Электропортация, как простой не вирусный способ доставки генов, широко используется для биомедицинских исследований¹. потенциал его использования in vivo, включая регенеративную медицину², adoptive иммунотерапию^3,4 и редактирование генов⁵, стал использоваться недавно. По сравнению с др. физическими методами (напр., микроинъекции, sonoporation и optoporation), электропортацию легче осуществить и можно контролировать на уровне одиночных клеток, поскольку липидный бислой клеточных мембран чувствителен к внеклеточным электрическим полям^6,7. С помощью обычного устройства электропортации, несколько электродов (которые во много тысяч раз крупнее нормальных клеток) помещаются в камеру, где высокое напряжение тока (100 V или выше) воздействует на большое количество клеток⁸. Ожидаемые неудобства использования такого устройства включают невосстановимые повреждения клеток и недостаточную эффективность доставки. Результаты доставки субстанций, которые могут быть очень изменчивыми для разных типов клеток, типов грузов и буфферных растворов, могут быть в основном предсказаны перед экспериментами^9,10.

Для решения этих вопросов разработана платформа 3D single-cell electroporation (3D EP)^11-15. Ключевым компонентом таких платформ является пленка, содержащая минипоры или нанопоры. Электрическое поле, пропускаемое через пленку, может воздействовать на клетки, которые прилегают к порам. С помощью позиционирования клеток внутри микро-масштабных структур, сила электрического тока, воздействующая на клеточные мембраны, может быть увеличена на несколько порядков величин по сравнению с коммерческими устройствами для электропортации¹⁶. При напряжении ниже 1 V, проницаемость клеточных мембран делает возможной доставку груза в пределах ограниченной площадки, в то же время будет ограничивать риск повреждений клеток^6,17. Кроме того, это легко адаптирует системы электропортации на lab-chip для использования в разных аппликациях, в пределах от молекулярных характеристик (напр., межклеточные взаимодействия и клеточная гетерогенность) до манипуляций с экспрессией генов (напр., трансфекция плазмидной ДНК, siRNA и miRNA)^17-22.

С помощью 3D EP устройств, ключевым фактором для достижения высокой эффективности доставки является расположение пор на клетке, которое предопределяет будет ли электрическое поле в точности и целенаправленно воздействовать на клетку⁶. Следовательно, манипуляции с клетками играют важную роль при использовании платформ on-chip электропортации. Недавно мембраны с track-etched порами были использованы в качестве передаточной субстанции для электропортации для трансфекции и взятия проб клеток^13,14,23. Однако, случайное распределение пор по мембране привело к затруднениям контроля за расположением клеток, за расположением клеточных пор и соотношением пор и клеток. Следовательно, изменения в методе засевания клеток или в манипуляциях с ними не могут существенно улучшить эффективность трансфекции на track-etched мембранах. Исследователи, в том числе и мы, разработали различные on-chip техники манипуляций для усиления 3D EP, включая magnetic tweezers (MTs), dielectrophoresis (DEP) и микрожидкости ^11,13,24-26. Однако, инструментальная техника (напр., MTs и DEP) обычно вызывают необратимые клеточные повреждения, обусловленные термальными изменениями, изменениями pH и др. изменениями в микроокружении ^27,28. Кроме того, изготовление микрожидкостей на 3D пористых мембранах, как части простых в употреблении биомедицинских устройств, остается затруднительным.

В данной работе описан набор pyramid pit микропор для использующей вакум 3D EP платформы. Легкий для исполнения протокол микро-обработки базировался на методе жидкостного травления (wet etching) , созданного для продукции высоко упорядоченных наборов 3D микропор. Чтобы достичь высокой эффективности доставки, мы разработали контролируемое вакуумное устройство, чтобы задействовать на каждой одиночной клетке каждую микропору. Мы проанализировали многие факторы, включая и диаметр микропор, негативное давление и свойства поверхности чипа, которые влияют на эффективность захвата клетками и индуцируемые вакуумом клеточные повреждения. Мы также тестировали разные воздействия на поверхность чипа, чтобы облегчить клеткам захват (trapping).

Используя нашу платформу, грузы в пределах молекулярного веса, от молекулярных бакенов (MBs, 22-bp олигонуклеотиды) до плазмидных ДНК (более 9 kb), успешно доставлялись в клетки мишени. Клеточное подавление эффективности малых молекул химио-лекарств (напр., dacarbazine) было достоверно выше, чем таковое при прямом воздействии химио-лекарств и лекарств, энкапсулированных с помощью Lipofectamine. Доза химио-лекарства, доставляемого в клетки может также контролироваться с помощью тонкого контроля прилагаемого напряжения к клеткам. Более того, CRISPR-Cas9 система эффективно вызывает нокаут генов p62 и CXCR7, это приводит в результате к эффективному подавлению роста опухолевых клеток. По сравнению с ранее описанными микро-поровыми устройствами, включая коммерческие track-etched мембраны^14,15,29 и силиконовые чипы^6,11,20, наборы высоко упорядоченных pyramid pit микропор на силиконовых сипах легко продуцировать, используя простой cleanroom протокол. Кроме того, pyramid pit микропоры позволяют каждой одиночной клетке находится в изолированном микроокружении, необходимом для электротрансфекции при низком напряжении. В целом наша платформа позволяет осуществлять простую эффективную и высоко-производительную доставку макромолекул и малых молекул в живые клетки без вмешательства с их жизнеспособность, это позволяет осуществлять on-chip манипуляции, in situ внутриклеточные interrogation и терапию рака.

