Получение оптических изображений играет важную роль в раскрытии мистерии раннего развития новой жизни [1–3], позволяя понять формирование организма, инспирировать стратегии тканевой регенерации и предоставляя информацию о наилучшем менежменте врожденных дефектов и нарушений эмбриогенеза. Перед сообществом биомедицинских оптиков встала потребность в быстром получении изображений с высоким разрешении, глубоким проникновением, динамичным и не нарушающим жизненные процессы. Оптические изображения неинвазивной, высокого разрешения природы, также как и со способностью получения изображений вживую отвечали бы таким потребностям на фоне успехов оптических изображений [4–8].

С одной стороны, флюоресценция наиболее широко используется для контрастирования механизмов целенаправленно для клеточных и молекулярных компонентов в эмбриональных тканях [9,10]. При постоянном улучшении молекулярно генетических инструментов, флюоресцентное мечение становится легче, быстрее, более специфичным и подходит для всё большего количества модельных организмов [10–12]. С др. стороны, использование эндогенных оптических контрастов позволяет обходиться без оптических изображений, которые накладывают внутренне присущие ограничения на флюоресцентные изображения, такие как фотообесцвечивание (photobleaching) и фототоксичность [13,14], поэтому устранение основных ограничений вместе с получением высокого временного разрешения и длительной продолжительности изображений динамических процессов развития. Такие эндогенные оптические контрасты возникают в результате различных фотон-тканевых взаимодействий, предоставляя анатомическую, морфологическую, механическую, молекулярную и функциональную информацию об эмбриональном развитии [15–18].

Здесь мы попытались рассмотреть недавний прогресс в получении оптических изображений эмбрионального развития без использования меток. Недавно техника получения оптических и optoacoustic (photoacoustic) изображений для биологии развития рассмотрена Ripoll et al. [3], гле обсуждалась в основном глубина, скорость и разрешение получения изображений – три наиболее важные характеристики методов получения изображений. Мы прежде всего сконцентрируемся на связях между фундаментальным контрастом, способности отображения и соотв. использование в биологии развития, подчеркивая обязательные свойства получения оптических изображений без мечения в противовес технике, базирующейся на флюоресценции. Подобные методы базируются на рассеивании (scattering) и поглощении (absorption) ( Table 1).

Table 1.

Label-free optical techniques in embryonic imaginga

Technique Scale of Resolution Scale of Depth Contrast Applications

OCT Microns to Ten Microns Millimeters Refractive Index Mismatch; Speckle Variance; Doppler; Strain and Shear Stress Tissue Structure; Vasculature; Blood Circulation; Biomechanics

OCM Microns Hundred Microns Refractive Index Mismatch Cell Structure; Tissue Structure

RM Submicron to Microns Hundred Microns Raman Scattering Biomolecule

BM Submicron to Microns Hundred Microns Brillouin Scattering Biomechanics

SHGM Submicron to Microns Hundred Microns Ordered Non-Centrosymmetric Molecular Structure Biomolecule; Tissue Structure

THGM Submicron to Microns Hundred Microns Refractive Index Mismatch Cell Structure; Blood Circulation

OPT Microns to Ten Microns Millimeters to Ten Millimeters Absorption Tissue Structure

PACT Ten Microns to Hundred Microns Ten Millimeters Absorption Vasculature; Oxygen Saturation

PAM Microns to Ten Microns Millimeters Absorption Vasculature

QPI Submicron to Microns Hundred Microns Optical Path Length Cell Structure

a OCT: optical coherence tomography; OCM: optical coherence microscopy; RM: Raman microscopy; BM: Brillouin microscopy; SHGM: second harmonic generation microscopy; THGM: third harmonic generation microscopy; OPT: optical projection tomography; PACT: photoacoustic computed tomography; PAM: photoacoustic microscopy; QPI: quantitative phase imaging. Table 1. Label-free optical techniques in embryonic imaginga

Предложенная в 1991, optical coherence tomography (ОКТ) - это метод визуализации с низкой когерентностью, основанный на интерферометрическом обнаружении обратно рассеянного света от ткани. [19]. В целом, OCT имеет глубину получения изображений на уровне миллиметра с пространственным разрешением на микро-шкале в 3D [20]. Эта уникальная шкала получения изображений хорошо сравнима с промежуточным состоянием между с конфокальным и высокой частоты ультразвуком, тем самым предоставляется беспрецедентная визуализация ранних и средней стадии эмбрионов от небольших модельных животных [21,22]. В 1996 OCT была использована для получения изображений морфологии и анатомии эмбрионов лягушек и рыбок данио как in vitro, так и in vivo, позволив различить критические структуры, такие как глаз и головной мозг [23,24]. После этого OCT была применена для широкого круга животных моделей [25–36].

Путем определения low-coherence interference между отраженным светом от выборки и отраженным светом от опорного плеча, в 1D глубиной разрешения OCT A-scan мог быть получен посредством или прямого картирования оптической интенсивности (time-domain OCT) или путем обратного преобразования Fourier transform of the spectrally-resolved interference fringes (Fourier-domain OCT) [37]. С помощью 2D transverse сканирования воспроизводящего электронного пучка (imaging beam), реконструированные 3D OCT сигналы интенсивности позволили картировать refractive index mismatch внутри ткани, позволяя получить 3D изображения структуры ткани. Как таковая, структурная OCT позволяет получить анатомическую и морфологическую информацию от эмбрионов, включая глаза, головной мозг, сердце и конечности [30,38,39]. Миллиметрового уровня получение изображений с помощью OCT ограничивает доступ к структурам внутри эмбрионов крупного размера, тогда как недавно разработанная rotational imaging OCT преодолевает эти ограничения за счет интеграции множественных углов получения изображений с помощью OCT [40]. С разрешением на микро-шкале OCT позволяет получать сравнимые визуализации с традиционной гистологией [23–25,41], но обнаруживается ряд привлекательных преимуществ, включая получение быстрых изображений, отсутствие необходимости в преобразовании выборок, прямая объемная реконструкция и что более важно, возможность оценивать динамику вживую.

