Помимо оборота тканей, подверженных постоянному обновлению, гибель клеток в прошлом считалась нежелательным явлением у здоровых многоклеточных животных. В основном считалось, что гибель клеток у взрослых животных - это патологическое явление, связанное с дегенеративными заболеваниями, ишемией, механическими повреждениями или воздействием токсинов. Для названия этого процесса был придуман термин "некроз", к которому добавили несколько прилагательных, чтобы отличить одни процессы от других в зависимости от исхода поврежденной ткани (коагуляционный, разжижающий, казеозный и т.д.). Лизосомы, как источник гидролитических ферментов, считаются центральными, но часто пассивными эффекторами этих дегенеративных процессов (см. [1]). Однако в первой половине прошлого века исследователям стало известно о наличии массивных дегенеративных процессов, связанных с ростом и дифференцировкой эмбриональных и личиночных организмов. Примечательно, что эти процессы тесно коррелировали с морфологическим (например, потеря хвоста при метаморфозе головастика), структурным (например, формирование нейронных цепей в развивающейся ЦНС) или функциональным (например, созревание иммунной системы) моделированием развивающихся организмов, предполагая, что в эмбриональных системах гибель клеток отражает регулируемое запланированное развитие (см. обзоры [2,3]). В соответствии с этой точкой зрения, было предложено существование часов гибели внутри перспективных отмирающих клеток некоторых эмбриональных органов для определения времени, когда клетки должны умереть [4]. Однако эти часы гибели не были подтверждены в других моделях запрограммированной клеточной гибели, где клетки могут быть экспериментально отключены от программы гибели, что приводит к появлению эктопических функциональных структур [5,6].

Выявление интенсивных процессов отмирания клеток в активно растущих опухолях и во время инволюции гормонозависимых тканей, наряду с морфологическим сходством между эмбриональными гибнущими клетками и такими опухолевыми отмирающими клетками, а также отсутствие воспалительной реакции, сопровождающей эти дегенеративные процессы, было принято за доказательство существования специфической формы клеточной гибели, отличной от некроза, которая была названа апоптозом [1,7]. Среди морфо-структурных особенностей, отличающих апоптоз от некроза, можно выделить следующие: апоптотические клетки выглядят округлыми, они сохраняют целостность мембран, а в ядре хроматин выглядит уплотненным с глыбками большей плотности в их конфигурации. В отличие от них, некротические клетки выглядят набухшими и находящимися в процессе распада с массивным разрывами плазматической мембраны и вакуолизацией органелл. Первоначально апоптоз рассматривался как активная генетически запрограммированная дегенерация, включающая активацию эндогенных эндонуклеаз [8], в то время как некроз считался пассивным процессом, обусловленным обстоятельствами вне клетки.

Гипотеза о генетической регуляции клеточной гибели в процессе развития получила мощное подкрепление после идентификации у нематоды Caernohabditis elegans (C. elegans) ряда генов, названных "cell death abnormal genes" (Ced genes), мутации которых отменяла физиологический процесс умирания, происходящий в ходе развития этого червя [5].

Результаты, полученные при изучении "онкогена", связанного с В-клеточной лимфомой человека, названного Bcl-2, дали большой толчок концепции апоптоза как генетически регулируемого процесса (см. [9]). Было установлено, что этот ген защищает клетки от гибели и является высоко гомологичным и функционально взаимозаменяемым с геном C. elegans Ced-9 [10-12]. Bcl-2 был первым геном, связанным с клеточной гибелью в клетках млекопитающих, но вскоре была обнаружена сложная регуляторная сеть, состоящая из большого семейства белков, имеющих один или несколько характерных доменов BCL-2, названных BH-доменами (BCL-2 homology domains).

Другой ген аномалии клеточной гибели C. elegans, Ced-3, который имеет решающее значение для осуществления клеточной гибели червя и находится ниже Ced-9 в каскаде гибели [13], оказался гомологичным семейству цистеин-аспарагиновых протеаз, называемых каспазами, которые организуют большинство этапов апоптотического процесса в организмах позвоночных. Апоптотические каспазы включают каспазы-инициаторы, занимающие начальные или промежуточные этапы каскада дегенерации (каспазы 2, 8, 9 и 10 у человека), и каспазы-исполнители (каспазы 3, 6 и 7), которые завершают процесс дегенерации. Функции каспаз палачей включают расщепление отдельных структурных и регуляторных белков и активацию каспазо-зависимых эндонуклеаз, которые, в свою очередь, разрушают ДНК в межнуклеосомных пространствах [8].

