Во время первой половины XX века появилась т. наз. 'Экспериментальная эмбриология' которая выявила некоторые принципы способа сборки клеток, взаимодействия и коммуникаций др. с др. для построения организма (Hamburger, 1988). Снова использование Генетики и Молекулярной Биологии на модельных организмах предоставило существенную информацию о молекулярных механизмах, управляющих некоторыми аспектами эмбрионального развития, процессами выбора судьбы и перемещениями тканей. Важно, что эти исследования позволили установить универсальность молекулярного аппарата, лежащего в основе эмбрионального развития, но и также многие примеры видо-специфичных стратегий, отражающих различия в организации и взаимодействиях между Gene Regulatory Networks (GRNs).

Размер и продолжительность жизни делают млекопитающих трудным субъектом для генетических исследований, а их внутриутробное развитие создает барьер для экспериментальных манипуляций. Это особенно актуально в случае человека и приматов в целом. Как следствие, большинство наших знаний о развитии этих организмов получены из анатомических и гистологических коллекций (O'Rahilly and M&umuml;ller, 1987) и мед. исследований (Sadler and Langman, 2012; Schoenwolf et al., 2009). Тем не менее мутагенные программы, осуществленные на мышах в качестве ориентировочного организма развития млекопитающих и биологии человека (Artzt, 2012). Однако, ясно, что существуют существенные различия между развитием этих двух организмов, не только в терминах временной шкалы их развития (20 дней в противовес 280 дням беременности), но и в организации эмбрионов, паттернов генной экспрессии и воспроизводимости стратегий. Это означает, чтобы понять развитие человека, необходимо изучать эмбрионы человека.

Биология развития человека может быть прослежена в работах, приводящих к In Vitro Fertilization (IVF), при котором необходимо поддержание человеческой яйцеклетки, её оплодотворение и жизнеспособность в течение первых зиготических делений, все это ex-utero (Johnson et al., 2010; Steptoe et al., 1971). Возможность выращивания человеческих эмбрионов in vitro приводит к дискуссиям о этическом значении подобных экспериментов (Warnock, 1984). Используя избыточные количества эмбрионов после IVF, в последние годы достигнуто существенное понимание пре-имплантационных ст. развития человека, выявлены отличия от мышей и получена информация о зиготической активации, импринтинге и спецификации вне-эмбриональных и эмбриональных тканей (Niakan and Eggan, 2013; Roode et al., 2012; Telford et al., 1990). Более того, улучшение культуральных условий открыло возможность исследовать развитие ранних имплантационных стадий и начать выявлять роль определенных генов в развитии человека (Deglincerti et al., 2016; Shahbazi et al., 2016; Xiang et al., 2020). Предусмотрев эти возможности сообщение Warnock положило предел этим экспериментам развития днем 14. Это время предшествует процессам гаструляции, мульти-клеточной хореографии, которая трансформирует массу клеток, возникших в результате умножения зиготы в план тела организма (Stern, 2004) (Solnica-Krezel and Sepich, 2012). У мышей время гаструляции означает потерю регулятивной способности и появление организма. Правило 14-го дня ограничивают изучение развития человека во время и после гаструляции, анализом существующей коллекции эмбрионов и плодов. Эти коллекции, особенно одна, созданная Carnegie institution in Baltimore (USA) (NOE, 2004), теперь находится в Вашингтоне, она предоставляет много информации об анатомии нормальных и аномальных эмбрионов. Однако, нет сведений о биологии развития после 14 дня.

Понимание периода вокруг и во время гаструляции не только важно для выявления механизмов, которые лежат в основе плана нашего тела. Хорошо известно, что лишь приблизительно 30% зародышей доходят до рождения и что в то же время 30% этих зародышей не достигают пре-имплантацинной стадии, начиная со 2 недели, 30% неспособны к развитию на 2 и 6 неделе, т.е. примерно во время гаструляции (Jarvis, 2016; Larsen et al., 2013). Более того, многие патологии плодов, как полагают, возникают в этот период развития (Ferrer-Vaquer and Hadjantonakis, 2013). Однако, этические ограничения, связанные с правилом 14 дней не разрешают исследования на этой стадии, но даже если будет получено разрешение, будет необходимо решить множество технических проблем для получения здоровых эмбрионов на этой стадии in vitro. Выход из этого тупика предлагается получением моделей из Pluripotent Stem Cells (PSCs) для осуществления раннего развития млекопитающих возникшее в последние 5 лет (Shahbazi et al., 2019) , но чтобы использовать эти модели мы нуждаемся в знании и понимании, что они моделируют.