Получение изображений с помощью динамической структурной OCT стало основным подходом для понимания эмбриональной сердечной активности. Получение изображений с помощью высокого разрешения B-сканирования может быть легко достигнута частота кадров, достаточная для отслеживания динамики сердцебиений в определенной плоскости [26,27,42]. Т.к. традиционная скорость получения OCT изображений недостаточна для прямого отслеживания сердцебиений volumetrically, был разработан ряд подходов по реконструкции высокого качества визуализаций 3D кардио-динамики. Это обычно достигается посредством последовательного получения 2D time lapses с разных позиций сердца с определенным пространственным промежутком и последующей синхронизацией time lapses в одной и той же фазе цикла сердцебиения. Для прямой синхронизации time lapses, скорость сердца может активно контролироваться с помощью внешней кардиостимуляции [43], или вторичной Doppler-based системы, которая может использовать пассивно получаемые сигналы от сердцебиений как ориентир для синхронизации [29,44]. Разработан также ряд post-processing алгоритмов для синхронизации без внешних сигналов [45–49]. В частности, 2D time lapses, соответствующие одному циклу сердцебиения оказываются синхронизированными со своими соседями, отделенными небольшим расстоянием recursively от одной плоскости изображения до следующей, базируясь лишь на самих данных изображений, чтобы получить 4D (3D + время) реконструкцию сердцебиений с объемным соотношением, эквивалентным B-scan скорости цикла (acquisition rate) [18,50]. Были также предприняты повторяющиеся попытки разработать систему ультравысокой скорости получения OCT изображений для получения непосредственных volumetric изображений сердцебиений у эмбрионов [51–53], с объемным соотношением в пределах от 10-20 Hz [51,52] до 43 Hz, получаемых с помощью 1.5 MHz A-сканирования [53]. Однако, необходим более быстрый лазерный источник, которые всё ограничены на рынке. Важно использование 4D OCT кардиодинамических изображений для фенотипической оценки соотв. генетических мутаций, ассоциированных с врожденными пороками сердца у мышей. Напрэ, Lopez III et al. идентифицировали дефект кардиального петлеобразования у Wdr19 мутантных мышей, используя получение 4D OCT структурных изображений [50].

Получение динамических структурных OCT изображений используется и для изучения процессов закрытия нервной трубки на мышах [54]. С помощью получения time-lapse изображений в течение 16 ч., наблюдалось закрытие подобное застегиванию пуговиц в регионе среднего мозга и самостоятельный процесс закрытия, подобный застежке молнии в регионе заднего мозга (Рис. 1) [54]. В частности, получение OCT volumetric изображений позволяет провести подходящие и аккуратные измерения 3D расстояний между нервными складками по ходу процесс, это приводит к количественной оценке динамики закрытия и характеристике дефектов нервной трубки у мутантных мышей [54]. Т.к. процесс развития использует многочисленные морфогенетические изменения, которые являются критическими для успешного становления разных органов. Этот подход ротгоден и для изучения эффектов генетических мутаций и эпигенетических факторов.

Fig. 1. Dynamic structural OCT imaging of the cranial neural tube closure in the mouse embryo. (A) Representative frames from 3D OCT time-lapse showing the closure process while the embryo is turning. (B) Zipper-like closure of neural tube at the hindbrain region with quantitative analysis. The red arrows point at the site where zipper-like closure occurs. (C) Button-like closure of neural tube at the midbrain region with quantitative analysis. The red arrows point at the sites where button-like closure occurs. Scale bars are (A) 300 µm and (B, C) 200 µm. Reproduced from [54].

Помимо получения структурных OCT изображений, функциональные OCT методы с новыми механизмами контраста делают возможным продвинутый анализ функциональных аспектов эмбриона. Сюда прежде всего входит получение изображений сосудистой сети с помощью OCT ангиографии, изображений кровотока с помощью Doppler OCT и биомеханической оценки с помощью OCT elastography и для картирования касательного воздействия (shear stress) .

Ангиография с помощью OCT оценивается с помощью post-processing изменений OCT интенсивности (испещренности) или фазы, индуцируемой путем перемещения циркулирующих клеток крови [55]. Для высокого разрешения сосудистой сети эмбриона OCT ангиография является основным альтернативным подходом в сравнении с базирующимися на флюоресценции подоходом получения изображений для анализа функционального васкулогенеза [56,57]. С помощью ультра скоростного получения изображений, OCT ангиографический анализ может быть осуществлен посредством множественных объемов, давая time-lapse изображения кровеносных сосудов [53]. Недавно такого типа cross-volume анализ продемонстрировал 4D динамику ангиографии мышиного эмбриона с бьющимся сердцем [58], позволив определить сегментацию объема кардиальной крови во время всего цикла сердцебиения, это было существенно для численного моделирования ранней биомеханики сердца.

