Межклеточные слияния индивидуальных клеток генерируют синцитиальную ткань и являются критическими для развития органов, таких как плацента, кости и скелетные мышцы (Aguilar et al., 2013). Т.к. это генетически запрограммированный процесс, то межкленточне слияния осуществляются в три последовательные стадии: 1) компетентрость к клеточной дифференцировке и слиянию, 2) клеточное распознавание и слипание, которые предопределяют слияние клеток, и 3) дестабилизация липидов и мембран сливающихся клеток, приводящие к слиянию (Aguilar et al., 2013; Kim et al., 2015). Каждый процесс использует ключевые регуляторы для перехода к сл. фазе слияния. Каждая из этих стадий наблюдается во время развития скелетеных мышц (Kim et al., 2015), генерирующие синцитиальную ткань во время развития скелетных мышц, роста и регенерации (Goh и Millay, 2017; Millay et al., 2014, 2013; White et al., 2010). Хотя известны многие молекулы, регулирующие слияния мышечных клеток, остается неясным, как меняется слияние мышечных клеток по зоду развития.

Слияние миобластов у Drosophilaхолрошо охарактеризовано и используются два транскрипционно отличающиеся типа миобластов: founder cells (FCs) и fusion-competent myoblasts (FCMs) (Abmayr и Pavlath, 2012; Kim et al., 2015; Rochlin et al., 2010). Процесс асимметричного слияния нуждается в млекулах клеточной адгезии, обеспечивающих распознавание и адгезию, актиновым цитоскелетом направляемых FCM выпячиваниях в FCs, и в дестабилизаци мембран, позволяющих слияние клеток (Kim et al., 2015; Ruiz-Gуmez et al., 2000). Асимметрия FC поддерживается с помощью эндоцитотического рециклинга мембранных белков FCM, при этом Sticks и Stones, делают возможными события множественных слияний (Haralalka et al., 2014). Т.о., асимметрические межклеточные взаимодействия приводят к слияниям мышц плодовых мушек.

Несколько законсервированных у Drosophila генов слияния участвуют в мышечных слияниях и у позвоночных (Baas et al., 2012; Moore et al., 2007; Pajcini et al., 2008; Sampath et al., 2018; Sohn et al., 2009; Srinivas et al., 2007; Tamir-Livne et al., 2017). Мышечные слияния у позвоночных также нуждаются в некоторых генах, не обнаруженных у мух (Bi et al., 2017; Landemaine et al., 2014; Powell и Wright, 2011; Quinn et al., 2017; Zhang et al., 2017). Напр., ген позвоночных Myomaker (Mymk) является специфичным для мышц многократно пронизывающи м мембрану белком, необходимым для слияний в скелетных мышцах мышей, кур и рыбок данио (Di Gioia et al., 2017; Landemaine et al., 2014; Luo et al., 2015; Millay et al., 2013; Zhang и Roy, 2017). Если он экспрессируется в не мышечных клетках, таких как фибробласты, то Mymk может облегчать слияния их с миобластами (Millay et al., 2013), а избыточная экспрессия Mymk вызывает избыточные слияния, указывая на то, что он достаточен для индукции слияний в скелетных мышцах (Millay et al., 2013; Zhang и Roy, 2017). Недавнее сообщение показало, что Mymk инициирует слияния мембран, облегчая смешивание между листками наружных клеточных, в процессе hemifusion (Leikina et al., 2018). После того как Mymk инициирует полу-слияние, др. ген слияния, наз. Myomerger, Minion или Myomixer, генерирует поры слияний, действующие в транс-положении относительно Mymk, приводя к слиянию (Bi et al., 2017; Leikina et al., 2018; Quinn et al., 2017; Shi et al., 2017; Zhang et al., 2017). Остается неясным, как мембраны изменяются после образования пор и действительно ли эти механизмы слияния действуют во время разных фаз миогенеза.