Раннее развитие человека соответствует периоду от оплодотворения до 8 недель, начала ст. плода, соотв. 23 стандартизированной "Carnegie stages (CS)", которая содержит детальную анатомическую информацию об эмбрионе во время этого периода (O'Rahilly and Müller, 1987). Классификация базируется на коллекции из экземпляров, созданных под руководством Franklin Mall в начале XX столетия фондом Carnegie Foundation (NOE, 2004). Существуют и др. коллекции, одна из них в Kyoto (Hill, 2018), но количество экземпляров в коллекции Carnegie и детальность морфологических исследований превосходят и служат стандартом для изучения эмбриологии человека (de Bakker et al., 2016). Она состоит из тотальных препаратов и что из серийно порезанных эмбрионов, которые показывают в значительных деталях изменения в клеточной организации, связанной с появлением примордиев разных тканей и органов (O'Rahilly and Müller, 1987; O'Rahilly and Müller, 2010).

На 14-й день после оплодотворения (dpf), CS6, эмбрион человека выглядит как эпителиальная киста с просветом, амниотической полостью, внедрен в сложное окружение, создаваемое в течение предыдущих 7 дней за счет экспансии и дифференцировки трофэктодермы и примитивной энтодермы (Fig. 1, Fig. 2A). На этой ст. просвет зародыша формируется двумя тканями: на одной стороне примыкает цитотрофобласт, амнион появляется как плоский эпителий и он противостоит, хотя и является его продолжением эпибласта из цилиндрического эпителия в форме диска примерно в 0.2 µmm в диаметре. Под эпибластом накрепко примыкает к нему висцеральная энтодерма, также наз. гипобластом, который распространяется латерально прочь от эпибласта, чтобы сформировать вторичный или дефинитивный желточный мешок, характерный для приматов (Fig. 2A). В это время, по-видимому, закладывается будущая передне-задняя ось за счет организации двух структур, ассоциированных с ней. На будущем переднем полюсе возникает группа увеличенных клеток из гипобласта/висцеральной энтодермы, маркируя позицию, из которой возникнет головной мозг в лежащей поверх части эпибласта (Hill and Florian, 1931a, 1931b); и она, скорее всего, эквивалентна Anterior Visceral Endoderm мышей. Эту структуру иногда наз. 'prochordal пластинкой', которая во многих примерах является синонимом 'prechordal' пластинки (see discussion in O'Rahilly and Muller, 1987). На противоположном конце эмбриона, 'connecting stalk' прикрепляет весь зародыш к хориону, указатель заднего полюса эпибласта и будущего места старта Primitive Streak (PS) и создает основу для формирования пупочного канатика (Fig. 2A). Эта структура отчасти имеет неясное происхождение; считается производным вне-эмбриональной мезодермы, но также предполагается, что она происходит из Primitive endoderm или является результатом взаимодействия между Primitive endoderm и цитотрофобластом (Sadler and Langman, 2012). Название 'mesoderm', скорее всего, отражает её промежуточное положение в зародыше, между трофобластом и Висцеральной энтодермой. Присутствие амниона перед гаструляцией контрастирует с ситуацией у мышей, где он формируется во время гаструляции (Pereira et al., 2011).

Fig. 1. Graphical Representation of a timeline of gastrulation in human embryos. The initiation of significant events is highlighted with references to age from fertilization in days and to Carnegie Stages (Stage). See text for details. Adapted from Mьller and O'Rahilly (2004).

Fig. 2. Diagrams of multicellular events during human gastrulation. B-D sections through the embryo as in 14 days post fertilization (dpf) and from the indicated perspective but related to the dates indicated. (A) Human conceptus on 14 dpf within the uterus; implantation is complete, and gastrulation is about to begin. (B) Transverse section of a human embryo on 14-15 dpf (top) and 16 dpf (bottom) showing cell migration through the primitive streak (top) and establishment of three germ layers (bottom). Some cells leaving the epiblast reach the hypoblast and replace them to form endoderm. Cells that remain on the epiblast differentiate to form ectoderm and layer of cells between ectoderm and endoderm form mesoderm. (C) Transverse sections of a human embryo on 18-19 dpf (top) and 21 dpf (bottom) showing the emergence of somites, intermediate mesoderm, lateral plate mesoderm, notochord, and neural tube. (D) Schematic diagram of Sagittal Sections of human embryo between 18 dpf and 20 dpf showing the organization of the different germ layers and associated structures at the end of gastrulation when the Primitive Streak has reached its maximum length. See text for details. Adapted from Langman's, Medical Embryology (2012).

Fig. 3. Dorsal views of human embryos from 17-20 days post fertilization (dpf). (A) 17 dpf human embryo; the Primitive Streak is about to reach its maximum length. (B) 19 dpf pre-somitic human embryo. The region of ectoderm just above prochordal plate thickens to form neural plate, which gives rise to different anterior neural structures. The node is regressing. (C) 20 dpf human embryo with neural groove, neural fold and emerging somites and neurenteric canal etc.