Doppler OCT использует OCT фазовый сигнал, чтобы определить непрерывное перемещение рассеивающих элементов и количественно измерить скорость их движения [59]. Впервые использованное для получения эмбриональных изображений в 1997 [60], Doppler OCT делает возможным мощный 4D высокого разрешения анализ кровотока у эмбрионов [18] (Fig. 2). Основное место применения измерений токов в сосудистой сети [28,61–63] и в сокращающемся сердце [28,53,60,64,65], позволяет осуществлять динамическую оценку с высоким пространственно-временным разрешением. Так, получение 4D изображений кардиальной гемодинамики дает беспрецедентные визуализации [44,66]. Также вместе с анализом движений кардиальной стенки, получение OCT гемодинамических изображений в сердце эмбриона позволяет понять как раннее трубчатое сердце качает кровь [18], выявляя биомеханику кардиогенеза [67]. В частности наблюдаются ретроградные токи в сердце, лишенном клапанов, и оцениваются в разных местах [18,35]. Ретроградный ток распознается как интересный механотрансдукционный стимул, требующий тщательного изучения в будущем для выяснение его специфиеской роли в развитии эндокардиальных подушек и в образовании собственно клапанов. Кроме того, получение Doppler OCT imaging изображений использовано для изучения нарушений гемодинамики, вносимых разными манипуляциями в эмбриональном сердце [35,68,69], это поможет улучшить наше понимание врожденных болезней сердца в связи с биомеханическими повреждениями.

Fig. 2. Doppler 4D OCT imaging of cardiac hemodynamics in the mouse embryo at embryonic day 9.0. (A-D) Cross-sectional visualizations of the sinus venosus, primitive atrium, and vitelline vein at different time points of cardiac cycle. (E-H) Cross-sectional visualizations of the primitive ventricle and bulbus cordis at different time points of cardiac cycle. Solid arrows point at retrograde flows in the primitive atrium. Dashed arrows point at retrograde flows in the atrioventricular region. Dotted arrows point at retrograde flows in the bulbus cordis and the bulboventricular region. The dashed line in (E) shows the location that has the highest axial position. YV: yolk sac vessel; VV: vitelline vein; SV: sinus venosus; PA: primitive atrium; PV: primitive ventricle; BC: bulbus cordis. Scale bars are 200 µm. Reproduced from [18].

Получение биомеханических OCT изображений эмбрионов в основном используется при изучении сердца, включая оценку эластичности [34,70–72] и анализ сдирающего стресса (shear stress) [63,66,67,73–75]. Изображения высокгоо разрешения и измерения эластичности с помощью OCT могут в принципе внести новое механистическое понимание тканей и клеток, ранее недоступное [76,77]. Базирующаяся на OCT эластография сердца эмбрионов прежде всего отражает вызываемые сокращениями напряжения как контрастный механизм. В частности, напряжения, измеряемые как изменения толщины стенки сердца, которая обратным образом связана жесткостью ткани [34]. Т.к. сократительные силы или давление, прикладываемое к стенке сердца во время перекачки является неизмеримым и обладает зависимыми от времени и cross-sample вариациями, то измерения натяжения остаются качественными, при этом анализ в основном сконцентрирован на индивидуальном сердце. Новые методы способны определять давление на кардиальную стенку и они д. быть скомбинированы с OCT для количественной эластографии. Помимо базирующегося на напряжении контраста, возможно определение распространения пульсовых волн в эмбриональном тракте оттока и их скорости [53,78], это может быть в принципе использовано для подсчета механических свойств тракта оттока [79]. Альтернативой многообещающему методу без использования меток для эмбриональной механобиологии является анализ межфотонных взаимодействий (см. Section 2.3). Измерения сдирающего воздействия на стенки сердца, вызываемое ламинарными токами крови осуществляется посредством пространственного анализа скорости тока через сердечную трубку на поперечных срезах [63,66]. Так, 4D картирование shear stress в эмбриональном сердце перепела осуществлено Peterson et al. [73], которые получили динамические визуализации и достигли понимания пространственно-временных вариаций сдирающих сил, прикладываемых к сокращающемуся эмбриональному сердцу. Расчетная гидродинамика также была использована для осуществления картирования сдирающих стрессов на стенку сердца [67,75]. Базирующийся на OCT анализ сдирающего стресса был использован в ряде исследований для изучения гемодинамических изменений эмбрионального сердца во время развития, а также в ответ на разные стимулы и манипуляции, симулирующие врожденные пороки сердца [68,80–83].

Optical coherence microscopy (OCM), как комбинация OCT и конфокальной микроскопии, обеспечивает улучшенное поперечное разрешение с высокой числовой апертурой объектива [84]. OCM обеспечивает наивысшее пространственное разрешение с 3D разрешением, достигающим 1-2 µm при этом поддерживается глубина изображения ~0.5 mm [85]. В таком качестве OCM в основном используется для изучения преимплантационного развития [85,86]. В частности, процесс первого деления мышиной зиготы может быть расмотрне четко in vitro с помощью получения time-lapse OCM изображений, которые включают очень детальную динамику ядер [85]. Недавно получение OCM изображений преимплантационных эмбрионов было осуществлено in vivo внутри яйцевода мыши, это может быть использовано для мониторинга преимплантационного развития у млекопитающих в естественной среде [86]. Кроме того, получение OCM изображений эмбрионального сердца Drosophila продемонстрировало количественные определения скорости сердца, конечный систолический и диастолический диметр и фракцию сокращения [36,87]. Поскольку OCM базируется на том же самом механизме контраста, что и OCT, то получение функциональных OCM изображений, таких как ангиография, оказывается возможным [88], это может быть в принципе использовано для получения функциональных эмбриональных изображений с улучшенным пространственным разрешением.

Как вибрационная спектроскопическая техника, Raman spectroscopy получает молекулярную информацию путем анализа Raman рассевания фотонов с помощью молекул, при котором избыток или недостаток энергии вызывает сдвиг рассеивания частоты света [89]. При этом пики в спектре идентифицируют разные молекулы, информация о картировании Raman спектра продуцирует микроскопические изображения 3D распределения специфических молекул в ткани в виде Raman microscopy (RM) [90]. В целом, RM достигает пространственного разрешения за счет интеграции Raman спектроскопии с существующей микроскопической техникой, такой как конфокальная микроскопия, тем самым позволяя получать изображения с разрешением в глубину и достижением sub-micron разешения, которое ограничивается оптической дифракцией [91]. По сравнению с базирующимся на флюоресценции получении молекулярных изображений, RS привлекательна благодаря своему анализу без использования меток, минимальных усилиях для приготовления выбор и одновременном получении больших количеств данных по молекулярному составу. Это позволило ряду групп использовать RM получения необходимой молекулярной информации у эмбрионов [92–94].

