Межклеточные мостики являются структурами, соединяющими соседние клетки, облегчая перенос материалов и координацию поведения. Эти структуры обнаруживаются во всем царстве животных как в соматических, так и зародышевых клетках, и у многих животных их присутствие важно для гаметогенеза. В целом межклеточные мостики довольно небольшие, обычно 0.5 µm-2 µm в диаметре. Однако межклеточные мостики в зародышевой линии развивающихся яйцевых камер плодовых мушек могут быть довольно крупными, до 10 µm (Fawcett et al., 1959; Greenbaum et al., 2011; Haglund et al., 2011; Robinson and Cooley, 1996; Spradling, 1993), это делает их идеальной модельной системой для изучения механизмов, вносящих вклад в формирование, стабилизацию и рост.

Каждое зрелое яйцо плодовых мушек возникает из структуры, наз. яйцевая камера. Формирование яйцевой камеры начинается в гермариуме с асимметричного деления стволовых клеток зародышевой линии. Одна из дочерних стволовых клеток зародышевой линии, клетка цистобласта, подвергается 4 раундам митозов, чтобы создать цисту из 16 клеток. Циста энкапсулируется соматическими фолликулярными клетками, а зачаток из гермариума проходит через 14 отдельных стадий, чтобы сформировать зрелое яйцо. Митотические деления зародышевых клеток завершаются неполным цитокинезом, в результате этого возникает контрактильное кольцо, которое стабилизируется, чтобы сформировать межклеточный мостик или кольцевой канал. Этот кольцевой канал подвергается утолщению и росту в ходе оогенеза для подготовки процесса разгрузки питающих клеток на ст. 11. Во время разгрузки питающих клеток, базирующаяся на актомиозине контрактильность быстро переносит цитоплазматический материал из питательных клеток в ооцит (Ferreira et al., 2014; Gutzeit, 1986; Spradling, 1993; Wheatley et al., 1995). Чтобы противостоять силам опорожнения, важны стабилизация и рост кольцевого канала; мутации, которые разрушают любой аспект приводят к неполному переносу цитоплазмы и к образованию меньшего по размеру, нежизнеспособного яйца.

Актин является важным компонентом кольцевых каналов зародышевой линии, уровни которого и структурная организация изменяются по ходу оогенеза. ЭМ анализ продемонстрировал, что актиновые филаменты внутри кольцевых каналов обнаруживают тенденцию становиться длинными (более 3 µm в диаметре) и упакованы параллельно др. др. с постоянной плотностью в ходе всего оогенеза (Fig. S1A; Tilney, 1996). Несмотря на относительно постоянную плотность, обнаруживаются четкие контролируемые онтогенетически изменения в скорости нуклеации актиновых филамент и организации внутри кольцевого канала. Во время раннего оогенеза (Phase I), количество филамент увеличивается с ~80 на ст. 2 до более чем 700 на ст. 6; это увеличиние числа филамент сопровождается более чем 6-кратным увеличением толщины кольца, но лишь небольшим увеличением диаметра. Начиная со стадии 6 (Phase II), диаметр увеличивается быстрее, но количество актиновых филамент на кольцевой канал остается практически постоянным вплоть до опустошения питающих клеток (Fig. S1A; Tilney, 1996). Во время Phase II, актин внутри кольцевого канала оборачивается со скоростью, сходной с той, что наблюдается на ведущем крае ламеллиподий мигрирующих клеток (Kelso et al., 2002; McGrath et al., 1998; Theriot and Mitchison, 1991). Эти наблюдения подтверждают, что активность одного или более nucleators необходима для увеличения числа филамент во время Phase I; во время же Phase II, баланс между нуклеацией филамент и severing/disassembly необходимо поддерживать на относительно постоянном уровне динамики актиновых филамент.

В дополнение к стадио-специфическим различиям количества филамент, организация f-actin внутри кольца изменяется. Во время Phase I, актиновые филаменты гомогенно и плотно упакованы. Напротив, во время Phase II, регулярная сеть филамент прерывается пространствами, напоминая рыболовную сеть (Fig. S1A; Riparbelli and Callaini, 1995; Tilney, 1996). Эта реорганизация указывает на то, что д. существовать стадио-специфические различия в активности или количестве одного или более актиновых пучков, помимо отличий в активности одного или более актиновых nucleators.

