Эпигенетика - это исследование наследственных изменений в экспрессии генов, происходящих без изменения подлежащих последовательностей ДНК^1,2,3. Эпигенетические изменения могут быть вызваны возрастом, болезненным состоянием и внешне-средовыми условиями^4,5. Метилирование ДНК, модификации гистонов и связанное с не кодирующими РНК замалчивание генов выступают в качестве основных эпигенетических механизмов^6,7. Метилирование ДНК происходит за счет добавления метильных (CH₃) групп на 5-carbon цитозинового кольца ДНК, тем самым часто регулируется экспрессия генов^8,9,10. Метилирование ДНК является важным для многочисленных клеточных процессов, включая геномный импринтинг, инактивацию Х хромосомы, стабилизацию хромосом и репрессию мобильных элементов, старение и канцерогенез^11,12,13. Исследования эпигенеза выявили четкие ценные доказательства метилирования ДНК, но дальнейшие исследования всё ещё необходимы в этой области.

Согласно предыдущим сообщениям, метилирование ДНК обычно обнаруживается в цитозине из CpG динуклеотидных сайтов в ДНК после репликации и особенно распространено в регионах промоторов генов^14,15. Метилирование в регионе промоторов генов предупреждает присоединение РНК полимераз и/или др. транскрипционных факторов к региону промотора, тем самым подавляя транскрипцию ДНК¹⁶. Следовательно, возможно вызвать экспрессию гена путем деметилирования метилированных CpG сайтов внутри региона промотора. Разумно предположить, что сильно метилированный и крепко репрессированный ген может стать хорошей мишенью для сайт-специфического деметилирования регулирующей системой, что может помочь в понимании роли метилирования ДНК. Чтобы деметилировать CpG сайты, наиболее широко используется метод инактивации methyltransferase функции ДНК, используя ингибиторы, включая 5-azacytridine (azacitidine) и 5-aza-2-deoxycytidne (decitabine)^17,18. Однако, такие методы не являются ген-специфичными, приводят усредненному эффекту и тем самым к сглаженному эффекту деметилирования для всех генов.

Недавно исследователи успешно разработали эффективные эпигенетические инструменты для преобразования с использованием системы CRISPR/Cas9^19,20,21. ДНК мишень, которая соответствует специфической guide RNA (gRNA), несущей Cas9, базируется на комплементарности, разрезается, давая разрывы двойной нити ДНК (DSB)¹⁹. DSB могут быть репарированы с помощью non-homologous end joining (NHEJ)²², приводя к инсерциям и/или делециям (indels), которые разрушают трансляционную рамку считывания кодирующей последовательности. Напротив, если экзогенная ДНК, 'донорская матрица', гомологичная локусу мишени, добавляется то DSB может быть репарирован с помощью homology-directed repair (HDR) пути, позволяющего вносить необходимую последовательность^23,24.

Чтобы использовать CRISPR/Cas9 систему в эпигенетических исследованиях, мы разработали две стратегии, чтобы регулировать деметилирование промотора Oct4 и индуцировать экспрессию гена Oct4 в дифференцированных клетках. Oct4 экспрессируется только в стволовых клетках и , как известно, ответственен за самообновление и поддержание плюрипотентного состояния стволовых клеток^25,26. Тогда как гипометилированная область промотора гена Oct4 в стволовых клетках связана сего экспрессией, состояние гипометилирования в дифференцированных клетках приводит к полной строгой изоляции Oct4^27,28.