Детальные исследования на самых разных моделях установили существование двух путей активации апоптотического молекулярного каскада: один, исходящий от внеклеточных сигналов, принадлежащих к суперсемейству TNF (внешний апоптотический путь), и другой, исходящий изнутри клеток, - внутренне присущий, или митохондриальный, апоптотический путь (подробный обзор см. в Galluzi et al. [14]). Последний является преобладающим механизмом, ответственным за гибель клеток в процессе развития у позвоночных.

Внутренний путь запускается при различных, но часто связанных между собой эндогенных клеточных возмущениях, которые включают повреждение ДНК, лишение факторов роста или увеличение количества реактивных форм кислорода (ROS). Такие возмущения запускают сложное функциональное взаимодействие между членами семейства BCL-2, которое приводит к проницаемости внешней митохондриальной мембраны мультидоменовыми факторами BH, BAX, BAK и BOK и к последующему цитозольному высвобождению повреждающих факторов, включая цитохром C, AIF (апоптотический индуцирующий фактор), DIABLO (прямой IAP-связывающий белок с низким pI) или сериновые протеазы HtrA2. Активация BAX и BAK регулируется балансом между положительным (проапоптотическим) влиянием членов семейства BCL-2, содержащих только BH3-домен (BIM, BID, PUMA и NOXA), и отрицательным (анти-апоптотическим) влиянием членов семейства, содержащих четыре BH-домена (BCL-2, BCL-Xl, MCL1, BCL-W, BFL-1). Цитохром С, поставляемый из митохондрий, играет ключевую роль на следующем этапе апоптотического каскада, генерируя активную каспазу 9 посредством связывание с APAF-1 (апоптотический пептидазный активирующий фактор 1) и с про-каспазой 9 для формирования так называемой апоптосомы. Наконец, каспаза 9 катализирует активацию каспаз палачей.

Внешний путь запускается связыванием лигандов семейства TNF (TNF альфа, FASL и TRAIL) с трансмембранными рецепторами, которые содержат характерный внутриклеточный домен гибели (FAS, TNFR1, DR4 и DR5). После связывания лиганда внутриклеточный хвост рецептора образует мультибелковый комплекс, называемый DISC (death-inducing signaling complex), который направляет активацию каспазы 8. Эта каспаза может протеолитически активировать каспазы палачей и/или активировать внутренний путь через протеолитическую активацию BID.

Учитывая сложность этих каскадов умирания, связанных с эмбриональной программируемой клеточной гибелью, апоптоз часто считался эволюционно консервативным процессом самоуничтожения клеток (см. [15]). Однако все члены апоптотических каскадов также выполняют функции, не связанные с гибелью клеток [16,17]. Существование универсальных активаторов апоптоза и транскрипционных факторов, функционально специализированных для прямой клеточной гибели, было предположено у C. elegans [18] и Drosophila [19], но не было выявлено у развивающихся позвоночных. На самом деле, было бы трудно объяснить эволюционное сохранение гена, экспрессия которого приводит к исчезновению организма, обладающего им. В соответствии с этой интерпретацией, фенотипы мышей после подавления компонентов апоптотического молекулярного каскада показывают ограниченное влияние дефицита апоптоза на нормальное развитие [20,21] (см. ниже).

Интенсификация исследований в последние десятилетия позволила получить более сложное представление о процессах дегенерации клеток как в эмбриональных, так и во взрослых системах [14]. Вместо некроза и апоптоза были выявлены различные формы клеточной гибели, имеющие различное биологическое значение и регулируемые специфическими пусковыми механизмами (см. [14,22]). В некоторых случаях, таких как так называемый пироптоз или некроптоз, дегенерирующие клетки проявляют промежуточные черты между некрозом и апоптозом; в других случаях ведущую роль в дегенеративных процессах играют лизосомы.

Первоначальное предложение "апоптоза" как регулируемого процесса, альтернативного некрозу, исключало роль лизосом, считая их ответственными за пассивную гибель клеток, индуцированную внешними повреждающими агентами, или участвующими в фагоцитарном удалении клеточного мусора, образующегося в процессе дегенерации. Однако систематическое изучение различных моделей развития клеточной гибели позволило выявить механизмы умирания, в которых лизосомы выполняют основную функцию. Фактически, до закрепления термина апоптоз, Schweichel и Merker [23], основываясь на трансмиссионных электронно-микроскопических наблюдениях, предложили термины "некроз типа I" для того, что позже было названо апоптозом, "некроз типа II" для процессов умирания, характеризующихся вовлечением лизосом через аутофагию, и, наконец, "некроз типа III" для того, что сейчас называется некрозом. С развитием генетических и молекулярных технологий для изучения клеточной гибели, лизосомы были подтверждены как основные эффекторы клеточной гибели [24,25].

