатора транскрипции BAR-1/β-catenin, который совместно регулирует гены мишени пути Wnt (Sawa and Korswagen, 2013; Hendrik C. Korswagen, 2002; D M Eisenmann et al., 1998; H C Korswagen et al., 2000). Помимо пути Wnt, мутации в C. elegans Hox гене lin-39 воздействуют на частоты судеб Pn.p клеток, за счет репрессии слияния клеток и способствуя делению клеток с судьбой VPC (Koh et al., 2002; Gidi Shemer and Podbilewicz, 2002; Maloof and Kenyon, 1998; Roiz et al., 2016; Clark et al., 1993). Как передача сигналов Wnt, так и LIN-39 подавляет hyp7 судьбу и слияние, при этом мутации с потерей функции обнаруживают повышенную частоту слияния клеток, включая P4.p-P8.p клетки, которые обычно никогда не воспринимают судьбу hyp7/fusion (Gleason et al., 2006; Myers and Greenwald, 2007). Однако, каковы аспекты динамики передачи сигналов Wnt и LIN-39 контролировать частоты hyp7/fusion в противовес судьбе VPC в P3.p остается неизвестным.

Здесь мы использовали новый подход к time-lapse микроскопии (Gritti et al., 2016), чтобы наблюдать экспрессию гена и динамику передачи сигналов в одиночных Pn.p клетках во время спецификации VPCs, это позволило нам непосредственно связать вариабельность во время процесса выбора конечной клеточной судьбы. Используя этот подход, мы наблюдали, что изменчивость между индивидами в отношении динамики LIN-39 и AR-1 может быть связана с выбором клеточной судьбы. В частности, было установлено, что BAR-1 накапливается в одноразово, в виде ~1-4 ч пульса в Pn.p клетках во время выбора судьбы hyp7/fusion в противовес VPC, при этом наблюдалась сильная изменчивость в крутизне и времени пульса. Используя эксперименты на мутантах в комбинации с анализом количественных данных, мы пришли к модели, где стохастическая изменчивость уровней LIN-39 и динамики BAR-1 предопределяет клеточную судьбу путем модулирования их абсолютного уровня во время клеточного слияния.

Итак, используя time-lapse микроскопию для измерения динамики в одиночной клетке двух ключевых ингибиторов клеточного слияния, Hox гена LIN-39 и передачи сигналов Wnt посредством β-catenin BAR-1, мы обнаружили достоверную вариабельность динамики уровней LIN-39 и BAR-1. Мы наблюдали, что накопление BAR-1 в виде одиночного, 1-4 ч пульса во время выбора судьбы P3.p клеткой, с сильной изменчивостью как крутизны, так и времени пульса. Мы установили, что время начала пульса BAR-1 задерживается относительно времени слияния клеток у мутантов, при этом низкая частота клеточного слияния связана со временем пульса BAR-1 при выборе клеточной судьбы. Итак, изменчивость в уровнях LIN-39 и динамики пульса BAR-1 pulse склоняет клетки к выбору судьбы путем модулирования их абсолютного уровня во время индукции клеточного слияния. Следовательно, время динамики передачи сигналов в клетке скорее, чем средний уровень или амплитуда, играет инструктивную роль в детерминации судьбы клетки.