Как было установлено, RM предоставляет очень богатую молекулярную информацию о развивающемся эмбрионе, Nakamura et al. показали, что расположение и структура дифференцированных мышц и энтодермы могут быть точно установлены у всего эмбриона Ciona intestinalis в ходе раннего развития [93], как показано на Fig. 3. Получение динамичных изображений липидных капель у эмбрионов ранних стадий было основным при использовании RM в биологии развития, это демонстрирует недеструктивную природу, которая позволяет проводить продолжительный анализ [92]. Безусловно, с помощью coherent anti-Stokes Raman рассеивающей микроскопии, которая обладает существенно улучшенной чувствительностью и скоростью получения изображений [95], размера, количества и пространственного распределения липидных капель, которые могут быть количественно охарактеризованы в живых преимплантационных эмбрионах мыши без внесение нарушений в ход развития [94]. Ряд Raman спетроскопических анализов был осуществлен на эмбрионах для изучения специфических биомаркеров для определения потенциала развития [17,96] и диагностики дифференцировки стволовых клеток [97]. Уровни безопасности воздействия Raman лазера на ранние стадии развития эмбрионов мыши исследуются систематически [98].

Fig. 3. RM imaging of the Ciona intestinalis embryo from two-cell stage to tailbud stage at the bands of 1002 cm?1 and 1526 cm?1. (A-J) Confocal images of the embryos for references. (A’-J’, A’’-J’’) Corresponding RM (right) images at 1002 cm?1 and 1526 cm?1, respectively. Bright-field images (left) are provided as reference, as the embryos are bilaterally symmetrical. Red lines in D’-G’ and D’’-G’’ outline presumed cell borders. A: anterior; P: posterior; L: left; R: right; a: animal; v: vegetal; Mus: muscle; Endo: endoderm. The colors in the images represent the Raman intensity at corresponding bands with red for the highest intensity and black for zero. Scale bars are 20 µm. Reproduced from [93].

Др. нелинейной спектроскопической техникой является Brillouin спектроскопия, определяющая Brillouin рассеивание света, которое является взаимодействием световых волн с gigahertz-частотами акустических волн (phonons), а возникающий в результате сдвиг частот света отражает высоко-частотные модуль выборки, определяя эластические свойства материала [99,100]. Brillouin microscopy (BM) ведет себя как техника получения спектроскопических биомеханических изображений [101], благодаря значительно сниженному времени предоставления данных сдвига частот Brillouin. BM быстро стал привлекательным подходом по получению механистических характеристик с высоким разрешением для массы биологических выборок [102] , а также для субклеточных компонентов [103]. Путем использования конфокальной конфигурации, BM может предоставлять глубокого разрешения 3D картирование на микро-шкале тканевого longitudinal modulus [104,105], это чрезвычайно ценно для изучения жесткости эмбриона. В частности неинвазивная и беконтактная природа BM очень подходит для деликатных эмбриональных тканей.

Использование в области биологии развития в основном сфокусировано на эмбрионах мышей и рыбок данио [99,106–108]. Среди них, 2D эластография возможна и на эмбрионах мышей на 8.5 день эмбриогенеза, демонстрируя самостоятельные механические свойства у разных органов [106]. В частности, для нервной трубки, BM изображения выявляют пространственный градиент вдоль длины модуля в дорсо-вентральном направлении, как показано на Fig. 4, и также подтверждают увеличение жесткости нервных складок в ходе развития [107]. Недавно было продемонстрировано, что BM способна определять механические свойства разных анатомических структур эмбрионов рыбок данио и также отслеживать изменения механических свойств во время развития и восстановления повреждений спинного мозга [108]. По сравнению с широко используемым методом аспирации пипеткой для измерения жесткости эмбриональной ткани [109], BM свойства обнаруживают преимущества своей неинвазивностью оценки, это позволяет осуществлять повторные и длительный анализы.

Fig. 4. BM of the neural tube at three locations from a mouse embryo at embryonic day 9.5. (A-C) BM images of the neural folds and ectoderm (left) with the corresponding quantifications of the Brillouin shift (right) showing the spatial gradient of longitudinal modulus as well as the relatively lower stiffness from the ectoderm. Scale bars are 100 µm. Reproduced from [107].

Second and third harmonic generation (SHG and THG) микроскопия базируется на нелинейном когерентном рассеивании с конверсией двух или трех входящих фотонов, соотв. , чтобы энергию одного фотона удвоить или утроить [110,111]. В отличие от мультифотонной флюоресцентной микроскопии, которая базируется на механизме возбуждения, SHGи THG обладает энергией фотона полностью законсервированной, приводя к существенному снижению фотообесцвечивания и нагревания. SHG процесс чрезвычайно специфичен к упорядоченным не centrosymmetric молекулярным структурам, давая хорошо различимые контрастные изображения определенных клеточных и тканевых компонентов, таких как коллаген, микротрубочки и мышечный миозин [112–114], это очень подходит для оценки эмбрионов. В противоположность высокой специфичности SHG, процесс THG происходит на структурах интерфейсов, напр., на клеточных мембранах, и тем самым исследуется несовпадения в индексах рефракции [111]. Как результат изображения эмбрионов с помощью THG микроскопии в основном используются для получения общей структурной информации.