Слияние скелетных мышц вносит вклад не только в формирование эмбриональных мышц, но и также в рост и регенерацию мышц (Goh и Millay, 2017; Millay et al., 2014). Мышечный рост обычно рассматривается или как зависимое от слияние добавление новых волокон (гиперлазия) или рост уже существующих волокон (гипертрофия). У эмрионов млекопитающих обе модели вносят вклад в мышечный рост, но добавление волокон вскоре прекращается после рождения и после этого возникает только при экспансии существующих мышечных волокон (Fiorotto, 2012; Matsakas et al., 2010; White et al., 2010). В раннем постнатальном развитии, мышечные волокна млекопитающих растут за счет увеличения объема миофибрилл, поддерживаемого каждым ядром (мионуклеарный домен) и за счет зависимого от слияний добавления новых ядер (Mantilla et al., 2008; White et al., 2010). После третьей недели постнатального развития мышцы продолжают расти и у взрослых за счет увеличения размера мионуклепрного домена без добавления новых ядер (White et al., 2010). У взрослых мышей, стволовыми клетками обеспечиваемое мышечное слияние, происходит только после повреждений мышц или интенсивных упражнений. Mymk временно экспрессируется в предшественниках мышц во время зависимого от слияний роста мышц (Goh и Millay, 2017) и необходим во время мышечного роста и регенерации после повреждения (Goh и Millay, 2017; Millay et al., 2014). Поскольку Mymk важен для зависимых от слияний процессов в эмбриональных и взрослых мышцах (Di Gioia et al., 2017; Goh и Millay, 2017; Landemaine et al., 2014; Millay et al., 2013; Shi et al., 2018; Zhang и Roy, 2017), мы использовали мутантных по mymk рыбок данио, чтобы исследовать, как слияние влияет на развитие, рост и регенерацию скелетных мышц.

У эмбрионов рыбок данио только предшественники быстро сокращающихся мышц сливаются и слияние быстрых мышечных клеток координируется с морфогенезом медленно сокращающихся волокон(Cortйs et al., 2003; Devoto et al., 1996; Henry и Amacher, 2004; Roy et al., 2001; Snow et al., 2008). Быстро сокращающиеся и медленно сокращающиеся волокна (далее, "быстрые волокна" и "медленные волокна") не смешиваются, а оказываются пространственно разделены (Devoto et al., 1996; Roy et al., 2001). Качественные особенности медленных мышц специфицируются в медиально расположенные клетки, которые затем мигрируют латерально посредством предшественников быстрых мышц (Cortйs et al., 2003; Devoto et al., 1996; Henry и Amacher, 2004). После миграции медленные волокна представляют собой тонкий слой из поверхностно расположенных мышц, которые лежат поверх значительно более крупных масс быстрых мышц (Devoto et al., 1996). Эта миграция, как полагают, запускает морфогенез быстрых мышц, включая слияние миобластов (Cortйs et al., 2003; Devoto et al., 1996; Henry и Amacher, 2004; Roy et al., 2001; Snow et al., 2008). Слияния выглядят симметричными у эмбрионов рыбок данио, поскольку, как было установлено, fusogens экспрессируются униформно в предшественниках быстрых мышц и поскольку эксперименты с мозаиками с использованием дефицитных по слиянию клеток продемонстрировали, что любой миобласт быстрого типа может инициировать слияние (Powell и Wright, 2012). Гетерофильное взаимодействие между специфичными для позвоночных соединительными адгезивными молекулами Jam2a и Jam3b необходимо для слияния миобластов рыбок данио (Powell и Wright, 2011), хотя ортологи у млекопитающих, Jam2 и Jam3, не нужны для мышечных слияний на изученных стадиях развития (Arcangeli et al., 2014; Gliki et al., 2004; Powell и Wright, 2011). Когда слияние эмбриональных мышц блокировано, как у мутантов рыбок данио jam2a и jam3b (Powell и Wright, 2011; Sawamiphak et al., 2017; Zhang и Roy, 2016), и mymk мутантов (Shi et al., 2018), мышечные предшественники формируют функциональные моноядерные мышечные волокна. Мышцы рыбок данио подвергаются постоянному зависимому от слияний гипертрофическому и гиперплазическому росту во время эмбриональной и взрослой стадий (Barresi et al., 2001; Gurevich et al., 2015; Nguyen et al., 2017; Patterson et al., 2008; Roy et al., 2017). Фазы постэмбрионального роста, как полагают, используют Pax7-позитивные похожие на сателлитные клетки, которые также используются вовремя регенерации мышц (Berberoglu et al., 2017; Gurevich et al., 2016; Nguyen et al., 2017; Pipalia et al., 2016; Seger et al., 2011). Однако, мало известно о механизмах слияния у рыбок данио на ст. личинки и у взрослых.