Большая часть того, что мы знаем о гаструляции у человека, мы получили в результате тщательного гистологического анализа эмбрионов из разных коллекций, особенно коллекции Carnegie Ronan O'Rahilly и Fabiola Müller (Müller and O'Rahilly, 2004; O'Rahilly and Müller, 1987) и некоторые из них отражены в обсуждении классических учебников (Hamilton et al., 1978). Однако, современная интерпретация этих изображений учитывает и др. эмбрионы амниот, в частности эмбрионы кур (Schoenwolf et al., 2009). Причина этого, скорее всего, заключается в сходной геометрии диска у эмбрионов, которая существенно отлична от бокаловидной формы, характерной для мышей. Однако, поскольку у эмбрионов птиц гаструляция в основном представляет стереотипные движений предсуществующих клеток, у млекопитающих клеточная хореография связана со взрывом пролиферации (see (McDole et al., 2018; Snow, 1977) для мышей). Мы не знаем о точном количестве клеток у человека во время гаструляции, но культивируемые in vitro эмбрионы содержат около 600 (Deglincerti et al., 2016) в противоположность нескольким тысячам у эмбрионов кур. Поэтому опасно интерпретировать ранние события у эмбрионов человека на базе экспериментальных организмов, т.к. это может склонить наше мнение о процессах, которые, как мы видим, происходят в клеточном окружении со своим собственным пространственно-временным темпом и способом и имеются очевидные различия между видами.

У всех амниот гаструляция начинается с появления первичной полоски (Primitive Streak) в задней области эпибласта в форме локального смещения клеток из эпибласта, очень похожего на Epithelial Mesenchymal Transition (EMT), который распространяется линейно в направлении передней части эмбриона (Figs. 1 and 2B) (Müller and O'Rahilly, 2004). Первичная Полоска определяет срединную линию и действует как точка отсчета для конвергенции клеток эпибласта, которые ingressпроникают и следуют специфическими направлениями под эпибластом (у мышей (Tam, 2004).

Наше представление о гаструляции человека результат детальных исследований O'Rahilly и Müller ((Müller and O'Rahilly, 2004; O'Rahilly and Müller, 1987) и суммированы на Figs. 1 и 2. Первые клетки начинают перемещаться из эпибласта преимущественно в результате EMT, и иногда обнаруживаются на ст. CS6b, 14 dpf, проникающими базально на каудальном конце эпибласта в основании 'соединяющего шнура', который они наводняют; эти клетки bona fide из вне-эмбиональной мезодермы и дают аллантоис (O'Rahilly and Müller, 1987). На ст. CS7, 15-17 dpf, клетки подвергаются EMT, формируя четкую Первичную Полоску, которая прочерчивает AP ось и затрагивает 1/3 эпибласта, который в это время имеет в длину около 0.4 µmm. Некоторые из этих клеток наводняют, смещают и интеркалируют в слой гипобласта, чтобы сформировать энтодерму или дефинитивную энтодерму (DE) (Larsen et al., 2013), как это происходит у эмбрионов мышей (Viotti et al., 2014) (Fig. 2B), тогда как др. движутся, чтобы занять пространства латеральнее под эпибластом и прогрессивно покрывают всю его длину, чтобы сформировать мезодерму (Sadler and Langman, 2012) (Fig. 2B). Передний кончик первичной полоски содержит примитивный узелок, а также впереди него хордальный отросток, который продолжается кпереди вместе с хордальной пластинкой (de Bree et al., 2018) (Fig. 2B and D). Это отличается от мышиных эмбрионов, где родственные структуры не видны вплоть до того, пока полоска не достигнет свой максимальной величины. Соединение полоски и хордального отростка содержит эпителиальное вдавление, известное как нервно-кишечный канал, который создает временное соединение между амнионом и полостью желточного мешка (Fig. 2D). Этот neurenteric канал тесно связан с появлением хорды, он не был описан у мышиных эмбрионов и, как полагают, является остатком бластопора от амфибий и рептилий (Rulle et al., 2018). На ст. CS7, 15-17 dpf, обнаруживаются две дополнительные структуры дорсально на каждой из сторон эпибласта: на переднем конце, вообще-то индуцируется прохондральная пластинка, щечно-глоточная (oropharyngeal) перепонка и, сзади, клоачная перепонка (Fig. 2D). Обе могут появиться раньше и демаркировать слепые концы будущей энтодермы, а щечно-глоточная перепонка станет ротовым отверстием. На ст. CS8, 17-19 dpf, Первичная Полоска достигает максимальной длины в 50% от длины эмбриона (Fig. 5), которая составляет в длину примерно 1-1.5 µmm и все структуры, которые возникли на ст. CS7 становятся более выраженными. Эта стадия эквивалентна мышиной ст. E7.5 (Fig. 4). Клетки из хордального отростка сливаются с верхней частью энтодермы, чтобы сформировать хордальную пластинку, что возможно коррелирует с передним отростком у мышей, который инструктирует нейральную индукцию в передней части эпибласта (de Bree et al., 2018).

