Область регенеративной медицины радикально продвинулась вперед со способностью получения human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Эти клетки получаются за счет генетического репрограммирования в окончательно дифференцированных клеток взрослых и могут затем поддерживаться бесконечно в in vitro культуре и могут дифференцироваться во все типы клеток взослого организма¹. Т.о., эти клетки предоставляют беспрецедентные возможности для изучения самых ранних стадий развития человека in vitro, чтобы смоделировать различные болезни человека, чтобы тестировать лекарства в культуре и в конечном итоге могут служить в качестве неограниченного источника клеток для будущих терапевтических вмешательств. Чтобы использовать эти потенциальные преимущества существенно обладать способностью контроля за дифференцировкой hiPSCs в соматические клоны с высокой эффективностью и воспроизводимостью^2,3.

Межклеточная гетерогенность является важным спорным фактором для профиля генотип-фенотип, доступного действием aCC-BY-NC-ND 4.0 здоровых и больных тканей.

Технологии анализа одиночных клеток исследуют подобную гетерогенность, чтобы понять клеточную, молекулярную и тканевую физиологию. В противоположность массе тестов, измерения гетерогенности с помощью метода изучения индивидуальных клеток обладают значительно более высоким разрешением и не требуют предварительных знаний о клеточных подтипах внутри выборки⁶.

Поведение отдельных клеток зависит от свойств сложных ниш, которые предоставляют широкое разнообразие биохимических и биофизических сигналов⁷. С целью выяснения и понимания поведения этих клеток необходим углубленный анализ, чтобы только посмотреть на поведение одиночных клеток и возможно субпопуляции клеток, которые существуют внутри кажущихся гомогенными тканей.

Быстро развивающаяся область, которая очень важна для анализа одиночных клеток - это микропотоки (microfluidics). Microfluidics означает науку, которая позволяет изучать и манипулировать флюидами (fluids) на микрометровой шкале⁸. В последние годы microfluidic системы стали основой многообещающих платформ для многих lab-on-chip (LOC) аппликаций во многих областях исследований, таких как химия, биология или engineering^9,10. Их главные преимущества заключаются в способности контролировать жидкости при ламинарных режимах, снижении количества реагентов и выборок, в более коротком времени анализа, снижении цены и портативности. Polydimethylsiloxane (PDMS) является наиболее используемым материалом для продукции microfluidic микро-устройств, поскольку он оптически прозрачен, биосовместим и легок в обработке.

Капельные microfluidic системы позволяют изолировать индивидуальные клетки в соединении с реагентом в жидких капсулах или picolitre монодисперсного гидрогеля, давая тысячи капелек в сек. Такие качества позволяют преодолевать многие препятствия при анализе одиночных клеток. Моно-дисперсность делает возможным количественный контроль концентраций реагента, тогда как капельная энкапсуляция предоставляет изолированный компартмент для одиночных клеток и их окружения.

Подобное высокое исполнение позволяет преобразовывать и анализировать десятки тысяч клеток, которые д. быть проанализированы и аккуратно описывать гетерогенность клеточной популяции, чтобы найти редко встречающиеся типы клеток или достичь достаточного биологического пространства, чтобы достичь успеха в целевом эволюционном эксперименте¹¹.

Функциональные геномные исследования, такие как трансфекция флуоресцентных маркеров, важны для выявления клеточных и молекулярных биологических феноменов¹² . При попытке создать стабильную клеточную линию, которая инкорпорирует конструкцию внутрь генома, технология PiggyBac, базирующаяся на системе переносимых мобильных генетических элементов недавно заложила основу как альтернативу классическим методам, таким как вирусная трансдукция. Короче, эта методология базируется на временной трансфекции плазмид с последовательностью, которая должна быть вставлена, фланкированной inverted terminal repeat sequences (ITRs) и ферменте transposase, которая катализирует интеграцию чужеродной ДНК между AATT хромосомными последовательностями. Эта методология представляется высоко эффективной у людей и в типах клеток др. млекопитающих^13,14.

В ответ на это были разработаны многочисленные техники, чтобы повысить эффективность трансфекций¹⁵. Индивидуализация клеток и изоляция их внутри капель на picolitre шкале, позволяет клеткам иметь более значительный контакт с реагентами и плазмидами, что соотв. повышает эффективность трансфекции. Однако, продукция сотен или тысяч капель может ограничивать оптимальную индивидуальную проверку исполнения (follow-up).