Fig. 1: Use of the vacuum-assisted micropore array for multiplexed single-cell patterning. a A cross-sectional view of the 3D low-voltage electroporation (3D EP) platform setup.b A diagram of the pyramid pit-shaped micropore array chip. The zoomed-in view showed a single cell loaded on a micropore. c Photograph of the 3D EP platform. Scale bar: 1 cm. d Scanning electron microscopy showed both a pyramid pit array (top side) and a micropore array (back side). Scale bar: left 100 µm, right 20µm. e Vacuum-assisted multiplexed single-cell array pattern on the chip. Scale bar: 100 µm. f The cell capture rate obtained with different ratios of the loaded cell number to the micropore number at a fixed pressure (1.5 psi). g 3D single-cell fluorescence model, as revealed by confocal microscopy, showing the percentage of the cell body inside the micropore (5 µm) after cell trapping. Scale bar: 10 µm.

Мы продемонстрировали работу системы редактирования генов и подавления опухолей путем трансфекции CRISPR-Cas9 плазмид. Две CRISPR-Cas9 плазмиды непосредственно доставлялись в A375 клетки с нокаутом генов p62 и хемокинового рецептора CXCR7. Эти два гена, как было установлено, способствуют пролиферации клеток во время развития опухоли^43,44. Продукты PCR (polymerase chain reaction) геномной ДНК из трансфицированных клеток были секвенированы. Результаты обширного секвенирования показали, что сайты генов p62 и CXCR7 были успешно отредактированы (Fig. 4d, e). Определяли количества белков p62 и CXCR7 с помощью Western blot (Fig. 4f). Как и ожидалось нокаутные клетки четко экспрессировали более низкие уровни белков мишеней по сравнению с контрольными клетками. Чтобы проверить, действительно ли потеря генов будет влиять на рост раковых клеток, мы отслеживали клетки с помощью electrical impedance-based xCELLigence RTCA системы, которая позволяет долговременную и в реальном времени запись пролиферации живых клеток не инвазивным способом^45,46. Дефицит или p62, или CXCR7 достоверно снижал пролиферацию клеток во время непрерывного отслеживания в течение 80 ч (Fig. 4g, h). Метод образования колоний также подтвердил снижение роста клеток без p62 или CXCR7 (Fig. 4i). Эти результаты демонстрируют, что наша система делает возможным эффективное редактирование генов и терапию опухолей с помощью прямой доставки CRISPR-Cas9

Fig. 4: a and b The 3D EP system achieved high-throughput gene transfection by delivering macromolecular CRISPR-Cas9 plasmids (>9 kb) into melanoma cells, offering a significantly higher efficiency than commercial BEP. Scale bar: 100-µ m. c The transfection efficiency of CRISPR-Cas9 plasmids by 3D EP or BEP. **p-value < 0.01. d and e Sequencing results for the p62 and CXCR7 genes from CRISPR-Cas9 knockout cells transfected by using the 3D EP system. f Western blotting of p62 protein andCXCR7 protein from A375 cells in the knockout and control groups transfected by using the 3D EP chip. β-actin was used as a loading control. g and h Cell proliferation assay with the xCELLigence RTCA system. A total of 5 x10³ cells were seeded in each well of an RTCA system plate followed by continuous real-time monitoring for 80?h. *p-value < 0.05. i Colony formation of A375 cells with or without gene knockout. Representative dishes from at least three replicate experiments stained by Giemsa stain were shown.

Итак, электропортация широко используется для трансфекции генов и доставки лекарств. Однако, в последнее время выявлены определенные ограничения использования как in vitro, так и in vivo, особенно если груз большого молекулярного веса. С др. стороны, обычная система электропортации обнаруживает ограниченный контроль за эффективностью трансфекции, жизнеспособностью и униформностью клеток на уровне одиночных клеток. Мы разработали платформу с 3D расположением микропор для формирования мультиплексного паттерна одиночных клеток и электропортации под низким напряжением. Мы создали базирующийся на силиконе чип с пирамидальными ямками микропор, используя простой wet-etching протокол. Форма пирамидальных ямок делает возможными культуральное окружение одиночных клеток, в результате чего достигается in situ трансфекция одиночных клеток и становятся возможными исследования экспрессии в них генов. Разарботан простой , но быстрый способ достижения вакуума, чтобы отслеживать клетки на микропорах. Мы осуществили оптимизацию trapping, принимая во внимание некоторые критические факторы, включая диаметр микропор, уровень негативного давления и свойства поверхности чипа. Разные грузы были отобраны, чтобы продемонстрировать результаты доставки и трансфекции для 3D платформы электропортации. Устройства продемонстрировали существенно более высокие униформность, эффективность доставки жизнеспособности клеток, чем коммерческие системы электропортации. Кроме того, мы наблюдали, что устройства предлагают метод прямых инъекций и контроля дозы для доставки химических лекарств (dacarbazine) в раковые клетки (melanoma), они продуцируют значительно более высокое подавление раковых опухолей, чем Lipofectamine. Наконец, устройство демонстрирует высокую эффективность в трансфекции CRISPR-Cas9 плазмид (более 9 kb) и эффективное подавление опухолей с помощью CRISPR-Cas9-индуцируемого редактирования генов. В целом 3D электропортация является высокопроизводительным, униформным и безопасным не вирусным устройством для доставки in vitro. Система позволяет расширить пригодность электропортации в живые клетки экспрессируемых генов, лечения рака химическими лекарствами и с помощью редактирования генов.