Несмотря на этот анализ с высоком разрешением организации и количества f-actin внутри кольцевого канала, белки, которые обеспечивают нуклеацию (закрепление) и организацию актиновых филамент не были полностью охарактеризованы. Большинство клеток имеют два основных типа актиновых nucleators. Комплекс Arp2/3 облегчает формирование разветвленных сетей, которые существенны для формирования ламеллиподий во время миграции клеток, при эндоцитозе и, как было установлено, при цитокинезе (Chan et al., 2019; Pollard, 2007). Напротив, семейство formin актиновых nucleators может нуклеировать (закреплять) актиновые филаменты, а также способствовать их элонгации за счет поступательного связывания в направлении колючего конца. Члены семейства форминов участвуют во многих морфогенетических процессах и важных структурах, таких как построение контрактильного кольца во время цитокинеза и при формировании филоподий и ламеллиподий в мигрирующих клетках (Breitsprecher and Goode, 2013; Pollard, 2007). Природа кольцеых каналов, которые происходят из застывших (stalled) контрактильных колец, которые должны подвергаться ~20-кратному увеличению в диаметре, предоставляет уникальную модель для изучения роли разных нуклеаторов актина во множественных зависимых от актина процессах внутри одного типа клеток.

Комплекс Arp2/3 участвует в регуляции размера кольцевого канала во время оогенеза. В питающих клетках, гомозиготных по мутации в комплексе Arp2/3, комплекс из субъединиц ArpC1 или Arp3, кольцевые каналы способны формироваться, но возникают дефекты в размере и форме, впервые обнаруживаемые на ст. 5, т.е. в конце Phase I (Hudson and Cooley, 2002). Сходным образом, мутации Arp2/3 активатора, SCAR, ассоциированы с менее крупными и спавшимися кольцевыми каналами (Zallen et al., 2002). Эти данные указывают на то, что SCAR-обеспечиваемая активация Arp2/3 необходима для роста и стабильности кольцевого канала во время финальной части Phase I и во время Phase II. Однако, актиновые нуклеаторы, способствующие формированию и росту кольцевого канала в начале Phase I, не были идентифицированы и не было известно является ли комплекс Arp2/3 единственным нуклеатором, необходимым во время Phase II. Вполне возможно, что один актиновый нуклетор, такой как комплекс Arp2/3, может регулировать рост кольцевого канала или сто последовательная или кооперативная активность множественных нуклеаторов необходима. чтобы регулировать онтогенетически контролируемые изменения в структуре кольца.

Здесь мы предоставили доказательства, что комплекс Arp2/3 и formin Diaphanous (Dia) играют вполне определенные роли в регуляции размера и стабильности кольцевых канлов в зародышевой линии в развивающихся яйцах плодовых мух. Используя разные GAL4s, чтобы временно контролировать экспрессию трансгена в зародышевой линии, мы показали, что Dia необходим для успешного незавершенного цитокинеза и инициального формирования кольцевых каналов зародышевой линии. Как только оказываются сформированными, комплекс Arp2/3 и Dia кооперируются, чтобы предопределять размер кольцевого канала и поддерживать его стабильность, чтобы облегчить эффективный перенос цитоплазмы из питающих клеток в ооцит.

Итак, актомиозиновое контрактильное кольцо, будучи сформированным, нуждается в добавлении актина и актин-связывающих белков; что необходимо для поддержания его 20-кратного увеличения в ходе оогенеза. С помощью контролируемой во времени экспрессии в зародышевой линии, было установлено, что комплекс Arp2/3 и формин, Diaphanous (Dia), скоординировано регулируют размер и рост кольцевого канала во время оогенеза. Dia необходим для успешного незавершенного цитокинеза и инициации стабилизации кольцевых каналов в зародышевой линии. Как только сформируется комплекс Arp2/3, то Dia крооперируется с ним, чтобы контролировать размер и поддерживать стабильность кольцевого канала. Необходимо поддержание точного баланса между активностью этих двух нуклеаторов во время оогенеза.