В данной работе мы разработали microfluidic систему из двух взаимосвязанных микро-устройств, которые обладают высокой производительностью во время индивидуализации клеток и низкими затратами по сравнению со сходными системами^16-18. Последние часто используют SU8 resin в качестве производственной базы, которая существенно более затратная, а одно микро-устройство для образования капель и хранения их, обнаруживает тенденцию к ограничению долговременной культивации и будущей клональной селекции. В отличие от методов, описанных выше, наш метод продукции хранимых микро-устройств использует PDMS многоуровневую систему, которая позволяет капелькам сохраняться в соответствии с размером и глубины производства.

Этот процесс состоит из двух стадий. Во-первых, микро-устройство, которое отвечает за генерацию монодисперстных капель, в которых находятся клетки (в нашем случае, hiPSCs) были отловлены вместе с плазмидами и трансфекционными реагентами. Во-вторых, часть, представленная многоуровневым микро-устройством, состоящая из тысяч колодцев, где хранятся капельки, позволяет эти клетки культивировать и в реальном времени отслеживать межклеточную трансфекцию и клеточную жизнеспособность в течение определенного времени. Кроме того, прирожденные преимущества позволяют длительное культивирование и использование многих аккуратных инструментов для наблюдения воочию за клетками. Мы очень надеемся, что относительно дешевые устройства смогут функционировать в качестве точки старта для последующего использования в более сложных системах трансфекции, доступных под патронатом aCC-BY-NC-ND 4.0 International license.

Briefly, the droplet storage microdevice was designed with a Layout Editor design editor software and transferred to the TIL with a 2400 ppi infrared laser source, then the TIL was laminated on the unexposed photopolymer plate, the photopolymer plate was exposed at UVA light at 0.45 J on the back for 10 s, a part of the photopolymer was covered with a mask plate on the back side, the photopolymer plate was exposed to UVA light at 0.45 J on the back side for 20 s, the previous exposures were repeated one at a time, finally the front side was exposed to UVA light at 19 J for 360 s, after the TIL was removed, the plate was washed with PROSOL N-1 solvent (supplied by Eastman Kodak) at 360 mm min -1 was dried in an oven for 30 minutes at 50 °C, the plate had a last exposure to UVC light at 10 J for 17 minutes and UVA light was applied at 4 J for 2 minutes on the front side With the mold manufactured briefly, a mixture of epoxy resin and curing agent (Cristal-Tack, Novarchem - Argentina) was poured over the female mold to replicate the design in high relief.

After curing, the epoxy resin mold (ERmold) was detached from the Fmold to form the male mold. Subsequently, a mixture of PDMS and curing agent in a 10:1 weight ratio (Sylgard 184 silicone elastomer kit, Dow Corning) was poured onto the ER mold and cured in an oven at 40 °C overnight. The same steps described for the droplet forming microdevice were used for assembly.

For the production of monodisperse droplets, the biocompatible oil FluoroSurfactant-HFE 7500 5% was used for the continuous phase, and for the dispersed phase the cells were used in suspension in mTeSR™1 (STEMCELL Technologies) medium with Rock Inhibitor (Y-27632) . The injection of the phases was performed using the infusion set Fullgen A22 (USA), with results for the continuous phase of 4.50 l / min - 6.50 l / min, and for the dispersed phase 1.75?l / min - 3.00?l / min. The average size of the droplets generated was 80 µm - 87 µm, then a tube was connected to the output hole of the producer microdevice and the inlet hole of the droplets storage microdevice was progressively increased to complete the storage volume. In order to release the cells that were encapsulated within the oil droplets. SIGMA 1H, 1H, 2H, 2H perfluoro-octanol (PFO) was used based on the protocols recommended²¹

Nikon SMZ645 Stereo Zoom Microscope and a Canon T3-I Rebel digital camera connected to the microscope were used to capture the droplets. The images were created from a stack of multiple acquisitions of microscopes in a large surface area of the microdevice. The analysis and quantification of the results obtained in the experimental phases were performed using the ImageJ software and R. available under aCC-BY-NC-ND 4.0 International license. (which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.09.143214; this version posted June 11, 2020. The copyright holder for this preprint

The hiPSC cell line used in this study was generated in our lab from adult male fibroblasts and was previously described²². Cells were regularly cultured in 6 well plates in E8-Flex medium with Geltrex coating (all Thermo Fischer Scientific). Cells were passaged every 2-3 days using Tryple until the moment of encapsulation and subsequent transfection. All of cells cultures were maintained at 37 °C in a saturated atmosphere of 95% air and 5% CO2.

To assess the transfection efficiency and to generate stable cell lines two plasmids were used²³. A first plasmid that encodes a CAG-mCerulean-H2B reporter together with a Neomycin resistance cassette, both flanked by ITR sequences. The second plasmid drives the transient expression of the PiggyBac transposase.

To measure cell viability after drop encapsulation and transfection, we used the Live Dead Assay kit (Thermo). Since the drop-based system differs according to standard culture techniques, we empirically determined that 5 times more reagent was required than recommended by the manufacturer. On the other hand, Hoechst 33342 was used for staining cell nuclei in living cells in order to measure transfection efficiency.