SHG микроскопия была использована для получения изображений мышечной архитектуры и системы трахей у эмбрионов Drosophila [115]. Также, interferometric SHG изображения были использованы для изучения полярности расположения микротрубочек в митотическом веретене эмбрионов рыбок данио, которое указало на новый путь для понимания роли полярности микротрубочек в процессе раннего развития [116]. недавно, SHG микроскопия была использована для получения 3D изображений фибриллярной структуры в сердце эмбрионов мышей, показав изменения во времени и пространственную гетерогенность фибриллярного содержимого и организации в сердце [117], как показано на Fig. 5. Так, количественный анализ SHG изображений Mlc2a мутантных эмбрионов мыши со снижением сердечных сокращений, показал самостоятельные фибриллярные сети [117]. Т.к. THG сигналы прекрасно выявляют клеточные мембраны, то THG микроскопия в основном используется для отслеживания клеток, как, напр., ранние клеточные деления у эмбрионов Caenorhabditis elegans [118] и для измерения скорости кровотока у эмбрионов лягушек [119].

Fig. 5. SHG imaging of fibrillar structures in the mouse embryonic heart at embryonic day 8.5. (A) 3D reconstruction of SHG image of the entire heart, including the primitive atrium, primitive ventricle, and outflow tract. (B, C) Cross-sectional visualizations at the locations shown in (A). (D-F) Zoom-in visualizations at (D) the outflow track and (E, F) the ventricle from the locations labeled in (A). (F) presents 15 µm below the heart surface. Reproduced form [117].

Получение изображений с комбинированием SHG и THG широко используется для изображений эмбрионов. В частности, для мышиных эмбрионов со ст. двух клеток до ст. бластоциста, скомбинированная SHG и THG микроскопия способна идентифицировать критически субклеточные структуры, такие как zona pellucida и внутренняя клеточная масса [120]. Также количественные измерения клеточного поведения внутри клеточного клона эмбрионов рыбок данио в течение первых 10 циклов клеточных делений осуществляется посредством получения комбинированных SHG и THG изображений [121]. В частности, внутренне присущие THG сигналы прекрасно подчеркивают клеточные контуры (Fig. 6), это позволяет делать высоко качественные наблюдения за динамикой процесса развития [121]. Для улучшения пространственного разрешения, используется адаптивная оптика с SHG и THG микроскопией для получения изображений эмбрионов [122–124], получения характеристик с высоким разрешением динамических событий, таких как поведение липидных капелек у предимплантационных эмбрионов мыши [123]. Fig. 6. THG imaging of the zebrafish embryo at 64-cell and 512-cell stages. (A) Image of 512-cell embryo with the animal pole to the top. (B, C) XY image and (E, F) XZ image of 64-cell embryo with (B, E) blastoderm cells and (C, F) yolk platelets. Light is delivered through a lens of 0.8 numerical aperture. (D) XY image of blastoderm cells. Light is delivered through a lens of 1.2 numerical aperture. Scale bars are (A) 200 µm, (B, C, E, and F) 50 µm, and (D) 30 µm. Reproduced from [121].

В противоположность технике, базирующейся на рассеивании, которая осуществляет оптическое секционирование для 3D реконструкции, optical projection tomography (OPT) базируется на принципе компьютерной томографии, где используется алгоритм filtered back-projection для 3D реконструкции из сырых проекционных данных в разных ориентациях [125]. Предложенная в 2002 [6], OPT стала главным подходом получения эмбриональных изображений в биологии развития, благодаря его исключительному свойству изотропного пространственного разрешения ниже 5 µm и глубине изображений свяше 10 mm [125]. Существует два типа способов получения OPT изображений: трансмиссионная OPT (или bright-field OPT) , где контраст возникает в результате абсорбции света образцом и эмиссионная OPT, которая различает или сигнал аутофлюоресценции или флюоресцентного окрашивания образца [126]. В то время как базирующаяся на флюоресценции OPT является чрезвычайно используемым подходом для изучения паттерна 3D экспрессии генов со всего эмбриона [127–130], не использующая меток базирующаяся на абсорбции OPT является важным подходом для получения со всего эмбриона анатомических изображений, важных для понимания морфологии органов [131].

Не использующее меток получение OPT изображений в основном сфокусировано на эмбрионах мышей [15,132]. В частности, Singh et al. осуществили систематический сравнительный анализ OPT в сравнении с OCT на эмбрионах на ст. эмбриогенеза 9.5, 11.5 и 13.5, продемонстрировав присущие преимущества OPT и её пригодность для получения изображения всего эмбриона крупного размера [132]. Недавно сравнительное исследование OPT с micro-CT подтвердило, что высокое пространственное разрешение, эндогенный контраст от абсорбции света и большое поле зрения делают OPT очень подходящим для получения лишенных меток изображений эмбрионов мышей [15]. В частности, сегментированный атлас и количественная оценка объемов 12 разных крупных органов эмбрионов мыши были получены на день эмбриогенеза 11.5, а сегментация костей была получена и на день эмбриогенеза 16.5, (Fig. 7) [15]. Не использующая меток OPT была также использована для получения изображений ранней стадии эмбрионов человека, с упором на развитие головного мозга, показавшим, что многие структуры нервной системы могут быть различены и идентифицированы в 3D [133].

Fig. 7. Label-free OPT imaging of the mouse embryo with organ segmentation and quantitative volume measurements. (A) 3D segmented images of the mouse embryo at embryonic day 11.5. (B) Individual segmented organs highlighted from the embryo image. (C) Quantitative analysis of the organ volume. (D) 3D image of the mouse embryo at embryonic day 16.5. (E) Segmented bone highlighted from the embryo image. (F) Detailed 3D visualization of the bone structures. Scale bar in (A) is 2 mm. Reproduced from [15].