Существует, по крайней мере, два альтернативных лизосомных способа саморазрушения клеток. Разрушение может быть опосредовано через индукцию проницаемости лизосомной мембраны с последующим высвобождением лизосомных гидролаз в цитозоль (лизоптоз [26,27]) или процесс может разрушать клетки через усиление аутофагии, как это было первоначально описано для клеточной гибели II типа [23]. Однако аутофагия традиционно считалась механизмом выживания, который обеспечивает энергией клетки, подвергающиеся метаболическому стрессу [28]. В соответствии с этой точкой зрения, в некоторых случаях активация лизосом сопровождает, но не вызывает дегенеративный процесс [29], а в других случаях аутофагия не вызывает гибель клеток, а защищает их от гибели [28].

Примечательно, что в последние годы онтогенетическое старение клеток (developmental cell senescence ) было предложено в качестве нового механизма ремоделирования тканей [30], но, скорее всего, на самом деле оно может представлять собой разрушительный процесс, ранее приписываемый аутофагии [31]. Как и аутофагия, старение первоначально рассматривалось как защитный механизм против клеточных повреждений и характеризовалось тремя особенностями: (1) остановка клеточного цикла путем повышение регуляции генов-супрессоров опухоли; (2) выработка senescence-associated secretory phenotype (SASP), который способствует локальному распространению старения; и (3) лизосомная активация, обнаруживаемая гистохимически через обнаружение senescence-associated-β- galactosidase (SAβ-gal) [31] или катепсина D [32]. Все эти признаки обнаруживается вместе в эмбриональных областях запрограммированной клеточной гибели, а гистохимическое обнаружение SAβ-gal при pH 6 совпадает с традиционными маркерами клеточной гибели в процессе развития, такими как нильский синий или нейтральное красное витальное окрашивание, которые обнаруживают лизосомы в областях клеточной гибели [33-36]. Более того, химическое ингибирование катепсина D усиливает ингибирование запрограммированной клеточной гибели, опосредованной ингибиторами каспаз [37]. На основании этих данных было выдвинуто предположение, что развивающаяся клеточная старость предполагает собой участие лизосом в программируемой клеточной гибели, получив название деструктивной клеточной старости (destructive cellular senescence ) для отличия от канонической формы старости как механизма клеточной защиты [31].

Следует отметить, что лизосомы могут участвовать в клеточной гибели индивидуально или совместно с апоптотическим молекулярным механизмом [38-40]. Независимо от того, происходит ли лизосомная активность через цитозольный выброс протеаз или путем их доставки в аутофагические вакуоли, необходимая проницаемость лизосом, по-видимому, опосредуется многодоменными членами семейства BCL-2, BAX и BAK [25]. Кроме того, катепсины, доставляемые после пермеабилизации лизосом, могут расщеплять и активировать инициаторные или исполнительные каспазы или способствовать пермеабилизации внешней мембраны митохондрий [38,41,42], тем самым активируя совместную лизосомную и каспазо-зависимую гибель клеток.

Единственным механизмом, позволяющим избежать традиционной автономной регуляции процесса умирания клеток, является поглощение еще живых клеток их соседями. Этот механизм умирания был описан в исследованиях рака под названием энтоз (entosis) [43]. В этом случае считается, что обреченная умирающая клетка вторгается в не-фагоцитирующую соседнюю клетку до того, как подвергнется дегенерации. Довольно похожий процесс также был зарегистрирован в моделях развития под названием "ассистированное самоубийство" ("assisted suicide") [44], но в отличие от энтоза, это устранение умирающих клеток включает истинный фагоцитарный процесс. Механизмы, лежащие в основе этих процессов, выходят за рамки нашего обзора.

Открытие различных типов клеточной гибели включало идентификацию большой группы факторов палачей у умирающих клеток в дополнение к хорошо известным факторам, доставляемым митохондриями, и каспазами [45], а также многофункциональные свойства важнейших эффекторов апоптотической клеточной гибели, которые также способны вызывать некроз [45].

