После оплодотворения вновь сформированные зиготы подвергаются клеточным делениям, которые находятся под контролем матерями поставляемыми генными продуктами. Продолжительность стадии дробления варьирует у разных организмов и завершается с maternal-to-zygotic transition (MZT), в момент, когда происходит основная активация зиготического генома (ZGA) (rev. [1, 2]). У рыбок данио MZT происходит во время 10-го клеточного цикла [3], тогда как у мышей MZT происходит довольно рано на стадии двух клеток. Однако, в др. системах млекопитающих MZT происходит на более поздних стадиях развития, га стадии перехода от 4 к 8 клеткам у людей [4], и переход от 8 к 16-клеточной стадии у кроликов и овец [5].

У некоторых позвоночных, таких как лягушки и рыбы MZT совпадает с переходом от середины бластулы (MBT) [3, 6]. До ст. MBT, клетки делятся синхронно и лишены интервала между соседними фазами во время интерфазы клеточного цикла, это позволяет совершать более быстрые клеточные деления. Кроме того, отсутствуют КПП (checkpoints) клеточного цикла на ст. дробления перед MBT [3]. На ст. MBT клеточные циклы удлиняются, становятся асинхронными вместе с широко распространённой ZGA, начинается миграция клеток и онтогенетические процессы, такие как гаструляция и последующая epiboly. Однако, материнский доступ к функциям генов матери у позвоночных остается манящим из-за молекулярной геномной стабильности, хромосомной архитектуры и клеточной целостности во время этих быстрых делений, не контролируемых с помощью checkpoints, всё ещё плохо изучен.

Рыбки данио выступают как ценная молекулярно-генетическая модель для идентификации генов, важных для раннего развития позвоночных. Многие исследования сконцентрированы на целенаправленном действии на зиготические гены [7-9]. Недавний скрининг мутагенеза был предпринят для поиска материнских генов, действующих во время раннего эмбрионального развития [10-13]. Эти первоначальные скрининги выявили широкие категории мутаций с материнским эффектом, затрагивающими процессы от событий до оплодотворения, такие как полярность ооцитов [10, 14, 15], до процессов, возникающих послеe MBT, такие как эпиболия [13]. Эти поиски оказались успешными в создании коллекции мутантов с разными фенотипическими и генетическими классами, нарушающими процессы, важные для раннего развития позвоночных. Более того, эти скрининги привели к открытию новых генов и новых ролей для известных генов в контролируемых матерями процессах [16-22]. Однако, становится ясным, что ожидаемые гены, такие как регуляторы клеточного цикла, пока не обнаружены, демонстрируя, что поиски не исчерпали себя и предстоит ещё открыть новые материнские регуляторы эмбриогенеза стадии дробления.

Чтобы идентифицировать гены, критические для эмбриогенеза стадии дробления, мы вызывали ENU-индуцированный мутагенез генов с материнским эффектом у рыбок данио. Выявлено два класса мутантов, нарушающих ст. дробления. Первый класс обнаруживает нерегулярность дробления до MBT. Второй класс обнаруживает остановку развития примерно на ст. MZT и обнаруживает варьирующей степени дефекты ядер и хромосом. Третий класс мутантов, нарушал цитокинез и был описан ранее [22]. В ходе скрининга мы также идентифицировали и мутации стерильности самцов. Мы картировали каждую мутацию в дольно узком генетическом интервале. Мы позиционно клонировали мутанта с арестом развития p10umal и установили, что он кодирует Mini Chromosome Maintenance 3-like (Mcm3l), который является специфичной для матерей субъединицей helicase комплекса, участвующего в лицензировании синтеза ДНК. Кроме того, мы клонировали второй мутантный ген, вызывающий арест развития, screeching halt (srh) , выявленный при предыдущем скрининге [13] и установили, что он кодирует Stem Loop Binding Protein 2 (SLBP2). SLBPs соединяется с 3' UTR stem loop из связанных с репликацией гистоновых mRNAs и участвует в метаболизме гистонов во время S фазы клеточного цикла [23]. Мы показали, что гистоновые белки уменьшаются в количестве во время ст. дробления у мутантных эмбрионов srh и что фенотип srh ареста может быть устранен с помощью инъекций целого гистонового белка, демонстрируя тем самым, что Slbp2 необходим для поддержания достаточных уровней гистона во время ст. дробления. Мы идентифицировали гены с материнским эффектом, которые действуют во время ст. дробления и для двух генов получили молекулярную информацию о материнском контроле клеточных делений в этот период.