Fig. 4. Comparison of gastrulation in mouse (upper panels) and human (lower panels) embryos. Mouse gastrulation initiates around embryonic day (E)6.5 and is complete around E7.5. Human embryo takes longer, about 4 days. It is initiated around 16 days post fertilization (dpf) and completed around 20 dpf. At post implantation stage, mouse embryos acquire cup-like geometry whereas human embryos develop into flat disc-like morphology. See text for details. Fig. 5. Temporal profiles for gastrulation in human (A) and mouse (B) embryos. The x axis represents age of the embryos in days and the y axis the anteroposterior axis of the embryo as a percentage of total length. The Primitive Streak advances rapidly from posterior to anterior in both species. However, the regression of the node follows very different dynamics. In A, blue dotted line represents the dynamics in the mouse. The images outline embryos at representative stages.

На ст. CS9, 19-21 dpf, гаструляция, по-видимому, заканчивается (Fig. 1). Эмбриональный диск становится овальным примерно длиной в 1.5-2.5 µmm и обнаруживает различимые очертания плана тела в форме возникающих головных складок на переднем конце и открытой хвостовой почки с Первичной Полоской, которая регрессирует с др. конца и становятся видимыми 3 или 4 сомита (Fig. 3C) в передней части эмбриона позади головных складок на каждой из сторон от срединной линии, занимаемой открытой нервной трубкой (Fig. 2B and C). Круглое вдавливание, известное как первичный (primitive) узелок, который будет участвовать в формировании узелка, развивающегося на самом переднем конце PS (Fig. 2B). Кпереди от хорды, прохондральная пластинка, часто связанная с и обозначаемая как прехордальная пластинка (O'Rahilly and Mьller, 1987), теперь сцеплена с хордальным отростком, расположенным под развивающимся головным мозгом (Fig. 2D). На переднем конце эмбриона щечно-глоточная перепонка начинает развиваться как будущая ротовая полость, а на заднем конце клоачная перепонка становится анальной полостью (Fig. 2D). На этой ст. примордий сердца располагается вентрально в наиболее передней области эмбриона (Fig. 2D), также как и у мышей; нейральная индукция, рост головного мозга и морфогенез сердца отталкивают этот зачаток кзади в направлении его переднего торакального расположения (Madabhushi and Lacy, 2011). Переход между CS8 и CS9 ассоциирует с регрессией полоски и морфогенетическими перемещениями, которые приводят к очерчиванию формы эмбриона; это, по-видимому, соответствует периоду между E7.5 и E.8.0 у эмбрионов мыши.

Несколькими днями позднее, ст. CS11, 23-26 dpf, эмбрион длиной примерно в 4 µmm и разные зачатки оказываюися более развитыми: сомитогенез идет полным ходом, зачаток головного мозга достаточно развит на переднем конце и отталкивает развивающееся сердце к его окончательному положению за пределы уровня шеи. Закрытие нервной трубки теперь видно в определенных отделах спинного мозга. Осевые расширения продолжаются одновременно с сомитогенезом вплоть до ст. CS13-14, 32-35dpf.

Изучение экспрессии генов у пери-гаструляционных эмбрионов человека невозможно по этическим причинам и даже когда подобные исследования были проведены у Non-Human Primates (NHP), то эти исследования остались в меньшинстве (Ma et al., 2019; Nakamura et al., 2016; Sasaki et al., 2016). Однако, успехи в культивировании пре-имплантационных эмбрионов и эмбрионов NHP позволили исследовать ранние ст. гаструляции на молекулярном уровне (Deglincerti et al., 2016; Niu et al., 2019; Shahbazi et al., 2016; Xiang et al., 2020). Эти исследования показали, что экспрессия генов ассоциирует с гаструляцией, законсервированной у мышей. Напр., экспрессия BMP в амнионе, ассоциация экспрессии T/BRA в Первичной Полоске и до этого события локализация экспрессии OTX2 и HESX1 на противоположных концах эмбриона, внутри гипобласта, по-видимому, в прохордальной пластинке, подчеркивают возможность, что эта структура соответствует мышиной Anterior Visceral Endoderm. Подобные паттерны генной экспрессии предоставляют молекулярное определение для AP и DV осей, хотя способ появления этих паттернов может отличаться у мышей и людей. Напр., недавняя работа на NHP идентифицировала сеть ISL1/BMP4 в качестве критического сигнала в спецификации первичной полоски из амниона, которому не получено доказательств у мышей (Yang et al., 2020). Такие исследования генной экспрессии привели также к идентификации PGCs в заднем домене эпибласта и в некоторых исследованиях было предположена ранняя волна PGCs спецификации в амнионе перед гаструляцией (Kobayashi and Surani, 2018; Saitou and Yamaji, 2012; Sasaki et al., 2016; Zheng et al., 2019).