Во-первых, мы преобразовали клетки генетически, те в которых CpG динуклеотиды промоторного региона были изменены в не-метилированные динуклеотиды с помощью CRISPR/Cas9-обеспечиваемой knock-in стратегии. Во-вторых, чтобы избежать неизвестных побочных эффектов, вызываемых мутантными последовательностями в промоторе, мы использовали базирующуюся на CRISPR/dCas9 систему деметилирования²⁹ и предприняли попытку улучшить эту систему путем индукции ремоделирования хроматина. С этой целью мы использовали каталитически инактивированную dCas9, слитую с каталитическим доменом Ten-Eleven Translocation dioxygenase 1 (Tet1), который катализирует превращение 5-methylcytosine (5-mC) в 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC)^30,31. Мы изучали эффекты избирательного деметилирования с использованием этой dCas9-Tet1 системы, нацеленной на метилирование CpG сайтов промотора Oct4 вместе с синергическими эффектами измененных гистоновых модификаций и метилирования ДНК .

Мы продемонстрировали пригодность CRISPR/Cas9 для моделирования метилирования специфических CpG сайтов и индукции экспрессии генов. Мы целенаправленно воздействовали на ген Oct4 мыши, который транскрипционно неактивен из-за гиперметилирования промоторного региона в клетках NIH3T3. Чтобы индуцировать сайт-специфическое деметилирование промоторного региона Oct4 и экспрессию этого гена, мы использовали CRISPR/Cas9 knock-in и CRISPR/dCas9-Tet1 системы. Используя эти два подхода, мы индуцировали сайт-специфическое деметилирование промотора Oct4 и подтвердили активацию экспрессии Oct4. Более того, мы подтвердили, что синергичный эффект деметилирования ДНК и др. эпигенетические эффекты существенно увеличивают экспрессию Oct4. Мы полагаем, что подтвержденные методы эпигенетического редактирования, смогут избирательно модулировать эпигенетические факторы, такие как метилирование ДНК.

Несмотря на многочисленные исследования оказалось затруднительным модифицировать избирательно метилирование ДНК. При обычных методах деметилирования некоторые ингибиторы DNMTs были широко использованы, но они оказались непригодны для модулирования специфических генов.

Недавнее появление технологий редактирования геномов подобных CRISPR/Cas9 облегчило избирательное целенаправленное воздействие на специфические геномные локусы, используя гид РНК. Согласно предыдущим исследованиям CRISPR/Cas9-индуцированный HDR-обеспечиваемый knock-in способен редактировать специфические последовательности ДНК in vitro и in vivo^39,40. Кроме того, dCas9 и разные слитые sgRNA/dCas9 с модуляторами транскрипции были использованы для регуляции экспрессии генов желательных локусов без индукции альтераций в геноме^41,42,43. Недавно было описано, что человеческие соматические клетки можно репрограммировать в iPSCs с помощью одновременного целенаправленного воздействия на разные эндогенные гены, используя инструменты CRISPR активации (CRISPRa)⁴⁴. Мы индуцировали сайт-специфическое деметилирование региона промотора Oct4 и индуцировали экспрессию гена Oct4.

Используя bisulfite секвенирование, мы выявили состояние метилирования CpG в промоторе гена Oct4 в дифференцированных NIH3T3 клетках. Подтверждено сходство с предыдущими сообщениями, что большинство CpG островков гиперметилировано, особенно 4 CpG сайта в CR1 вблизи точки старта транскрипции. Мы редактировали область промотора Oct4 с помощью HDR-обеспечиваемой коррекции генов, предупреждая тем самым метилирование редактируемого региона. Мы создали bioengineered линии клеток, в которых CpG динуклеотиды промоторного региона были заменены на др. динуклеотиды. Как результат, наблюдалась экспрессия Oct4во всех преобразованных NIH3T3 клетках, которая была повышена по сравнению с клетками NIH3T3 дикого типа. В частности, повышение экспрессии Oct4 было наивысшим в клетках, которые имели CpG динуклеотиды, измененные во всем промоторном регионе, включая и CR1 область.