Table 1. Cleavage Stage Maternal-effect Mutants.

Мы картировали две мутации с арестом развития brambleberry (bmbp22atuz, [17]) и 10umal, неспособные подвергаться эпиболии и вызывающие лизис спустя 1 day post fertilization (dpf), подобно мутации screeching halt (srh) ([13]; Fig 1A).

Fig 1. Maternal-effect cleavage-stage mutants. A. Developmental arrest mutants and wild-type at 2.25 hpf (top row) and at 5.0 hpf (bottom row). For each mutant the phenotype is 100% penetrant within a clutch and across mutant females. At least 50 embryos per mutant female were examined (n = 233 from four srh females, n = 854 from six bmb females, n = 335 from four p10umal females). B. Irregular cleavage mutants and wild type at 0.75 hpf (top row), 1.0 hpf (middle row) and 1.25 hpf (bottom row). Five of 6 mxp females produced embryos shown (n = 459), while one produced embryos with a more mild phenotype (n = 91). C. Wild-type (top row) and cld mutants (bottom row) at 1.0, 1.5, and 4.0 hpf. Penetrance of the cell sloughing phenotype (black arrow) at 4.0 hpf is indicated in lower left corner. Remaining embryos retain relatively normal, but dark, blastoderms and do not survive to 24 hpf.

У трех мутантов с нерегулярным дроблением, mixed up (mxpp09batl), disarray (dsyp86batl) и p09ajug, ранние бластомеры формировались как нерегулярно расположенные и в виде клеток разного размера , возможно из-за асинхронности клеточных делений (Figs 1B and 6A). У dsyp86batl эмбрионов желток, по-видимому, проникает в расположенные выше бластомеры (Fig 1B, vertical arrows), а у mxpp09batl эмбрионов бластомеры сильно уменьшены в размерах (Fig 1B, horizontal arrows). У cloudy day (cldp40atuza) мутантных эмбрионов развитии напоминало нормальное до ст. в 1000 клеток, за исключением того, что были более темными (Fig 1C). После ст. в 1000 клеток существенная часть (64%) бластулы обнаруживала клетки отслаивающиеся от бластодермы, а сама бластодерма не имела клеточных мембран (Fig 1C). Наконец, один из мутантов стадии дробления ullahan (dulp15uzat), часто обнаруживал увеличенный цитоплазматический домен в нижней части бластодермы и спустя 24 hours post fertilization (hpf) обнаруживал вентрализованный фенотип (see below).

Fig 2. Examining nuclear integrity in mixed up and disarray embryos. A. Wild-type (TL), (B) dsy and (C) mxp embryos were fixed at 5-minute intervals spanning 20 minutes (corresponding to the 2 to 4 cell division) and stained with DAPI and phalloidin to mark the DNA and actin at the cell boundaries, respectively. B. Representative embryos (numbers indicated in the lower left corner) from a total of three dsy females. In some cases nuclear divisions were asynchronous (20 min) in embryos from dsy mutant mothers compared to wild type (A). C. Representative embryos (numbers indicated in the lower left corner) from a total of four mxp females. Embryos shown in the upper row underwent cell division timing similar to wild type in (A), whereas the embryos in the lower row were delayed. Scale bars = 200µm.

Fig 3. Nuclear division is disrupted in p10umal mutants. A. DAPI staining of wild-type and p10umal 8-cell stage embryos (n = 11). Note: only four of the 8-cells are in view. B. Wild-type and C. p10umal fertilization time courses (N = 3 females examined). Embryos were fixed at 16, 22, 25, 28, 31 and 34 mpf. A minimum of five embryos corresponding to each time point were examined (representative images are shown). Pronuclei (16 mpf) and the one-cell zygote (at 22-34 mpf) were stained with DAPI (blue), anti-phospho-histone H3 (red), and anti-PCNA (green). Scale bars = 10?m. The 25 and 28 mpf time points were digitally reduced by 0.5x. D. Schematic representation of the p10umal phenotype at the corresponding time points illustrating the typical DNA bridge between dividing cells. E. Wild type and p10umal mutants at 2.5 and 3.0 hpf stained with DAPI and phalloidin to mark DNA and the cell boundaries, respectively. A minimum of 3 and up to 6 embryos each from 3 different females were examined for each time point (representative images are shown).