Недавно был проанализирован один эмбрион человека на уровне экспрессии генов в одиночных клетках (Tyser et al., 2020). Этот уникальный образец обнаруживал выраженную Первичную Полоску и находился вообще-то на ранней ст. сокращения полоски, поздняя ст. CS7. Анализ выявил паттерн генной экспрессии, ассоциированный с тремя зародышевыми слоями, PGCs, мезодермой желточного мешка и гематопоэзом (преимущественно в желточном мешке). Несмотря на присутствие амниотических маркеров вместе с кластером эктодермы, не обнаружено отдельного кластера для амниона. SOX17, необходимый для развития энтодермы (Kanai-Azuma et al., 2002), специфицирует также Primordial Germ Cells (PGCs) у людей (Irie et al., 2015). Поскольку он в основном обнаруживается в кластере энтодермы, небольшая экспрессия SOX17 обнаруживается в PGCs с высоким уровнем экспрессии др. PGC маркеров внутри PS кластера, показывая, что человеческие PGCs уже специфицированы на ст. CS7 эмбрионов.

Эта работа помогла открыть различия в развитии между мышиными и человеческими эмбрионами. FGF8, который играет критическую роль в миграции клеток во время гаструляции у мышей (Sun et al., 1999), не экспрессируется у эмбрионов людей. Вместо этого, представляется, что др. члены FGF семейства, FGF2 и FGF4, которые не нужны для гаструляции у мышей, могут быть необходимы во время развития человека, что также было подтверждено направленной дифференцировкой в вязкой (adherent) культуре. Сходным образом,, CRIPTO, который, как было установлено, участвует в гаструляции у мышей (Minchiotti et al., 2000) и в формировании паттерна мезодермы, отсутствует в возникающей мезодерме у человеческих CS7/8 эмбрионов. Др. отличия включают экспрессию SNAI2, который не участвует в гаструляции у мышей (Jiang et al., 1998), но который был идентифицирован как признак возникающей мезодермы у человеческих CS7 эмбрионов.

Т.к. это единственные доступные молекулярные данные для эмбриона человека на этой стадии, это исследование может дать больше путем сравнения с др. животными моделями помимо мышей, особенно с NHP.

У эмбрионов человека период от инициации EMT в основании соединительного шнура (stalk) и до начала сомитогенеза и нейруляции составляет около 4-5 days (~14-18/19 dpf). Это контрастирует со временем того же самого процесса у мышей, протекающего в течение полутора дней, между E6.5 и E8 (Fig. 4). Тогда как хорошо известно, что мыши и люди имеют отличающееся по времени развитие, в целом беременность, а также события, такие как формирование бластоциста, различаются во времени, но временные различия при гаструляции стали неожиданными, поскольку мы знаем, клеточные и молекулярные события одни и те же у обоих видов. Возможно, что некоторые молекулярные события, связанные с приобретением клеточных судеб, оказываются медленнее у приматов, как это было предположено для нейральной дифференцировки и сомитогенеза (Matsuda et al., 2020; Rayon et al., 2019), или что существуют различия в клеточной физиологии , напр., метаболизм между видами. В противовес молекулярным темпам может существовать гетерохрония процессов, связанных с этим периодом.

Возникновение плана тела во время этого периода может быть прервано двумя событиями или фазами: (1) появлением первичной полоски с её максимальным удлинением на эпибласте, которое заканчивается с появлением узелка и (2) согласованной последовательностью крупно-масшабных перемещений клеток, которые обнаруживают план тела; у амниот этот процесс ассоциирован с 'регрессией узелка'. Интересно отметить, что первая фаза очень сходна по времени у обоих эмбрионов: примерно 2 дня у людей (day 14 - 16 (Müller and O'Rahilly, 2004)) и полтора дня у мышей (E6.2 - E7.5 (Tam, 2004)). Однако, перестройки, связанные с регрессией узелка и появлением плана тела очень отличны по времени: примерно 2 или 3 дня между 16 и 18/19 у эмбрионов человека и одним днем или меньше, между E7.5 и E8.0/8.5 у эмбрионов мышей (Fig. 5a and b). Это указывает на существование временной шкалы для клеточных процессов, которые необходимо исследовать. Возможно также, что спецификация зародышевых слоёв и их производных имеет и разную временную организацию. В то время как у мышей спецификация энтодермы и разного типа мезодермы обнаруживает четкое временное перекрывание, у приматов это может быть разделено в пространстве, что умножается различиями в клеточной физиологии (Fig. 4). Эти различия в клеточных стратегиях сказываются на перспективе развития хорды, которая у эмбрионов людей, по-видимому, является защищенным процессом с разными фазами и структурами распределенными во времени, напр., она появляется даже ранее первичной полоски и достигает максимума длины (de Bree et al., 2018), тогда как у мышей хорда появляется только на ст. E7.5, после того, как полоска достигает максимальной длины.

Эти наблюдения подтверждают, что различия во времени, наблюдаемые при гаструляции, могут быть результатом комбинации различий в биохимии, а также в развертывании морфогенетических стратегий.

В последнее время PSCs (ESCs и iPSCs) стали ориентиром для исследований ранних ст. развития млекопитающих (Shahbazi et al., 2019) (Fu et al., 2020). Обширные исследования показали, что под воздействием различных сигналов в культуре ESCs могут подвергнуться дифференцировке в любой тип клеток организма. Более того, течение времени и программы генной экспрессии, ассоциированные с этими событиями отражали, события, происходящие в эмбрионе. Эти наблюдения были расширены для PSCs человека и предоставили важную информацию о роли, которую они выполняют в выборе клеточных судеб (Loh et al., 2014, 2016).