Из-за врожденной потребности рассеивание д. быть минимизировано для трансмиссии OPT изображений. Это может быть посредством оптического просветления для крупных плотных образцов, таких как эмбрионы мыши на поздней стадии [134]. Такая потребность предупреждает OPT от использования живых динамичных изобажений целых эмбрионов мыши. In vivo не использующие метки OPT изображения были продемонстрированы для биологических образцов, которые довольно прозрачны или малого размера (1-2 mm), включая Caenorhabditis elegans [135], рыбок данио [136], и эмбрионы Drosophila ранних стадий [137]. Поскольку количество угловых проекций предопределяет качество реконструкций, получение желаемых OPT картин, обычно в ущерб скорости, то это приводит к др. ограничениям, не позволяющим фиксацию быстрых движений и страдающих от двигательных артефактов. Были разработаны разные методы преодоления таких ограничений, такие как подходы по коррекции или компенсации движений [135] и интеративный алгоритм для уменьшения потребного минимума в количестве угловых проекций [136]. Также посредством комбинирования ex vivo живой ткани, культивируемой с помощью OPT, получение изображений вживую ранних стадий органогенеза мышей было достигнуто с упором на зачатки конечностей [138], которые проложили путь для ex vivo получения вживую 4D OPT изображений органогенеза у мышиных эмбрионов [139].

Photoacoustic tomography (PAT) базируется на фотоакустическом эффекте. Она реконструирует позиции абсорбции света путем зондирования последовательно генерируемых акустических волн [140]. Благодаря низкому рассеиванию акустических волн в тканях, PAT обладает преимуществами оптической абсорбции как ballistic, так и диффузных фотонов, и тем самым способна получать без использования меток изображения высокого разрешения с расширением вглубь [141]. Поскольку сигнал возникает в результате абсорбции света, то PAT обеспечивает богатые эндогенные контрасты для изображений разных биологических компонентов при использовании разных оптических длин волн [142], таких как гемоглобин, меланин, ДНК/РНК, липиды и вода. Учитывая преимущества различий в спектрах абсорбции oxy- и deoxy-hemoglobin, PAT позволяет не только получать структурные изображения сосудистой сети и функциональные изображения циркуляции крови, но и насыщенность кислородом и метаболические картины потребления кислорода [143]. Два применения PAT использовали для эмбриональных изображений: photoacoustic computed tomography (PACT) и photoacoustic microscopy (PAM). PACT используют для расширения оптического пучка и построения ультразвуковых трансдукторов для получения 3D изображений с сантиметровым уровнем проникновения изображений в глубину и пространственным разрешением обычно в десятки и сотни микрон [144]. Как и микроскопической технике PAM использует co-focused оптическое возбуждение и детекцию звука, чтобы достичь пространственного разрешения микро-шкалы с проникновением вглубь на миллиметровом уровне [145].

Сверхглубокое проникновение PACT, при получении in vivoизображений эмбрионов внутри беременных мышей на день эмбриогенеза 15.5 [146], продемонстрировано на Fig. 8. Хорошо прорисованная сеть эмбриональных кровеносных сосудов показывает мощный потенциал фенотипического анализа in vivo васкулогенеза и ассоциированной с ним патологии [146]. PACT также был использован для получения картин насыщения кислородом развивающегося эмбриона у беременных мышей in vivo [147]. Этот подход обеспечил количественный анализ и продолжительную оценку на ст. эмбриогенеза 8.5-16.5 [147], это является многообещающим для длительного in vivo функционального исследования развития эмбрионов млекопитающих. Помимо мышиной модели, интегрированные PACT и OCT представили in toto изображения эмбрионов кур с помощью комплементраного контраста от рассеивания и абсорбции [148].

Fig. 8. In vivo PACT imaging of the embryo in the pregnant mouse at embryonic day 15.5. (A) Maximum intensity projection of the 3D PACT image showing the embryonic vasculature indicated in red. The red-color labeling was obtained through volume segmentation of the 3D data followed by fused color volume rendering. (B-G) PACT images at different depth ranges from (A). Reproduced from [146].

Использование PAM для получения изображений эмбрионов в основном касалось рыбок данио [149]. В частности, формирование кардио-церебрососудистой сети было исследовано с помощью optical-resolution PAM [150], которое позволило проанализировать сосудистые фенотипы у моделей болезней, такие как эффекты противо-ангиогенных лекарств на развития сосудистой сети [151]. Постоянно предпринимаются попытки улучшения пространственного разрешения PAM [145], которые демонстрируются получением тонких изображений эмбрионов рыбок данио согласующиеся с пространственным разрешением для всего тела [152]. Обладая сходными шкалами получения изображений с OCT, свойства PAM контраста от самостоятельной оптической абсорбции делают его пригодным для использования в получении изображений васкулатуры и связанных с melanin изображений во время эмбрионального развития.

Помимо гемоглобином и меланином обеспечиваемого контраста, существуют и др. эндогенные контрастирующие агенты PAT, хотя они пока не были использованы для получения эмбриональных изображений, обладают огромным потенциалом для мульти-контрастных изображений на разных шкалах. Так , ДНК и РНК обладают строгой оптической абсорбцией около 260 nm, ультрафиолетового света, клеточные ядра могут изображаться с хорошим соотношением contrast-to-noise при использовании PAM [153]. Однако, для получения потенциальных изображений эмбрионов вживую, используемая энергия лазера и область иллюминации д. быть тщательно исследованы и оптимизированы, чтобы избежать тканевых повреждений, вызываемых ультрафиолетовым светом. При использовании почти инфракрасного света, липиды (1210 nm и 1730 nm), вода (975 nm) и коллаген (1725 nm) может быть обнаружены внутри биологической ткани [154–156]. С помощью мультиспектральной PAT, контраст может быть ещё больше усилен при использовании нескольких длин волн в соотв. спектре абсорбции [157]. Эти контрасты в комбинации с многими шкалами изображений PAT может представлять огромный интерес для изучения эмбрионального развития разных органов, таких как сердце и головной мозг.