Fig 4. p10umal encodes mcm3l. A. p10umal maps to chromosome 20 within a 1.1 Mb interval flanked by sc2029-2 and z42038. This interval contains 14 predicted ORFs (arrows). The black arrow (on the reverse strand) corresponds to mcm3l. The genomic structure of mcm3l is shown with 5' oriented to the left. Both alleles (p10umal and sa1624) are indicated. B. RT-PCR of mcm3 and mcm3l in a developmental profile. Stage is indicated at the top and slbp1 is used as a loading control.

Полученные данные подтвердили, что Mcm3l специфичный для стадии дробления компонент гексамера Mcm, который необходим для инициации репликации ДНК. Т.о., Mcm3l действует матерински во время ст. дробления, тогда как Mcm3 действует зиготически в ходе остального развития и у взрослых.

У p10umal эмбрионов нарушена сегрегация ДНК во время первого деления дробления (Fig 3C), дефект, похожий на нарушение синтеза ДНК. Интересно, что Mcm3 белок содержит функциональный сигнал ядерной локализации, тогда как материнский Mcm3l не содержит [28]. Действительно ли Mcm3l приобретает специфические функции во время стадии дробления, что возможно связано с повышенной скоростью клеточных делений и/или отсутствием checkpoints, специфичных для этого периода развития, необходимы дальнейшие эксперименты с p10umal трансгеном канонического mcm3.

Fig 5. dullahan mutant phenotype. A. Wild-type and (B) dul embryos at 3.5, 5.5, and 24 hpf. Embryos in upper left and center panels are lateral views and upper right panels are animal views. The enlarged cytoplasmic region between the yolk and blastomeres in the dullahan mutant at 3.5 hpf is noted with asterisks. The dorsal shield (arrow) is to the right in the 5.5 hpf wild-type embryo and absent in the mutant. C. Distribution of embryonic phenotypes from five dul females (left) compared to 6 siblings (right): mut #1 (n = 80), mut #2 (n = 71), mut #5 (n = 68), mut #6 (n = 32), mut #7 (n = 105), HET-A (n = 103), HET-B (n = 112, HET-C (n = 76), HET-D (n = 76), HET-A (n = 67), HET-A (n = 118), HET-G (n = 32). In each cross heterozygous or mutant females were crossed to wild-type (TL) males.

Полученные результаты показали, что спецификация дорсальных тканей сильно нарушена у эмбрионов dul. Т.к. край, отделяющий бластодерму от желтковых клеток значительно расширен у эмбрионов dul, то вполне возможно, что дорсальные детерминанты, которые возникают в vegetal регионе и активируют Wnt/β-Catenin путь передачи сигналов, необходимый для становления дорсального организатора [21] обнаруживают затруднения с их окончательным транспортом в дорсальный регион, приводя к вентрализации.

Fig 6. Dorsal markers are reduced in dullahan mutants. chordin mRNA expression in wild-type (A, A') and dul (B, B') embryos at 6.0 and 8.0 hpf, respectively. A and A' are animal views, dorsal to the right. B and B' are dorsal views. The number of embryos with the shown expression pattern of the total embryos examined is indicated in the upper right or left (inset) corner. goosecoid mRNA expression in wild-type (C, C') and dul (D, D') embryos at 6.0 and 8.0 hpf, respectively. The numbers in the lower right corner indicate the number of embryos with any positive goosecoid signal of the total embryos examined.

Fig 7. p09ajug is an allele of polo-like kinase-1. A. Embryos of p09ajug mutant females exhibit an irregular cleavage phenotype. B. The p09ajug mutation maps to chromosome 1 within a 700 kb interval flanked by SSLP markers, CU467110 and CU104756-4. C. Genomic structure of plk1 indicating the T to G change in the start codon. D. Homozygous p09ajug male sterility can be rescued with Tg(actb2:plk1). Each bar represents a different fish, where M = male and F = female. The first number in the fish name (6-, 4-, 5-) represents a particular fish family, with individual fish identifying information following that number. Total number of embryos scored is indicated at the top of each bar.