Большинство из этих фундаментальных работ на человеческих PSCs были осуществлены с использованием ESCs, происходящими из бластоцистов человека, хотя в принципе iPSCs ведут себя сходным образом. ESCs человека, по-видимому, представляют собой смесь пост-имплантационных состояний (Hough et al., 2009, 2014; Lau et al., 2020) вместе с субпопуляцией, близкой к состоянию, эквивалентному эмбриональному на ст. 14 dpf , т.к. понуждаемые к дифференцировке, ESCs немедленно подавляли гены плюрипотентности и экспрессировали когорту генов, ассоциированных с гаструляцией, включая T/BRA и MIXL1. (Hough et al., 2009, 2014; Lau et al., 2020; Loh et al., 2014, 2016; Vallier et al., 2009). Однако, во время дифференцировки в вязкой (adherent) культуре клетки обнаруживали гетерогенность в отношении генной экспрессии, которая увеличивалась со временем и приводила к сложной смести клеток, находящихся на разных ст. развития. Дифференцировка в adherent культурах также была лишена пропорций типов клеток, ассоциированных с развитием тканей или органов in vitro. Подобная изменчивость контролировалась путем культивирования при условиях, которые принуждали к определенной геометрии и росту клеток (Bauwens et al., 2008; Warmflash et al., 2014).

Когда человеческие ESCs помещали на структуированный (patterned) адгезивный субстрат, который понуждал их рост и движения, то сталкиваясь с BMP4, организовывали сами себя в радиальные паттерны генной экспрессии, которые воспроизводили становление зародышевых слоев в эмбрионе: эпибласт в центре, окруженный энтодермой, мезодермой и снаружи кольцо внеэмбриональной мезодермы (Martyn et al., 2019a; Warmflash et al., 2014). Эти паттерны были соизмеримы и воспроизводимы и реагировали на зависимую от BMP4 активацию передачи сигналов Wnt и Nodal, также, как это наблюдалось во время гаструляции у мышей. Возникающие при этом колонии с разными комбинациями сигналов обнаруживали реакции, согласующиеся с последовательными паттернами экспрессии генов у мышиных эмбрионов во время гаструляции (Martyn et al., 2019b) и по этой причине было предложено, называть их "2D gastruloids" (Camacho-Aguilar and Warmflash, 2020). Эти 2D гаструлоиды являются, следовательно, прекрасной моделью для изучения роли сигналов, обусловливающих дифференцировку зародышевых листков и организацию в клетках человека. Специфические воздействия выявили популяцию с характеристиками узелка (Martyn et al., 2018), хотя не были установлены необходимые условия возникновения этой популяции (Sharon et al., 2011).

Профилироание одиночных клеток 2D гаструлоидов недавно выявило более высокую клеточную сложность, включая сигнатуры амниона, human primordial germ cell-like cells (hPGCLCs), примитивной и дефинитивной энтодермы и клеточных состояний переходной мезодермы (Minn et al., 2020). Это исследование также подтвердило, что эти структуры тесно родственны E7.0 мышам и 16 dpf cynomolgus monkey гаструле, поместив их приблизительно на ст. CS6-7 эмбрионов человека и подтвердив, что они соответствуют ст. гаструлы.

Эти исследования выявили детали реакции на разные сигналы и идентифицировали петли ответной реакции (circuits), специфичные для человека, напр., воздействие BMP4 способствовало экспрессии NOGGIN, при создании обратной связи, которая контролирует реакции клеток, которые не существуют в эмбрионах мыши (Etoc et al., 2016). Важно, что эта система предоставляет доказательства того, как локальная организация и структура клеток влияет на глобальное формирование паттерна (Etoc et al., 2016) и предоставила мощный инструмент для проверки, действительно ли механика и геометрия играют роль в этих процессах. Однако, 2D гаструлоиды не нарушают радиальной симметрии спонтанно, хотя они могут делать это с помощью асимметричных, с контролируемыми потоками сигналов (Manfrin et al., 2019) от внутреннего энтодермального и мезодермального колец, а также эктодермального центра.

2D-гаструлоиды чрезвычайно пригодны в выделении GRNs , которые предопределяют свою судьбу во время пери-гаструляционных стадий у эмбрионов человека, при этом механика и геометрия играют роль в этом процессе. Однако, 2D-гаструлоиды не закладывают и не участвуют в осевой симметрии, но повышают свою клеточную сложность со временем также как и эмбрионы. Эти свойства лучше всего рассмотрены в исследованиях non-adherent культур, инспирированных работами с 3D моделями гаструляции с мышиными ESCs (Baillie-Johnson et al., 2015; Beccari et al., 2018; van den Brink et al., 2014).