С момента создания концепции запрограммированной клеточной гибели этот процесс считается не только важным в морфогенезе, но и причинным механизмом аномального развития, индуцированного тератогенами [46]. Однако скудность фенотипов явной клеточной гибели после генетической абляции различных компонентов молекулярных каскадов клеточной гибели у мыши ставит под сомнение наличие у клеточной гибели важной функции для развития, если только механизм умирания не является очень избыточным [21]. Так, у мышей, подвергнутых однократному замалчиванию генов отдельных каспаз [47] или членов семейства Bcl-2 [21], отсутствуют серьезные морфологические изменения в органах, сформированных в результате физиологической клеточной гибели. Аналогичные негативные результаты были обнаружены после генетического устранения изосомных катепсинов [48,49]. Более того, независимое химическое ингибирование каспаз или лизосомных протеаз вызвало лишь слабое ингибирование гибели интердигитальных клеток, ответственных за формирование пальцев из эмбрионального аутопода [27]. Однако генетические исследования на мышах [50] и наблюдения в эмбриональной модели цыпленка подтвердили функциональную избыточность механизмов умирания [51]. Было замечено, что частичное ингибирование гибели клеток межпальцевого аппарата местным ингибитором панкаспазы усиливалось, когда лечение сочеталось с ингибиторами лизосомальных протеаз [27]. Кроме того, было замечено, что мышиный нокаут каспазы 9, которая играет решающую роль в апоптозе, не дает фенотипических отклонений в пальцах, поскольку при таких экспериментальных условиях межпальцевые клетки погибают путем некроза, а не апоптоза [50].

Комбинированные мутации про-апоптотических членов семейства Bcl-2 усиливают избыточную природу механизмов умирания. Двойные или тройные нокауты про-апоптотических членов сверх-семейства Bcl-2, таких как Bax и Bak, демонстрируют фенотипические отклонения в клеточной гибели, такие как синдактилия [52], но ингибирование клеточной гибели и последующая синдактилия, по-видимому, неполные, поскольку проявление фенотипа усиливается при дополнительном подавлении генов, связанных с аутофагией [53].

Общим наблюдением в прежних тератологических исследованиях было то, что недифференцированные участки тканей эмбриона, такие как те, в которых происходит физиологическая гибель клеток, наиболее подвержены изменениям под действием различных повреждающих стимулов [46] (вирусная эмбриопатия, ионизирующее облучение и т.д.). Часто тератоген оказывает свое действие, индуцируя новые области клеточной гибели [54] или увеличивая протяженность областей физиологической клеточной гибели [55]. Эта связь может объяснить, почему часто в старых тератологических исследованиях нормальные области гибели клеток ошибочно принимались за аномальные [46]. Специфическая чувствительность эмбриональных областей к повреждению клеток была подтверждена в исследованиях эмбрионов цыплят, подвергнутых сублетальному Х-облучению [56]. Таким образом, у птичьих эмбрионов сублетальное Х-облучение на стадиях, предшествующих формированию свободных пальцев, вызывает массивную дегенерацию интердигитальных клеток, предшествующую появлению физиологических областей гибели межпальцевых клеток без изменения развития пальцев. Примечательно, что, как и в физиологических случаях, гибели клеток предшествует повреждение ДНК, которое можно обнаружить с помощью иммуногистохимической детекции очагов H2AX, являющихся маркерами репарации ДНК.

Приведенные выше данные и достижения в изучении запрограммированной клеточной гибели за последние десятилетия подтверждают следующие утверждения: (1) не выявлены главные транскрипционные факторы, ответственные за запуск клеточной гибели у эмбрионов позвоночных; (2) клетки, которым суждено умереть, сохраняют потенциал дифференцировки и выживания до начала процесса умирания (т.е. не существует "часов гибели "); (3) пути умирания многочисленны и функционально избыточны; и (4) все компоненты механизма умирания имеют функции, не связанные с клеточной смертью. Учитывая эти факты в совокупности, можно сделать вывод, что инициация процессов эмбрионального умирания не зависит от специфического для умирания сигнала, а происходит за счет повышения чувствительности клеток-мишеней к повреждающим сигналам, которые не опасны для соседних клеток, предназначенных для выживания.