Оптическое рассеяние (линейное и нелинейное) и абсорбция являются двумя основными механизмами получения контраста для получения изображений эмбрионов без использования метками. Современные техники получения оптических изображений, базирующиеся на др. эндогенных оптических контрастах, также используются для изучения вопросов биологии развития. Одна из них это фазово-контрастная микроскопия, не использующая метки техника для биологических образцов, которые слабо рассеивают или абсорбируют свет, таких как преимплантационные эмбрионы. Базируясь на трансмиссионной bright-field микроскопии, фазовый контраст получается за счет согласованности (coherence) световой интерференции, позволяющей различать компоненты клеток, которые относительно прозрачны. Quantitative phase imaging (QPI), как метод улучшенной фазово-контрастной микроскопии, привлекает интерес её способность количественного измерения клеточной динамики на нанометровой шкале в 3D посредством quantifying оптической фазы [158]. QPI было использовано для разных типов клеток с упором на понимание организации нервных сетей [159], оценивая одновременно клеточную подвижность и рост [160], а также измеряя клеточную механику [161]. Недавно QPI было использовано для изучения жизнеспособности in vivo эмбрионов телят с помощью получения 3D label-free изображений деталей клеточных структур [162], подтверждая пригодность для изучения развития предимплантационных эмбрионов.

Как показано в Table 1, сходные способности в получении изображений существуют между способом получения изображений без меток в биологии развития. Необходимо подчеркнуть и их специфические различия. OCT и OPT обе дают структурные и морфологические изображения органогенеза с разрешением на микро-уровне. Однако, OPT достигает более высокой глубины изображения, это позволяет видеть эмбрион в его полном размере. Напротив, только OCT исследует структуру, которая закрыта поверхностью. Однако, OCT имеет преимущество в получении живых динамических изображений, которые обычно недостижимы с помощью OPT из-за процедур фиксации и просветления [54,132]. Для получения изображений васкулогенеза и ангиогенеза PAT непосредственно использует оптическую абсорбцию гемоглобина и может обеспечить volumetric реконструкцию глубоких частей ткани, тогда как OCT получает изображения сосудистой сети посредством функционального анализа кровотока с относительно ограниченной глубиной. Одним из преимуществ OCT является её способность получения одновременных изображений сосудистой сети вместе с высокого разрешения структурой ткани [58], это обычно недостижимо для PAT. Для получения биомеханических изображений эмбриональных тканей базирующаяся на OCT эластография нуждается в соотв. загрузке, чтобы быть доставленной в необходимое место без повреждения эмбрионов. Для сердца активные сократительные силы действуют как естественная нагрузка, позволяющая OCT оценивать напряжение и скорость напряжения в стенке сердца [34]. Однако, для др. органов и тканей получение биомеханических изображений с помощью OCT будет ограничено из-за отсутствия подходящих методов нагрузки. В отличие от OCT, BM не нуждается во внешних нагрузках и может поэтому теоретически использоваться для любой эмбриональной ткани, где Brillouin рассеиваемый свет могут быть зарегистрирован. BM это новейшая техника и только недавно была использовано в немногих исследованиях эмбрионов [106–108], но поскольку важность механических факторов становится всё очевиднее для эмбрионального развития [163], то ожидается быстрый рост использования BM в биологии развития.

По сравнению с флюоресцентными изображениями, главным преимуществом получения оптических изображений без применения меток является удобство и легкость приготовления образцов [164]. Также нет необходимости рассматривать вопрос связи с фотообесцвечиванием и фототоксичностью [13,14], что позволяет достигать высокого временного разрешения и большей продолжительности получения динамичных и time-lapse изображений. С др. стороны, флюоресцентные изображения обладают повышенным контрастом и способны различать множественные компоненты с выдающейся специфичностью. В особенности недавние преимущества следующего поколения light-sheet микроскопии позволяют увеличить поле зрения, повысить разрешение и быстро получать изображения и обещают разрешить традиционные ограничения, связанные с флюоресценцией [165–167]. Комбинация получения флюоресцентных и не использующих метки изображений могут предоставлять дополняющую др. др. информацию по другому недосягаемую каждым индивидуальным подходом [168].

Важно отметить, что многие техники не использующие метки также могут использовать флюоресцентные маркеры [127,169,170]. Напр., способность получения молекулярных изображений PAT, как было установлено, является обещаюшей перспективой по отлавливанию флюорохромов и генетически кодируемых репортеров с беспрецедентной глубиной и разрешением [171–174]. Т.о., может оказаться возможным получение как меченных, так и не меченных изображений с помощью одного подхода, максимизируя контраст и информацию.

Поскольку процессы развития очень разнообразны, то один тип контрастных изображений может давать ограниченную информацию, поэтому подходы получения мульти-модельных изображений становятся популярной тенденцией для мульти-контрастного фенотипического анализа эмбрионов [175,176]. Напр., OCT и спектрально кодируемая конфокальная микроскопия были использованы вместе, чтобы оценить микроструктуру сердца эмбрионов мыши [51], BM и OCT предоставляют биомеханическую и структурную информацию для нервной трубки эмбрионов мыши [106,107], а интегрированная система OCT и PAT предоставляет преимущества тканевого структурного контраста, чтобы дополнять изображения сосудистой сети [148]. Не использующие метки оптические изображения комбинировали с ультразвуковыми изображениями для ultrasound-guided анализа насыщения кислородом гемоглобина тканей плодов мыши [147], а также получение флюоресцентных изображений одновременно с получением больших количеств клеточной информации от эмбрионов рыбок данио [121].