Исследования транскрипционного фактора CR1 региона в промоторе Oct4 хорошо известны^45,46. Согласно им транскрипционные факторы, соединяющийся с CR1 следующие: предполагаемый Sp1/Sp3 binding site (-115/-106), steroidogenic factor 1 (SF1 или Nr5a1), соединяющийся с сайтами b (-101/-70), 1A-like site (-77/-70) и hormone-responsive element (HRE) site (-108/-103, -101/-96 и -95/-90). К сожалению, наши замены последовательностей не попадали на эти сайты. Тем не менее мы не можем исключить возможность существование какого-либо потенциального транскрипционного фактора, соединяющегося с исследуемым сайтом связывания. Вот почему мы расширили наш подход использованием вторичной стратегии использования системы dCas9-Tet1. Ранее было установлено, что система dCas9-Tet1 индуцирует сайт-специфическое деметилирование^47,48,49. Поэтому мы использовали dCas9-Tet1 модуль для целенаправленного воздействия на промотор Oct4 без каких-либо альтераций последовательности ДНК и индукции избирательного деметилирования. Однако, эффекты деметилирования с использованием dCas9-Tet1 системы были временными и незначительными. Мы попытались индуцировать сайт-специфическое деметилирование, используя разные типы guide RNAs, но не было получено важных результатов. Каждый эффект деметилирования был отличным, а эффекты сайт-специфического деметилирования не могли быть определены. Разные эффекты от каждой системы sgRNA/dCas9-Tet1 могут быть обусловлены не только сложностью нуклеотид-хроматин трехмерной структуры, но и также распределением различных transcriptosomes. Кроме того, несмотря на становление стабильных клеточных линий, экспрессирующих sgRNA1/dCas9-Tet1, имеется незначительный эффект на экспрессию Oct4. Деметилирование, которое мы вызывали, не может быть обязательным и достаточным состоянием для экспрессии Oct4. Однако, когда sgRNA1/dCas9-Tet1 экспрессируется в NIH3T3 клетках совместно с ингибиторами гистоновой deacetylase и гистоновой methyltransferase, то экспрессия гена Oct4 будет обнаруживать заметную индукцию. Показано, что деметилирование ДНК и модификации гистонов действуют синергично, влияя на экспрессию Oct4. Некоторые предыдущие исследования были сфокусированы на эффектах метилирования ДНК в отношении репрессии экспрессии Oct4^50,51, но базируясь на наших результатах, экспрессия Oct4 тонко регулируется не только метилированием, но и также модификациями гистонов на промоторе. Кроме того, общепринято, что экспрессия Oct4 индуцируется с помощью комплементарного действия модификаций гестонов и метилирования, поскольку основные транскрипционные факторы, рекрутируемые на промотор Oct4, как известно, участвуют в модификациях гистонов⁴⁶.

Итак, мы предложили методы регуляции избирательным метилированием ДНК с использованием системы CRISPR/Cas9 и успешно индуцировали экспрессию гена. Однако, мы столкнулись с несколькими проблемами в отношении использования HDR-обеспечиваемой стратегии коррекции генов; одна из них это низкая эффективность KI (интеграции?), а другая частичность HDR. Имеются и более общие проблемы в KI стратегии с использованием системы CRISPR и поэтому дополнительно к методу, который макисимизирует эффективность KI, создан донор, который учитывая частичность HDR д. действовать конкурентно. Мы полагаем, что стратегия HDR-обеспечиваемой коррекции генов пригодна для индукции сайт-специфических мутаций в том же или соседнем сайте. Преодоление этих ограничений расширит использование HDR-обеспечиваемой коррекции генов, в частности, при ex vivo генотерапии. Хотя методы, контролирующие метилирование ДНК с использованием dCas9-Tet1 уже существуют, мы полагаем, что добавление др. эпигенетических модификаторов может в дальнейшем повысить эффективность этой системы. Нелегко идентифицировать точную точку действия dCas9-эпигенетического модулятора из-за третичной структуры нуклеосом, поскольку хроматин очень сложен и динамичен в зависимости от клеточных событий. Следовательно, корреляция между эпигенетическими факторами, также как и анализ точной структуры nucleosome-chromatin будут осуществлены. Методы регуляции метилирования ДНК в дальнейшем будут использоваться широко в разных областях.