Когда большие количества ESCs агрегируют и растут в Serum, они генерируют крупные массы дезорганизованных дифференцированных клеток, наз. Embryoid bodies, которые используются для изучения потенциала дифференцировки (Brickman and Serup, 2017). Такие эмбриоидные тела могут рассматриваться как 3D correlates дифференцировки в вязких культурах. Однако, когда растут определенные количества мышиных ESCs или ECCs в 3D в контролируемых культуральных условиях, то они развивают набор структур, которые напоминают пост-имплантационное развитие и многие события, ассоциируют с гаструляцией и недавно были расширены до человеческих PSCs (Baillie-Johnson et al., 2015; Beccari et al., 2018; Harrison et al., 2017; Hashmi et al., 2020; Marikawa et al., 2009; Moris et al., 2020; Sozen et al., 2018; van den Brink et al., 2014; Veenvliet et al., 2020; Vianello and Lutolf, 2020).

Во время ранней пост-имплантационной стадии эпибласт человека подвергается формированию просветов и дифференцировке, чтобы сформировать биполярную структуру, содержащую амниотическую эктодерму на одной сторони и пре-гаструляционный эпибласт на вентральной стороне (Xiang et al., 2020) (Fig. 2A). Когда человеческие PSCs индуцируются к дифференцировке в мягкое гелевое ложе, то они само-организуются в асимметрические кистозные мешки со свойствами пост-имплантационных человеческих эмбрионов (Shao et al., 2017). Эти 3D модели были названы Post-implantation Amniotic Sac Embryoid (PASE). Помимо воспроизведения развития амниона, эти структуры также воспроизводили ранние стадии гаструляции, демонстрируя появление структуры, подобной Первичной Полоске, с активно мигрирующими клетками, подвергшимися EMT с полюса, который экспрессирует T/BRA и SNAI. Формирование амниотической эктодермы в PASE зависит от активации автономной передачи сигналов BMP. Эти структуры возникают с низкой частотой и не прогрессируют дальше. Использовали microfluidic систему для этой модели, чтобы увеличить частоту таких событий и позволить контролировать формирование паттерна (Zheng et al., 2019). В такой расширенной модели, циста эпибласта генерировалась под действием передачи сигналов FGF. Асимметричная передача сигналов BMP в таких цистах приводит к нарушениям симметрии, это создает эпибласт-подобные структуры на стороне, лишенной передачи сигналов BMP и структуры, подобные амниотической эктодерме, которые подвергаются действию передачи сигналов BMP. Такие структуры обнаруживают экспрессию BRA и содержат человеческие primordial germ cell-like cells (PGCLCs). В отсутствие передачи сигналов BMP эти структуры неспособны нарушать симметрию и все клетки приобретают эпибласт-подобную судьбу. Такие модели прекрасно подходят для изучения многих клеточных биологических свойств, подобных образованию просветов и cavitation в человеческом эмбрионе (see Fig. 2A), а также для исследования роль сигналов в нарушении симметрии и уникальных взаимоотношений между эпибластом и амнионом у человека.

Предпринимались разного рода модельные попытки по реконструированию дополнительных свойств эмбрионов и по анализу влияния сигналов по нарушению симметрии и формирования паттерна эпибласта. В исследовании Simunovic с колл. генерировали 3D сферический слой эпителия с просветом путем позволения диспергированным PSCs само-агрегироваться в гидрогеле (Simunovic et al., 2019). Эти структуры поляризовались вследствие униформного воздействия BMP4, с образованием диполя из BRA позитивных клеток на одной стороне и SOX2 на др. BRA экспрессия и EMT в эпибласте являются характерными метками инициации гаструляции, которая у амниотических эмбрионов происходит только в клетках, мигрирующих через PS. Однако, в этом случае диполь формируется благодаря появлению и экспансии BRA позитивного домена на одном конце эпителия без какой-либо сортировки клеток или событий миграции. Эта модель, следовательно, демонстрирует нарушение симметрии в эпибласт-подобной структуре с просветом, но она неспособна формировать три зародышевых листка и и др. ключевые события, возникающие на пост-имплантационной стадии.

Чтобы исследовать этот вопрос была описана альтернативная 3D модель, которая дает три зародышевых слоя и подвергается удлинению водоль оси, как это наблюдается у эмбрионов человека на ст. D17-20 (Fig. 3). Работа с мышиными ESCs показала, что если подвергать воздействию передачи сигналов Wnt при определенных экспериментальных условиях, то они могут подвергаться нарушению симметрии и морфогенетическим событиям, воспроизводящим то, что происходит во время гаструляции эмбрионов (Baillie-Johnson et al., 2015; Beccari et al., 2018; van den Brink et al., 2014). Эти структуры были названы 'gastruloids' (van den Brink et al., 2014) и недавно были получены из человеческих ESCs (Moris et al., 2020).