В данном исследовании мы охарактеризовали мышечные слияния у рыбок данио на разных ст. развития. Используя наблюдения вживую мы визуализовали межклеточные слияния у эмбрионов рыбок данио, наблюдая разрывы мембран и рассеянные события, продуцирующие многоядерные миофибриллы. Мы исследовали генетические потребности для слияния волокон и установили, что mymkнеобходим в ходе всего развития, jam2a важен только в ходе первой недели развития. В то время, когда мышечные волокна становятся многоядерными у мутантов jam2a на второй неделе развития, то они обнаруживают меньше ядер, чем у взрослых дикого типа, подтверждая, что jam2a играет ничтожную роль в слияниях на поздних стадиях. У взрослых jam2a волокна с уменьшенными количествами ядер и моноядерные mymk мутантные волокна у взрослых также имеют общий объем волокна на ядро очень схожий с таковым в волокнах дикого типа, подтверждая, что моноядерный домен устанавливается независимо от способности к слиянию. Даже если mymk необходим для слияния на всех ст. развития, экспрессия mymk становится более ограниченной поздней личиной стадией, что согласуется с идеей, что слияния клеток по иному регулируются во время развития. Неожиданно мы установили, что медленные волокна, которые строго моноядерные на эмбриональной стадии, становятся многоядерными на поздней личиночной ст. и что этот процесс зависит от mymk. Наконец, маркеры пролиферации и регенерации экспрессируются в mymk мутантных мышцах взрослых, демонстрируя, что регенеративные пути активированы. Наши находки показали, что механизмы слияния изменяются после эмбриональной стадии и указывают на то, что рост и поддержание скелетных мышц нуждаются в слияниях в скелетных мышцах.

Наши находки показывают, что механизмы мышечных слияний отличаются на эмбриональной и позней личиночной стадии. У эмбрионов как jam2a так и mymk существенны для мышечных слияний, сливаются только быстрые миобласты , а mymk экспрессируется по всему домену быстрых мышц сомитов (Fig. 9A-C), это согласуется с предыдущими сообщениями (Cortйs et al., 2003; Devoto et al., 1996; Di Gioia et al., 2017; Landemaine et al., 2014; Powell и Wright, 2011; Shi et al., 2018; Si et al., 2019; Zhang и Roy, 2017). Мы установили, что миофибриллы рыбок данио на всех исследованных стадиях пропорциональны по масштабу объема количеству ядер, независимо от способности к слиянию, это указывает на то, что размер мионуклеарного домена не зависит от слияния. Наши эксперименты по наблюдению вживую предоставили новую информацию о слиянии у эмбрионов путем дальнейшего выяснения, как динамика движений медленных и быстрых мышечных клеток влияет на слияния и показали, что мышечные мембраны интернализуются в месте слияния (Fig. 9 B). На поздних личиночных стадиях, мы установили, что когда мышцы становятся многоядерными,то jam2a больше не нужен для слияния быстрых мышц и экспрессия mymk существенно ограничивается (Fig. 9D-F).



Fig. 9. Muscle fusion mechanisms are developmentally regulated. Model describing developmentally-regulated muscle fusion in zebrafish. (A) Diagram of cell positions in a newly formed somite, viewed from dorsal, showing anterior border cells (ABCs; purple), fast myoblasts (green), и an elongated slow muscle cell (blue). (B) Cell dynamics during embryonic cell fusion. (B1, B2) As a slow muscle cell moves laterally, ABCs also shift position и are replaced at the anterior border by fast myoblasts. (B3-B5) Fast myoblasts then sequentially fuse toward the posterior somite border. (C) Diagram of a somite after slow muscle cell migration. At this stage, slow muscle cells are mononucleate и fast muscle cells are multinucleate. After shifting position, ABCs are called the external cell layer (ECL) in some studies и dermomyotome (DMM) in others. See reviews for further details on embryonic muscle development in zebrafish (Goody et al., 2017; Jackson и Ingham, 2013; Li et al., 2017; Sampath et al., 2018; Stellabotte и Devoto, 2007). (D) Muscle arrangement in late larval stages, prior to slow muscle fusion. By this stage there are three fiber types: fast (green), intermediate (int., grey), и slow (blue), и the slow muscle region is enriched for satellite-like cells (SLCs, purple) (Berberoglu et al., 2017). (E) In late-larval stages, we hypothesize that SLCs produce mymk-positive muscle progenitors (orange). These progenitors could potentially fuse into both fast и slow muscle fibers (orange arrowheads), resulting in the addition of new myonuclei (black arrowheads). (F) By late-larval stages, all muscle fiber types are multinucleate.