Зиготические нулевые аллели plk1 ведут к ранней эмбриональной летальности [32, 33]. Поэтому мы полагаем, что plk1p09ajug аллель является гипоморфной мутацией, которая обеспечивает достаточную зиготическую активность, но обнаруживает недостаточность функции для плодовитости самцов и материнской регуляции стадии дробления. Интересно, что расположение N-конца у позвоночных PLK1 гомологов обнаруживает относительно низкую консервацию по сравнению с большинством др. регионов белка (S2 Fig).

Мы генерировали трансген с beta-actin2 промотором, управляющим экспрессией plk1 (Tg(actb2:plk1)) на p09ajug мутантом фоне. Гомозиготные мутантные p09ajug самцы и самки, содержащие plk1 трансген были фертильны (Fig 7D) и самки давали нормальное потомство, демонстрируя, что Tg(actb2:plk1) может устранять действие p09ajug, делающее самцов стерильными вызывающее материнский эффект и нарушения развития у самок. Следовательно, p09ajug является гипоморфным аллелем plk1.

Plk1 участвует в созревании центросом и важен для обеспечения перехода от G2 к M клеточного цикла посредством активации Cdc25A phosphatase (rev. [34]). Показано, что Plk1 необходим для первого митотического деления у эмбрионов мыши [35]. Кроме того, потеря функции plk1 у C. elegans выявляет дефект объединения материнского и отцовского геномов во время оплодотворения, давая в результате кариотип "paired nuclei" [36]. Поразительно, этот фенотип сохраняется в и последующих митотических делениях во время раннего эмбриогенеза [36]. Показано, что дикого типа Plk1 необходим для формирования нового three-way мембранного соединения, которое способствует слиянию пронуклеусов у C. elegans [37]. Интересно, что эта структура обычно не образуется во время последующих соматических делений у эмбрионов дикого типа, это объясняет персистенцию двух ядер у темепературно-чувствительных plk1 мутантов [37]. Необходимо определить возможную роль plk1 во время объединения родительских геномов при оплодотворении у рыбок данио. Однако, аналогичная роль, скорее всего, является механистически отличной , поскольку слияние мембран кариомеров происходит во время раннего развития рыбок данио, которое нуждается в материнском белке Bmb [17]. Более того, что соотв. Bmb гомолог, по-видимому, отсутствует в геноме C. elegans [37, 38].

Мы исследовали молекулярную природу screeching halt (srhp18ad) мутантого гена, вызывающего сходные арест в средине бластулы, что и мутация mcm3l с материнским эффектом, p10umal. Мы позиционно клонировали ген srh и исследовали 1003 мейозов и картировали srh в интервале в 600 kb на хромосоме 21 (Fig 8A). Частота мейотической рекомбинации фланкирующих маркеров показала, что мутация располагается в третьем генетическом интервале проксимальнее zBX510945 (Fig 8A). Анализ последовательностей генов в этом регионе выявил замену оснований T на A в домене связывания РНК в гене stem loop binding protein 2 (slbp2), приводя к замене консервативного Isoleucine на Asparagine (Fig 8A and 8D).

Fig 8. screeching halt encodes SLBP2. A. The srh mutation maps to a 600 kb interval on chromosome 21 flanked by zBX510945 and zBX511168. Recombinants identified between the mutation and the marker per total meiotic events examined is noted below each marker in red. The interval contains 21 predicted ORFs (arrows). The black arrow (on the reverse strand) corresponds to slbp2. The predicted exon-intron structure is indicated below. Note: intron 3 (568 bp) and intron 5 (1961bp) are not drawn to scale (dashed lines) due to size. Mutations corresponding to srhp18ad (T to A, Iln to Asn) and srhsa12562 (C to T, Glu to stop) map to exon 4. B. The sa25162 allele fails to complement srhp18ad. Embryos from sa25162/+ females and ten p18ad/sa25162 trans-heterozygous females, with at least 50 embryos per female (n = 880), shown at 6 hpf. C. RT-PCR of slbp2 (top) and slbp1 (bottom) from wild-type cDNA (ovary, 32-cell and sphere stage). D. SLBP RBDs from zebrafish (zSLBP1 and zSLBP2), Xenopus (xSLBP1 and xSLBP2) and Bovine (bSLBP1 and bSLBP2) were aligned using Clustal Omega [53]. The Iln residue that is mutated to Asn in srhp18ad and the Glu residue that is mutated to a stop codon in slbp2sa12562 are boxed in red. The '*' indicates identical residues, ':' or '.' indicate similar residues.