Интегрированные оптические изображения с техникой эмбриональных манипуляций ещё одна область применения. В частности, OCT-наводимые микроинъекции в эмбриональную сосудистую сеть предоставляют возможность изучать динамику кровотока до начала циркуляции кровяных клеток [42]. Интегрированная оптогенетика и система OCM подходит для динамической характеристики с высоким разрешением оптогенетического контроля сердца эмбрионов Drosophila [177]. Физическое объединение отслеживания кардиального оттока у эмбрионов кур использовали вместе с OCT для изучения возможного механического вклада в ассоциированные пороки сердца [68,78]. Также оптическая стимуляция была использована для индукции усиления regurgitant тока в эмбриональном сердце кур и OCT для получения изображений и измерения тока и кардиальной морфологии, это позволило выявлять дефекты эндокардиальных подушек при сильном regurgitant токе [35].

разные модельные животные были исследованы с помощью получения оптических изображений без использования меток [178,179]. Эмбрионы определеннрых модельных организмов, таких как рыбки данио и Drosophila, нуждаются в минимальной обработке и поддержании для получения изображений вживую. Напротив, модели млекопитающих, такие как мыши, нуждаются в оптимизации культивирования эмбрионов для получения изображений вживую [180]. Поэтому разработка эффективных протоколов для культивирования живых оказывается критическим фактором для получения оптических изображений вживую эмбрионов мыши. Мыши - единственный организм млекопитающих с хорошо разработанной стратегией генетического инженеринга для генерации разных модельных болезней, включая врожденные дефекты [181,182]. Существует драматическая необходимость в анализе фенотипических изображений созданных моделей. Возрастает интерес к разработке высокопроизводительных подходов для получения изображений эмбрионов мышей в высоком разрешении.

Улучшения в автоматизации сигнала и преобразования изображений - др. важный аспект. Сложные алгоритмы реконструкции были разработаны для преобразования 3D визуализаций в эффективное и даже в реальном времени изображение [183]. Методы автоматизации преобразования данных снижают временные и трудовые затраты особенно важны для крупномасштабных проектов фенотипирования эмбрионов [184]. В приложениях по получению эмбриональных изображений недавно разработанные deep-learning методы были использованы для автоматического сегментирования сердца Drosophila на OCM изображениях [87], важных для понимания механизмов регуляции эмбрионального развития.

Способность получения изображений с помощью оптической техники без использования меток может предоставить уникальную возможность решения ряда вопросов биологии развития, которые трудны для изучения с помощью др. методов. Так, сердце подвергается драматическим морфологическим изменениям на ранней ст. развития, которые выявляются с помощью сканирующей электронной микроскопии [185]; однако, лежащие в основе функциональные и биомеханические аспекты морфогенеза предстоит ещё выяснить [186]. На ранних стадиях сердце лишено клапанов и механизм прокачки представляет огромный интерес [187]. Хотя предложены разные модели, унифомная теория пока не сложилась, как трубчатое сердце эмбриона качает кровь, остается открытым вопросом. OCT предоставляет volumetric и одновременные изображения кардиодинамики и гемодинамики в раннем эмбриональном сердце без использования меток [18,188]. Это делает возможным количественный анализ кровотока в комбинации с движениями стенки сердца, что обещает новую информацию о механизме прокачки. Предыдущие характеристики были в основном осуществлены на модельных рыбках данио с помощью конфокальной флюоресцентной микроскопии [189,190]. OCT с глубокой пенетрацией делает возможным volumetric анализ прокачки на мышиной модели. Сконцентрировавшись на кардиальной эластичности, ясно, что внеклеточный матрикс играет существенную роль в определении жесткости раннего эмбрионального сердца, создаваемой механическим окружением кардиомиоцитов [191]. В погоне за пониманием того, как shear и сократительные силы регулируют жесткость сердца и отложения внеклеточного матрикса во время развития, получение SHG изображений кардиальной фибриллярной структуры с высокой специфичностью было использовано для соотв. и количественного фенотипического анализа [117]. Аномальное развития ЦНС вызывает др. крупные врожденные забеолвания. Изучение лежащих в основе механизмов главным образом сконцентрировано на молекулярно генетическом уровне [192], тогда как понимание процессов развития головного мозга в динамических, функциональных и биомеханических аспектах в основном отсутствуют. В связи с морфогенезом головного мозга, живые 4D OPT изображения [138] могут быть в принципе использованы для выявления этих процессов в культурах ex vivo, тогда как получение time-lapse 3D OCT изображений позволяет осуществлять количественную оценку динамики нервыных складок у культивируемых эмбрионов [54]. Для изучения ангиогенеза головного мозга 3D OCT ангиография позволяет получать label-free продольные изображения эмбриональной сосудистой сети in utero [193,194]. Закрытие нервной трубки как основной процесс образования нервной трубки, привлекает постоянно интерес в биологии развития [195] и биомеханике, как было установлено, недавно является важным фактором этого динамического процесса [196]. Интеграция BM и OCT позволяет одновременно выяснять морфологию нервных складок и картировать жесткость [107],это мощный инструмент для исследования пространственно-временных механических вариаций в ходе процесса закрытия. На предимплантационной ст. липиды играют важную метаболическую роль в эмбриональном развитии [197]. Специфические функции липидов остаются мало изученными [197]. В недавне работе разработаны методы для манипуляций с липидами у эмбрионов [198], а RM с его non-labeling природой может предоставить удобную и продолжительную оценку количества и пространственного распределения капелек липидов, и тем самым охарактеризовать функцию липидов в развитии.