Мутанты mymk^oz17 обнаруживают драматическое снижение количества ядер, что согласуется с предыдущими находками у рыб и мышей (Di Gioia et al., 2017; Landemaine et al., 2014; Millay et al., 2016, 2014; 2013; Zhang и Roy, 2017). Наше исследование также выявило, что личиночные быстрые миофибриллы и взрослые медленные миофибриллы оказываются случайно двуядерными у mymk^oz17 мутантов. Мы не наблюдали двуядерные клетки быстрых волокон у взрослых mymk^oz17 мутантов, или потому, что они отсутствуют или потому, что размер выборки недостаточно велик, чтобы обнаруживать редкие события. За исключением редких многоядерных волокон описанный нами фенотип mymk^oz17 согласуется с фенотипами двух недавно опубликованных аллелей со сдвигом рамки считывания (Di Gioia et al., 2017; Shi et al., 2018) и потенциально более строгий, чем фенотипы делеционного аллеля, mymk^sq36, которые нормально павали в один месяц (Zhang и Roy, 2017). Мы полагаем, что умеренные фенотипы mymk^sq36 мутантов могут быть обусловлены присутствием генов модификаторов слияния. Поскольку аллель со сдвигом рамки считывания возможно кодирует неоморфный или доминантно-негативный белок, мы установили, что это объяснение неправдоподобно по ряду причин. Во-первых, наши находки у рыбок данио согласуются с результатми исследований на мышах, показавших, что Mymk является ключом для слияния и роста мышц взрослых (Goh и Millay, 2017; Millay et al., 2014). Во-вторых, мы не обнаружили каких-либо a фенотипических отклонений у mymk^oz17 гетерозигот. В-третьих, мы не выявили каких-либо mymk транскриптов у mymk^oz17 мутантных эмбрионов, это подтверждает, что мутантные транскрипты быстро деградируют с помощью nonsense-обусловленного распада. В-четвертых, маловероятно, что трансляция функционального белка будут начинаться с 3' к повреждению mymk^oz17 , поскольку несколько трансмембранных Mymk доменов кодируются с помощью последовательностей 5' к этой мутации. Итак, эти находки указывают, что повреждения mymk^oz17 вызывают строгую потерю функции гена. Мы предлагаем два альтернативных объяснения для редких многоядерных миофибрилл у mymk^oz17. Генетическая компенсация за счет др. генов слияния может в принципе оказаться возможной для mymk-независимого слияния. Альтернативно, ядра миофибрилл рыбок данио могут случайно делиться внутри миофибриллы с очень низкой скоростью, чтобы это можно было обнаружить. В др. работе (Sawamiphak et al., 2017) попытались проверить, действительно ли эти редкие mymk^oz17 миофибриллы возникают зависимо от слияния или с помощью независимого процессов.

Недавно был получены варианты гена, которые снижает у человека функцию MYMK , чтобы вызвать синдром Carey-Fineman-Ziter, болезнь мышечной слабости (Di Gioia et al., 2017; Hedberg-Oldfors et al., 2018). В соответствии с этими симптомами, мы показали, что взрослые mymk мутантные рыбки данио более мелкие мышечные волокна и пониженную мышечную силу. Др. показали, что mymk мутантные мышцы обнаруживают жировую инфильтрацию, характерную для синдрома Carey-Fineman-Ziter (Di Gioia et al., 2017; Shi et al., 2018). Хотя имеются параллели между мутантными фенотипами mymk у рыбок данио и синдромом Carey-Fineman-Ziter, в целом мышечный дефект у мутантов mymk^oz17 значительно более тяжелый, чем синдром у человека. У рыбок данио мутация mymk в мышцах взрослых содержит изобилие клеток, которые, по-видимому, незрелые, не компетентные к слиянию миобласты. Кроме того, мы наблюдали больше пролиферирующих клеток и SLCs и организационных дефектов волокон в mymk мутантных мышцах, это указывает , что ткань постоянно регенерирует. Мы полагаем, что слияние мышц полностью нарушено у мутантных mymk^oz17 рыбок данио, тогда как слияние лишь частично нарушено у индивидов с синдромом Carey-Fineman-Ziter.