Т.к. мутация srh кодирует миссенс-изменение Ile в Asp, мы попытались установить, что это повреждение, в самом деле, нарушает функцию SLBP2. Исследование коллекции ZMP выявило, что slbp2 аллель содержит преждевременный стоп-кодон [27]. Один такой аллель, sa25162, содержит замену C на T пару оснований в нуклеотиде 469 в ORF, превращая Gln157 в стоп-кодон (Fig 8A and 8C). Получены транс-гетерозиготные самки и изучено их потомство. Аллель slbp2sa25162 был неспособен комплементировать srhp18ad, и 100% мутантных эмбрионов давали фенотип ареста развития на ст. средней бластулы (Fig 8B; n = 880 from 10 trans-heterozygous females). Это демонстрирует, что фенотип srh обусловлен дефектом функции Slbp2.

Родственный SLBP1 белок участвует в процессинге и стабилизации транскриптов стержневого гистона и способствует трансляции гистоновых белков, продукция которых тонко регулируется по ходу клеточного цикла и репликации ДНК (rev. [39]). SLBP1 ассоциирует со специализированной cтруктурой stem loop, расположенной на 3' UTR стержневых гистоновых mRNAs. Его роль аналогична таковой у Poly-A связывающего белка, который стабилизирует и способствует трансляции транскриптов мРНК, содержащих poly-A. Slbp2 мРНК экспрессируется в основном в яичниках лягушек[40] и некоторых млекопитающих [41]. Было предположено, что SLBP2 у жвачных может накапливать значительные запасы гистоновой мРНК в ооцитах для последующих делений дробления в оплодотворенных яйцах [42]. Т.к. активация трансляции и доменов процессинга РНК не законсервированы в SLBP2 (S3 Fig), то это может быть достигнуто с помощью SLBP2 стабилизации и предупреждения массы гистоновых транскриптов с уже присутствующих транслированных во время оогенеза. Считается, что у Xenopus в дальнейшем, во время активации яйца, SLBP2 деградирует, делая возможной ассоциацию SLBP1 с 3' UTR stem loop, чтобы способствовать процессингу мРНК и трансляции стержневых гистонов [40].

Мы исследовали экспрессию мРНК slbp2 и slbp1 в яичниках и во время раннего развития рыбок данио. RT-PCR выявил экспрессию slbp2 в яичниках во время стадии дробления, на ст. 4 hpf (sphere stage), post-MBT стадии (Fig 8C). Сходным образом, экспрессия slbp1 была обнаружена на всех соотв. стадиях (Fig 8C), это согласуется с предыдущими данными, также показавшими, что slbp1, но не экспрессия slbp2 обнаруживается на поздней эмбриональной и личиночной стадиях [43, 44]. Потеря зиготической функции Slbp1 у рыбок данио ведет к нормальному раннему эмбриональному развитию, но вызывает дефекты развития сетчатки на ст. 2 dpf, помимо др. морфологических дефектов на ст. 3 dpf [44]. Следовательно, хотя slbp2 и slbp1 экспрессируются совместно в яичниках и во время ранней стадии дробления, они вызывают разные дефекты развития.