Накопленная за последнее десятилетие информация указывает на эпигенетические модификации и ремоделирование хроматина как на важнейшие регуляторы поведения эмбриональных клеток путем облегчения или затруднения доступа транскрипционных факторов к их мишеням и регулирования хрупкости хроматина. Этот тип регуляторного механизма объясняет, почему сигнал может быть активным для конкретной клетки, но не для соседних клеток. В качестве дополнения, это также объясняет возникновение различных или даже антагонистических ответов на определенный сигнал среди близкородственных клеток. Однако точная основа для дифференциальной чувствительности к повреждениям не обязательно должна быть одинаковой в разных эмбриональных контекстах. Так, бластомеры эмбрионов млекопитающих на двухклеточной стадии защищены от апоптоза благодаря метилированию ДНК и де-ацетилированию гистонов, которые делают хроматин недоступным для ДНКаз, активируемых каспазой 3 [57]. Однако, наоборот, повышенное метилирование ДНК через регуляцию ДНК-метилтрансфераз оказывает интенсивное про-апоптотическое влияние в моторных нейронах постнатальных и взрослых мышей [58] и в фоторецепторах мышиных моделей пигментного ретинита [59].

Во время метаморфоза бесхвостых амфибий тиреотропный гормон (ТГ) является важнейшим регуляторным сигналом, который способствует росту некоторых тканей головастика (например, примордии конечностей) и, в то же время, массивной дегенерации других тканей [60] (хвост, жабры, кишечник и т.д.). Эффекты TH зависят от регуляции активности гистоновых деацетилаз ко-репрессорами или ко-активаторами, что приводит к ремоделированию хроматина, сопровождающемуся транскрипционной активацией или ингибированием генов мишеней в зависимости от стадии и органа [61,62].

Дальнейшие доказательства роли эпигенетики как начального этапа запрограммированной клеточной гибели получены в результате изучения процесса отмирания, ответственного за разделение пальцев во время развития конечностей у тетрапод. Процесс межпальцевого ремоделирования осуществляется путем массовой гибели клеток с участием каспаз и лизосомной активации в избыточном режиме [31,63]. В соответствии с активацией каспаз и лизосомных протеаз, отмирающие клетки интердигитального аппарата демонстрируют морфологические признаки апоптоза, старения, некроза и аутофагии [31]. Следует отметить, что перед активацией механизмов отмирания, межпальцевые предшественники обладают повышенной нестабильностью генома к Х-облучению по сравнению с соседними тканями пальцев и проявляют спонтанную повреждающую активность и восстановление ДНК, выявляемое иммунолабилизацией фосфорилированного гистона 2AX по серину 139 (γH2AX) [31]. В процессе межсуставного ремоделирования очаги γH2AX ассоциируют с зонами интенсивного метилирования ДНК и триметилирования гистона 3 по лизинам 4, 9 и 27 (H3K4me [3]; H3K9me [3]; и H3K27me [3]) [56,64], это позволяет предположить, что области повышенной хрупкости ДНК зависят от структурных сигналов хроматина. В соответствии с этой интерпретацией, основные эпигенетические регуляторы, ответственные за метилирование ДНК, такие как UHRF1 (убиквитин-подобный, содержащий растительный гомеодомен и домен RING finger), ДНК-метилтрансферазы (Dnmt1, Dnmt 3a и Dnmt 3b) и различные гены деацетилаз гистонов (Hdac1, Hdac2, Hdac3 и Hdac8), показывают регулируемые домены экспрессии в межпальцевых областях [56,65,66]. Экспериментальный анализ, направленный на выяснение влияния этих доменов экспрессии на гибель клеток, выявил резкое увеличение гибели интердигитальных клеток in vivo после локального ингибирования деацетилаз гистонов трихостатином А [65,67]. Кроме того, гибель клеток увеличивалась и уменьшалась в первичных культурах скелетных предшественников конечностей после избыточной экспрессии или замалчивания гена Dnmt3b, соответственно [56]. Примечательно, что избыточная экспрессия и замалчивание Dnmt3b усиливает и ослабляет картину метилирования ДНК в промоторе SOX9, главного гена хондрогенеза, оказывающего большое влияние на ремоделирование хроматина, которое необходимо для выживания предшественников скелета конечностей [68,69] и мезенхимных стволовых клеток [70].

Как упоминалось выше, нельзя ожидать общего правила эпигенетической модификации, учитывающего гибель клеток в различных системах, поскольку различные модификации могут способствовать гибели клеток в различных клеточных популяциях. Среди эпигенетических сигнатур, которые предлагается ассоциировать с нормальными или аномальными процессами умирания в ходе развития, - модификации гистонов [71,72,73,74] и/или промоторное метилирование определенных генов, включая главные факторы транскрипции [75,76], гены, кодирующие секретируемые факторы [77], или опухолевые супрессоры и гены, регулирующие клеточную гибель [78,79].