Мутантны mymk^oz17 обнаруживают отличительные признаки болезни слабости скелетных мышц (Tabebordbar et al., 2013; Tisdale, 2002; Wallace и McNally, 2009),такие как снижение Laminin, индикатора мышечных повреждений, и драматическое увеличение Pax7-позитивных и Pcna-позитивных клеток, иникаторов активации сателлитных клеток. Наши находки подтверждают, что активированные SLCs у mymk мутантов вносят вклад в мышечные волокна, поскольку pax7a-управляемая экспрессия GFP проявляется (perdures) в незрелых волокнах, которые также экспрессируют маркеры мышечной дифференцировки Rbfox1l или myog:H2B-mRFP (Berberoglu et al., 2017). Непрерывная регенерация также может вносить вклад в др. мышечные дефекты у взрослых мутантов mymk^oz17, такие как присутствие быстрых и медленных волокон вне их обычных пространственных доменов. Затруднительно определить, когда и как фенотип слабости мышц mymk^oz17 начинает проявляться из-за потенциального взаимодействия между дефектами роста мышечных волокон и повреждениями мышц. Одноядерные волокна могут оказываться поврежденными просто из-за того, что они недостаточно сильны, чтобы противостоять нормальным сокращениям; напротив, ткани могут быть в постоянном состоянии регенерации, поскольку слияние существенно для завершения процесса репарации для обычно возникающих повреждений.

Мы начали работу с исследования механизмов мышечного слияния у эмбрионов рыбок данио, у которых слияние быстрых миобластов тесно ассоцирует с миграцией медленных мышц и нуждается в клетках медленных мышц для своевременного начала (Cortйs et al., 2003; Devoto et al., 1996; Henry и Amacher, 2004; Yin et al., 2018). Предшественники быстрых мышц выпускают длинные цитоплазматические отростки перед слиянием (Snow et al., 2008)иием направлен, которые обычно удлиняют клетки в переднем направлении (Yin et al., 2018). В некоторых клетках слияние начинается олько после того, как эти цитоплазматические выпячивания дочстигают как передней, так и задней гранищы сомита (Snow et al., 2008). Наши результаты подтверждают, что др. быстрые миобласты начинают сливаться до того как они распространятся по всему сомиту, и что др. события также могут запускать слияние (Fig. 9 B). Мы показали, что предшественники быстрых мышц часто выпускают отростки кпереди, когда они контактируют с клетками медленных мышц; эти перемещения, по-видимому, смещают наиболее передние клетки в сомите, клетки переднего края (Fig. 9 B #1-2 и (Yin et al., 2018)). Мы показали, что клетки переднего края лишены экспрессии mymk, так что замещение клеток переднего края mymk-экспрессирующими предшественниками быстрых мышц на краю сомита могут в принципе облегчать межклеточные слияния. После того, как предшественники быстрых мышц контактируют с передним краем сомита, они начинают сливаться с более задними миобластами, подтверждая, что кантакт с краем сомита может предоставлять активирующий сигнал (Fig. 9 B #3). Затем к слитым клеткам добавляются новые миобласты до тех пор, пока не будет достигнут задний край сомита (Fig. 9 B #4-5), где внеклеточный матрикс блокирует дальнейшее удлинение волокна (Henry et al., 2005; Snow et al., 2008). Мы полагаем, что мигрирующие клетки медленных мышц могут запускать межклеточные слияния путем активации элонгации миобластов и за счет смещения mymk-позитивных предшественников быстрых мышц к передней границе сомита, где они инициируют слияния с более задними предшественниками, чтобы генерировать многоядерные мышечные волокна.