Затем мы исследовали, действительно ли нарушение функции Slbp2 затрагивает обеспечиваемые матерью уровни гистоновых белков во время раннего развития. Белковые экстракты были приготовлены из эмбрионов, полученных на стадии от 8-клеточной до 3.5 hpf стадии от дикого типа и srhp18ad самок подвергнуты western blotting. Антитела, которые специфически распознавали каждый из стержневых гистонов, показали, что H2A и H2B почти полностью отсутствовали в экстрактах из srh эмбрионов по сравнению с экстрактами из эмбрионов дикого типа на каждой из исследованных стадий, тогда как H3 и H4 были заметно редуцированы (Fig 9A; S4C and S4D Fig). Мы также исследовали уровни гистонов в неоплодотворенных яйцах. Как и в экстрактах эмбрионов, уровни H2B были достоверно снижены в неоплодотворенных яйцах, однако, H3 и H4 не были существенно редуцированы (S4A and S4B Fig). Эти результаты показывают, что Slbp2 участвует в продукции стержневых гистоновых белков на уровнях, которые действуют во время контролируемых матерью стадиях дробления. Т.к. Slbp1 экспрессируется во время материнского и зиготического периода (Fig 8C), низкие уровни стержневых гистонов, остающиеся в полученных от srh экстрактах, могут быть продуктами активности Slbp1. Более того, анти-H3 антитела могут также распознавать гистоновые варианты, такие как H3.3, которые полиаденилированы и не нуждаются в активности SLBP для экспрессии (т.e., не содержат 3' UTR stem loop). Это также может вносить вклад в низкие уровни H3, обнаруживаемые у srh мутантов.

Fig 9. Slbp2 is required for histone production during early development. A. Western blot analysis of the four core histones in wild-type and srh embryos. Anti-?-tubulin was used as a loading control. B. The srh developmental arrest phenotype can be rescued by injecting total histone protein into one-cell stage srh embryos. P-values were determined using a Student's t-test. ****p< 0.0001. srh embryos injected with 5 ng (C-E) or 7.5 ng (F-I) of whole histone. C and F, lateral views imaged at 5 hpf. D and G lateral views imaged at 6 hpf. E and H were imaged at 24 hpf. I was imaged at 48 hpf. Note the head formation and eye pigmentation in H and the presence of melanocytes in I.

Чтобы определить, действительно ли снижение гистоновых белков вызывает у srh остановку развития, мы вводили эмбрионам srh на ст. одной клетки все гистоны, происходящие из тимуса теленка, содержащего все 4 стержневые гистона. Не инъецированные или srh эмбрионы, которым вводили 3.5 ng всех гистонов никогда не инициировали эпиболию (Fig 9B). Напротив, существенная фракция эмбрионов, которым вводили 5 или 7.5 ng всех гистонов, инициировали эпиболию и доживали до ст. 1 dpf. Удивительно, некоторые доживали до 2 dpf (Fig 9B-9I). Эти данные показывают, что srh мутантны обнаруживают дефицит продукции гистоновых белков, это приводит к аресту их развития на ст. средней бластулы.

Интересно, что нокдаун SLBP в dsRNA трансгенных мышиных ооцитах также приводит к ранней остановке развития и это фенотипическое отклонение устраняется инъекцией гистоновых белков [45]. Недавно, He et al., использовали подход reverse генетики, чтобы исследовать функцию у рыбок данио SLBP2 путем генерации indel аллелей, используя CRISPR-Cas9 [43]. Они продемонстрировали частичное устранение хроматинового фенотипа у арестованных эмбрионов (описанное также у srh мутантов, [13]) путем внесения H2B трансгена в мутантный фон. Однако, внесение H2B было неспособно устранять арест развития, указывая, что, по крайней мере, один из стержневых гистонов обязателен, что, в самом деле, было подтверждено нами в экспериментах по восстановлению.