Сконструированная система microfluidic трансфекции одиночных клеток представлена на Figure 1A. эта система состоит из двух взаимосвязанных микроустройств и выводного канала. Первый продуцируют моно-дисперсные капельки, содержащие клетки, плазмиды и трансфекционные агенты, использующие flow-focusing систему. Эти потоки контролируются инфузионными насосами и контролирующим давлением. Второе микро-устройство состоит из двух слоёв PDMS, содержащих 3000 многоуровневых колодцев (wells), которые делают возможным отлавливание капель с высокой эффективностью, а отводящий канал возвращает их обратно. Кроме того, это двухслойное устройство делает возможным более высокий газообмен в сочетании с fluorinated oil (HFE-7500), это существенно помогает выживанию клеток²⁴.

Во-первых, была охарактеризована эффективность микро-устройств, чтобы оптимизировать нашу систему. Figure 1B показывает продукцию капелек в отводном канале сформированного микро-устройства. В целом 1000 капель среднего размера в 83 µm (Figure 1C). Скорость разбрызгивания составляла 6.50 ul / min для непрерывной фазы (oil) и 3.00 ul / min для дисперсной фазы (клеток, плазмид и трансфицирующих агентов). С др. стороны, определяли эффективность микро-устройства, которое сохраняет капельки (Figure 1E). Наивысшая эффективность определялась когда микро-устройство для хранения отлавливало одну капельку на колодец (well). Это сильно помогало при анализе изображений и детекции клеток в реальном времени.

На Рис. 1D колодцы микро-устройства хранения демонстрируют отлавливание капель с клетками внутри. Затем мы оценивали уровень энкапсуляции клеток на капельку. Рис. 1F показывает клетки, энкапсулированные внутри монодисперсных капель, формируемых системой. Как и ожидалось большинство капель не содержало клеток, мы наблюдали эффективность энкапсуляции одиночных клеток в 22% (Figure 1G). Эти значения напоминали сходные данные энкапсуляции и хранения капель²⁵, доступные aCC-BY-NC-ND 4.0 International license.

Figure 1. Characterization of the microfluidic system A. The scheme shows a diagram of the single cell microfluidic transfection system for hiPSC.
B. Representative image of the droplets produced in the outlet channel of the forming microdevice.
C. The density graph shows the size of the droplets produced by the system. Each line represents each technical sample that was made.
D. Representative image of droplets captured in the micro storage device.
E Number of droplets captured per well of the micro storage device. White points indicate the mean value for each replicate (N = 3).
F. Representative image of cells inside that travel through the outlet channel of the forming device.
G. The bar graph shows the effectiveness of capturing a cell per droplet. White points indicate the mean value for each replicate (N = 3).
The scale bars correspond to 100 µm. available under aCC-BY-NC-ND 4.0 International license.

Хорошо известно, что клетки hiPSC очень чувствительны к изменениям в своем окружении, это может снижать их жизнеспособность, а события, способствующие этому открывают пути к апоптозу²⁶. Во-первых, чтобы продемонстрировать эффективность нашей системы в отношении жизнеспособности клеток, мы оценивали её в разное время после энкапсуляции и последующего освобождения из капель. С этой целью использовали методологию Live Dead test kit, которая испускает разные флуоресцентные сигналы в зависимости от состояния жизнеспособности клеток. (Figure 2A). Мы наблюдали, что имеется высокая жизнеспособность клеток в пределах 8 и 16 часов. Напротив, более длительная энкапсуляция проведенная в капельках, обнаруживали существенное снижение жизнеспособности клеток. При 24 ч. энкапсуляции и при 48 ч., наблюдается наивысшая степень клеточной гибели и самая низкая жизнеспособность (Figure 2B).

Трансфекция клеток является неоценимым инструментом, т.к. она позволяет генерацию искусственно преобразованных с помощью Crispr/Cas9 линий клеток, с избыточной экспрессией белков, молчащих генов, с визуализацией флуоресцентных репортеров, среди многого прочего. Благодаря тому, что hiPSCs обладают высокой клеточной жизнеспосбностью во время первых 8 ч. после энкапсуляции, мы решили оценить эффективность трансфекции клеток внутри капель. С этой целью осуществляли трансфекцию флуоресцентного H2B-mCerulean индикатора и оценивали реагенты трансфекции во время ступени энкапсуляции.