Человеческие гаструлоиды обладают многими маркерами гаструляции развивающегося эмбриона, в частности, они обладают нарушениями симметрии, маркерами, характеризующими три зародышевых слоя, вытягивание вдоль оси AP и набором экспрессии генов, соответствующим плану тела позвоночных. Человеческие гаструлоиды нуждаются лишь в минимальной экзогенной активации передачи сигналов Wnt , активация которой достаточна для инициации программ дифференцировки, но как и у их мышиных аналогов, по-видимому, базирующееся на эндогенной передаче сигналов для формирования паттерна, отсутствует примордиум головного мозга и присутствует разделение между генетическим blueprint плана тела и программой морфогенеза (Beccari et al., 2018; Veenvliet et al., 2020). На самом переднем конце гаструлоиды имеются признаки развития сердца и, помимо этого паттерн экспрессии генов, характерный для сомитогенеза (Moris et al., 2020). Такая пространственная организация мезодермального зачатка приводит к предположению, что на 72 h развития, гаструлоиды могут быть картированы как эмбрионы ст. CS9 embryo (Moris et al., 2020). Возникают вопросы, как достигается эта стадия, соединение программ генной экспрессии и морфогенез и, в частности, как предопределяется гаструляция. Обычно гаструляция понимается как период развития, в котором генерируются зародышевые слои и их производные. Однако, лучше всего понятен процесс создания системы осевых координат, чтобы организовать производные зародышевых слоёв, т.е. сгенерировать план тела. Этот процесс, по-видимому, осуществляется за счет многих разных механизмов у разных видов, конвергенции в законсервированных план тела. По крайней мере, на уровне экспрессии генов эта конвергенция плана тела общая у гаструлоидов, предоставляющих экспериментальную систему для изучения вопросов., возникающих при этом наблюдении. Важно, когда все эти 3D структуры сравниваются, то возникают вопросы, почему некоторые модели (напр., PASEs) не развиваются в направлении приобретения плана тела и почему это делают др., напр., гаструлоиды.

Понимание ранних ст., особенно гаструляции, тормозится этическими ограничениями правилом 14-дня, но даже если это будет пересмотрено (Hyun et al., 2016), останется технические проблемы, связанные с получением эмбрионов человека, культивированием in vitro в течение гаструляции. Этические вопросы также остаются связаны с количеством эмбрионов, необходимых для таких экспериментов. В этих условиях развитие базирующихся на PSC моделей предоставит экспериментальный путь с незначительными этическими проблемами (Hyun et al., 2007; Rivron et al., 2018). Напр., гаструлоиды не обладают полным организменным потенциалом (Moris et al., 2020), а PASEs лишены TE и Primitive Endoderm и поэтому не могут быть имплантированы. С др. стороны, проблемы, связанные с возможностью, что человеческие Blastoids смогут в будущем развиваться, д. вообще-то ограничены теми же самыми нормативами и законами, которые регулируют эксперименты с пре-имплантационными эмбрионами. Следовательно, т.к. PSC модели гаструляции стоновятся важным инструментов для понимания около-гаструляционных событий, они требуют утверждения и регуляции. Находка всё увеличивающегося количества человеческих специфических клеточных и молекулярных сигнатур подтверждает, что подобные разрешения будут сделаны для человеческих эмбрионов. Соединительный шнур, появление амниона перед гаструляцией, а также neurenteric канала, возможно присутствие oropharyngeal перепонки и клоачной перепонки являются структурами, присутствующими у приматов и возможно у др. млекопитающих, при отсутствии соотв. коррелятов, которые бы предоставили преимущества таким моделям. Более того, GRNs, которые оперируют у людей и которые выявляются с помощью вязких (adherent) и non-adherent культур PSCs подчеркивают, что на этом уровне, скорее всего, существуют фундаментальные различия между двумя видами, напр., в отношении ассоциации Sox17 с PGCs, ISL1 с амнионом и FGF2 и FGF4 скорее, чем с FGF8 с гаструляцией.

Классические коллекции, распространенные в мире, составляют фундаментальную основу, клеточную основу, на бвзе которой интерпретируются некоторые свойства таких ex vivo систем, но технологические успехи в этой области с момента генерации этих коллекций, напр., окраска антителами, геномика одиночных клеток и крупные на пространственной шкале - omics технологии позволят получить дополнительную информацию о ранних эмбрионах человека. Нравственные устои, используемые при создании классических коллекций спорны по сегодняшним меркам (Morgan, 2009), но это не означает, что, как было установлено, на недавнем примере CS7 эмбриона человека (Tyser et al., 2020), что мол невозможно получать такие эмбрионы при существующих сегодня нормативах. Такие эмбрионы не подпадают под правило 14-дня, но которому необходимо следовать согласно мерам при существующих этических принципах, которые необходимо обсуждать и формализовать. Такие около-гаструляционные эмбрионы человека не только расширят знания, получаемые при анализе классических коллекций, но и предоставляют важные отсылки к выяснению доказательств базирующихся на PSC моделях, которые если будут подтверждены, предоставят широкое поле экспериментальных возможностей для понимания механизмов развития человека, запустят исследования тератологии и сгенерируют модели болезней.