Подобно SLBP1, RNA binding domain (RBD) SLBP2 у рыбок данио сильно законсервирован в гомологах лягушек и млекопитающих (Fig 8D). Однако, вне RBD, последовательность менее консервативна (S3 Fig). Более того, у рыбок данио, телят и лягушек SLBP2 регионы, важные для активации трансляции [46] и процессинга РНК [47] не законсервированы (S3 Fig). Т.о., возможно, что SLBP2 служит для поддержания и стабилизации материнских гистоновых транскриптов и для предупреждения трансляции мРНК стержневых гистонов [40, 41]. В самом деле, He et al. показали сильное снижение транскриптов гистоновых белков, h2a, h2b, h3 и h4, в яичниках и на ст. дробления у рыбок данио, мутантных по материнскому аллелю slbp2 [43]. Неожиданно, мы обнаружили мало или отсутствие снижения белков H3 и H4 в неоплодотворенных яйцах , хотя четкое снижение демонстрируется на более поздних ст. дробления (Fig 9A and S4 Fig). Т.к. SLBP2 белок присутствует в ходе всего оогенеза и во время ст. дробления, он может быть смещен с помощью SLBP1, чтобы сделать возможной продукцию стержневых гистонов с материнских гистоновых мРНК или функцию совместно с др. белками, чтобы обеспечить их трансляцию. Наши данные согласуются с этой моделью, поскольку отсутствие материнского SLBP2 д. приводить к снижению стабильности гистоновых мРНК и соотв. к снижению уровней материнских стержневых гистонов. Этот регуляторный механизм важен для поддержания оптимального уровня стержневых гистонов во время дробления, т.к избыток или недостаток может нарушать нормальный ход MBT (see below).

Возможность того, что SLBP2 обладает боее прямой ролью в продукции гистонов, нельзя исключить полностью. Эксперименты с нокадуном трансгенных dsRNA на мышах показали, что функциональный SLBP необходим для гистона H3 и H4, но не для накопления H2A или H2B в ооцитах мышей [45]. Мsib имеют только одну функциональную копию Slbp, котороая в основном гомологична Slbp1, а Slbp2 вместо этого является псевдогеном у мышей [41]. Наши данные показывают, что Slbp2 необходим для накопления H2A и H2B и в меньшей степени для накопления H3 и H4 (Fig 9A and S4 Fig). Это в комбинации с присутствием slbp1 мРНК в ооцитах (Fig 8C), предоставляет возможность, что у рыбок данио Slbp1 может увеличивать продукцию H3 и H4, как это происходит в случае с SLBP у мышей. Необходимо отметить, что белок Slbp2 у рыбок данио (326 остатков) является более крупным, чем bSLBP2 (152 остатков) или xSlbp2 (250 остатков) (S3 Fig).

Недавно было продемонстрировано, что снижение или повышение эндогенных уровней материнских гистонов может приводить к преждевременной или задержанной ZGA, соотв. [48, 49]. В самом деле, три из семи протестированных зиготических генов не экспрессировались у мутантов srh [13]. Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы понять степень, с которой ZGA нарушено у srh мутантных эмбрионов, и степень, с которой концентрации материнских гистонов играет роль в обеспечении MBT.

Мы определили молекулярную природу двух мутантных генов с материнским эффектом, которые вызывали арест развития перед MBT и кодировали специфичные для матери белки, важные для хода клеточного цикла. Эти две мутации ареста развития вместе с третьей, brambleberry, вызывали арест одной и той же стадии средней бластулы, хотя вызывали сильно отличающиеся клеточные эффекты и кодировали разные факторы (Mcm3l, фактор инициации репликации ДНК; Slbp2 регулятор продукции гистоновых белков; Brambleberry регулятор слияния ядерных кариомер [17]). Они могут служить КПП (checkpoint) на этой стадии, которые вызывают арест или, напротив, каждый мутант может быть сходным образом лишен экспрессии ключевых зиготических генов, необходимых для инициации дальнейшего развития. Соответствует последнему то, что остановка развития на сходной стадии вызывается подавлением всеобщей транскрипции с помощью воздействия actinomycin D [50].

Итак, мы охарактеризовали 9 мутантов с материнским эффектом с дефектами разных стадий развития. Мутации были картированы по отношению к относительно узкому генетическому интервалу (Table 1) и некоторые из мутантных генов были клонированы. Установлены критические специфичные для матерей факторы, а также гипоморфный аллель более широко действующего фактора (plk1), который действует на ст. дробления, вызывая стерильность самцов и фенотип с материнским эффектом. Ещё один мутантный ген кодирует специфичный для матерей Stem Loop Binding Protein, который необходим для поддержания уровня материнских гистонов. Также выявлена новая мутация с материнским эффектом, которая позволяет выяснить молекулярные механизмы, регулирующие клеточные деления необычно крупных бластомеров во время checkpoint-free стадии дробления у позвоночных. Эти мутации расширяют наше понимание материнской регуляции раннего эмбрионального развития у позвоночных.