После энкапсуляции клеток и при хранении капель микро-устройство помещали в культуральные условия при 37 °C в атмосфере, насыщенной 95% воздуха и 5% CO₂. Чтобы оценить эффективность трансфекции, количество флуоресценции, испускаемое каждой индивидуальной клеткой внутри капли в период времени 2, 4, 6, 8 ч. (Figure 2C). Как и ожидалось, интенсивность флуоресценции увеличивалась после энкапсуляции, при этом наивысшие уровни приходились на 6 и 8 ч. Это наблюдение может быть объяснено тем, что необходимо время для транскрипции флуоресцентного белка, его трансляции и созревания, также как и увеличение склонности клеток к трансфекции, когда клетки оказываются заключенными в капли вместе с реагентами трансфекции. В самом деле, наша microfluidic система подходит для трансфекции одиночных клеток и она может быть в принципе использована для разных подходов.

Для дальнейшей характеристики нашего подхода microfluidic трансфекции, его сравнивали в обычным методом plate трансфекции на пластинках со множественными колодцами. Как было показано ранее в экспериментах по трансфекции оптимальное время энкапсуляции с учетом клеточной жизнеспособности и трансфекции составляло 8 ч. В этом контексте мы сравнили обе методологии с одним и тем же временем трансфекции и с одними и теми же инициальными концентрациями плазмид и lipofectamine.

Рис. 2E показывает сравнение обоих методов. Обнаружена существенная пропорция трансфицированных клеток при обеих стратегиях, результаты показали достоверно более высокий уровень интенсивности флуоресценции в microfluidic системе (Figure 2E-F), это могло быть следствием захвата реагентов трансфекции капельками.

Хотя жизнеспособность клеток была понижена после продолжительного культивирования внутри капель, но наши результаты показали, что трансфекция hiPSCs в нашей microfluidic системе сравнима и даже выше по сравнению с обычной методологией пластинок со многими колодцами.

Figure 2 Transfection and method efficiency A. Representative image of cell viability. Green fluorescence indicates cells with marked cell viability, while red fluorescence shows cells that are not viable or in an apoptotic state
B. Cell viability as a function of encapsulation time. Small points correspond to mean intensity measurement of individual cells within each biological replicate as indicated by different colors (N=3). Larger points depict mean value for all measurements in each specific biological replicate.
C. Representative image of cells within the droplets. Each drop is captured in a well of the storage microdevice.
D. H2B-mCerulean fluorescence at different times after encapsulation with transfection reagents.
E. The images show the comparative top platelet of the cells transfected into droplets and subsequently released. The image below corresponds to the traditional culture plate transfection method.
F. Comparison of H2B-mCerulean transfection in the microfluidic system or in multiwell plates. In the microfluidic system, cells were encapsulated with transfection reagents and the reporter plasmid for 8h, droplets were broken and cells were later cultured in multiwell plates until fluorescence was measured 24h after encapsulation. In the case of multiwell transfection, reagents were incubated during 8h, medium was changed and fluorescence was evaluated at 24 h. The scale bars correspond to 200 µm.

4.Conclusions

Разработка базирующейся на капельках microfluidic системы показала высокую эффективность трансфекции HiPSC клеток с помощью инсерции H2b-cerulean флуоресцентнго белка. Мы полагаем, что это может быть обусловлено микро-средовыми условиями вокруг клетки, которые были энкапсулированы в капельках вместе с плазмидами и реагентами трансфекции. Система microfluidic также обнаруживает высокую эффективность отлавливания одной клетки в одной капле и индивидуализацию клеток внутри капель для последующего мониторинга в реальном времени. Это приписывается микро-устройству со многоуровневым хранением, это делает возможной визуализацию локализации каждой клетки во время процесса трансфекции.

Трансфекция одиночных клеток, осуществляемая с помощью метода microfluidic капель, как было установлено, высоко эффективна и экономически сравнима с др. сходными методами. Мы полагаем, что наша microfluidic система будет мощным инструментом в подходах, где необходима изоляция и трансфекция индивидуальных клеток, таких как генерация клонов клеточных линий с использованием Crispr /Cas9 технологии, регенеративная медицина и генотерапия путем предоставления гомогенных трансфицированных индивидуальных клеток. Поскольку современные исследования концентрируются на редактировании генов с помощью трансфекции, то эта обновленная система может быть использована для разных целей, таких как продукция белков индивидуальными клетками, microbioreactors, избирательные изоляты, тестирование лекарств, затраты могут оказаться приемлемыми для большинства лабораторий.

Итак, мы представили высоко-производительную систему, базирующуюся на капельках для трансфекции индивидуальных человеческих плюрипотентных клеток. Мы показали, что это система обладает значительной эффективностью для отдельных клеток, заловленных в капельки, сходной с др. microfluidic методами, и низкими затратами. Мы продемонстрировали, что microfluidic подход может быть ассоциирован с системой PiggyBac transposase для увеличения эффективности трансфекции.