За последнее десятилетие создание органоидов стало новой дисциплиной в области биологии развития и регенеративной медицины [1], [2], [3]. Органоиды, или трехмерные миниатюрные органо-подобные структуры in vitro, в широком смысле определяются как состоящие из множества самоорганизующихся типов клеток, имеющие структуру, подобную их аналогам in vivo, и похожие на in vivo траектории развития [1], [2], [4], хотя существуют споры по поводу незначительных нюансов [5]. Ранее были описаны органоиды различных систем органов, включая мозг [4], [6-10], кишечник [11-15] и зрительный бугор [16], каждый из которых имеет различную степень сходства с развитием in vivo. Такие системы и их применение представляют собой огромный потенциал для ответа на важнейшие биологические вопросы, связанные со здоровьем человека. В то время как было разработано множество органоидов различных систем, прогресс в области органоидов сердца заметно отстает, отчасти из-за сложности раннего морфогенеза сердца. В последнее время шквал препринтов и публикаций с подробным описанием сердечных органоидов породил надежду в этой области, хотя каждая система выглядит очень непохожей и претерпевает совершенно разные процессы развития. Такой диссонанс выявил фундаментальную потребность в понимании: а) что именно представляет собой органоид сердца и б) почему такое различие имеет значение?

Развитие сердца концептуально можно подразделить на две большие стадии - ранний кардиогенез, во время которого клетки эмбрионального сердца предопределяются, дифференцируются и организуются в сложную структуру, которая обеспечивает жизнедеятельность эмбриона [17-24] (рис. 1A-D), и созревание, во время которого сердце претерпевает адаптационные изменения, необходимые для функционирования во взрослом состоянии [25-30] (рис. 1E). Модели сердца in vitro в основном пытались воспроизвести один из этих двух процессов. Например, биологи, занимающиеся вопросами развития, стремились создать системы, повторяющие основные этапы развития и эмбриональные структуры сердца. Аналогичным образом, различные подходы тканевой инженерии использовались для моделирования состояния сердца взрослого человека, хотя степень биомиметичности этих подходов остается неизвестной. Мы попытаемся объединить модуляции биологических сигнальных путей и тканевую инженерию, необходимые для оптимального формирования (табл. 1). Затем мы оценим потенциал каждой органоидной модели для дополнения нашего понимания развития и функции сердца - на основе того, насколько эти модели in vitro похожи на in vivo, и, что, возможно, не менее важно, насколько они не способны повторить развитие in vivo. Мы надеемся выявить важные свойства, которые могут послужить основой для разработки следующего поколения моделей органоидов и тканей сердца.



Fig. 1. Staging in vitro models of the heart to in vivo heart development. A. Embryo undergoing gastrulation. Precardiac organoid models attempt to recapitulate this stage of development. B.-C. Cardiac crescent formation and merging to form the linear heart tube. Developmental cardiac organoids model this stage of development. D. Embryo undergoing rightward looping and chamber formation. Chamber cardiac organoids recapitulate this stage of development and microtissues offer insight into the cell type-cell type interactions between cardiomyocytes and stromal cells. E. Maturation of cardiomyocytes to promote adult heart function. Engineered heart tissues attempt to promote a more adult and in vivo-like state of cardiac tissues.



Table 1. Summary of methods for generation of precardiac and cardiac organoids.

Органоиды различных систем использовались для изучения динамики и механизмов, лежащих в основе развития соответствующих органов. Изучение развития, особенно у человека, по своей природе осложнено ограниченным доступом к эмбриональной ткани и контролю над ней, а также множеством этических проблем. Поэтому желательно, чтобы развившийся органоид не только напоминал орган по структуре, составу и пространственной организации, но и проходил аналогичную траекторию развития. В частности, в контексте развития сердца, органоиду недостаточно просто сформировать структуру, напоминающую раннее сердце, он также должен повторять аналогичные этапы развития. Благодаря этому органоид позволит исследовать процессы, определяющие развитие сердца. Потенциал таких исследований в органоидных системах сердца будет иметь решающее значение для разработки методов лечения и средств диагностики врожденных пороков сердца. Для адекватной оценки каждого органоида крайне важно сравнить методы индукции и сформированные структуры с траекториями развития и структурами сердца in vivo.

Задолго до появления первой структуры сердца в процессе развития эмбрион уже тщательно координирует дифференцировку и миграцию клеток, которые в конечном итоге составят сердце. Важно отметить, что в период раннего развития эмбрион формируется по нескольким осям, инструктируя эмбрион о том, как продолжать развитие [31-34]. После формирования мезодермы во время гаструляции [35] (рис. 1А) клетки-предшественники сердца проходят сложный морфогенетический процесс спецификации, дифференцировки и миграции, чтобы в конечном итоге сформировать эмбриональное четырехкамерное сердце. Вкратце, сердце формируется из двух сердечных полей [19] (рис. 1B), а нарушения развития сердечных полей может привести к различным врожденным порокам сердца [36]. Первое поле сердца (FHF) формирует левый желудочек (LV) и часть предсердий, а второе поле сердца (SHF) формирует правый желудочек (RV), отводящий тракт (ОТ) и часть предсердий [18]. FHF и SHF предопределяются в начале гаструляции [24], [37-39] и регулируются многочисленными сигнальными путями, такими как Wnt [22], [40-48], Bmp [22], [49-51], Notch [52-58] и Numb [59-63]. Первая наблюдаемая сердечная структура состоит из клеток FHF и известна как сердечный полумесяц (рис. 1B), который присутствует временно, прежде чем слиться ножками и стать линейной сердечной трубкой [64] (рис. 1C). Клетки, полученные из SHF, продолжают добавляться к артериальному и венозному полюсам сердечной трубки [65-67] (рис. 1С), инициируя правостороннее петлеобразование [68] и формирование камер [69-75] (рис. 1D). Помимо клеток сердечной мышцы, составляющих миокард, сердце окружено слоем эпикардиальных клеток [76-84], снабжается сосудистой сетью [85] и поддерживается эндокардиальными клетками [86-88] - клоны, которые должны быть включены в идеальный органоид сердца.

Для изучения этих ранних процессов развития, область органоида сердца естественным образом д. возникать как продолжение широко используемых 3D культур дифференцировки эмбриоидных тел (ED). Многочисленные исследования дифференцировали кардиомиоциты (CMs) в трехмерной культуре EB, однако эти исследования не были направлены на изучение самоорганизации или формирование паттерна EB, а, скорее, фокусировались на направленной дифференцировке CMs [89], [90-92]. Важным достижением в области дифференцировки сердечных EB стала разработка Domian и др. метода визуализации динамики дифференцировки внутри EB путем создания флуоресцентного репортерного EB, маркирующего каждое поле сердца [93] (табл. 1). Однако, как и в других случаях, исследование было сосредоточено на выделении CMs желудочков, а не на динамике самой системы EB. Кроме того, в этом исследовании использовался популярный в то время метод дифференцировки "висячая капля", при котором интересующие клетки спонтанно образуются в агрегированных EB [94]. Таким образом, уровень организации или формирования паттерна в этих репортерных EB остается неясным [93].

Основываясь на этой работе, мы использовали обновленный протокол дифференцировки с применением Bmp и Activin A (активирующие пути, необходимые для мезодермальной и сердечной дифференцировки [95], [96]), чтобы разработать систему EB с использованием флуоресцентных репортеров FHF и SHF (Hcn4 и Tbx1, соотв.) [23], [97] (Таблица 1). Интересно, что в соответствии с развитием in vivo, каждое поле сердца было сформировано из пространственно различных областей, состояло из нескольких типов клеток, присутствующих в раннем развивающемся сердце, и демонстрировало in vivo похожие транскриптомы FHF и SHF. Однако наблюдалось заметное отсутствие полярности (in vivo FHF формируется перед SHF) и морфогенеза (не формируется сердечный полумесяц или линейные структуры, похожие на сердечную трубку), что позволяет предположить, что протокол дифференцировки Bmp/Activin A в сфероидах может быть недостаточным для раннего формирования оси тела и начала морфогенеза сердца. Поэтому мы назвали эту систему прекардиальным органоидом, поскольку она была способна к самоорганизации и моделированию развития до стадии сердечного полумесяца, но не после.

Domian и др. [93], и Andersen и др. [23] использовали флуоресцентные репортеры для визуализации FHF и SHF, однако с разными протоколами дифференцировки. Как уже упоминалось ранее, в работе Domian et al. было проведено ограниченное исследование аспектов развития дифференцировки ET; тем не менее, на имеющихся флуоресцентных изображениях, судя по всему, наблюдалась минимальная организация и структурирование. В работе Andersen et al. наблюдалась четкая сегрегация областей FHF и SHF во время дифференцировки, но без дальнейшего морфогенеза. Вероятным объяснением этого расхождения является метод дифференцировки, где Domian и др. использовали спонтанную дифференцировку висячих капель (крайне низкая эффективность), а Андерсен и др. использовали BMP/Activin A направленную дифференцировку сердца (высокая эффективность дифференцировки мезодермы/сердца). Вместе взятые, эти результаты свидетельствуют о том, что экзогенные Bmp и Activin A необходимы для индукции достаточного количества сердечной мезодермы для запуска программ самоорганизации примитивного поля сердца в ET. Однако дальнейшая организация и морфогенез потребуют дополнительной модуляции сигналов и вмешательства.

Критическим изменением, которое способствовало развитию моделей органоидов сердца, является использование небольшой молекулы Chir99021, ингибитора Gsk3, который активирует передачу сигналов Wnt. Сигнализация Wnt необходима для формирования мезодермы и часто использовалась для индукции кардиогенеза в системах стволовых клеток [98]. Более того, было показано, что всплеск передачи сигналов Wnt, вызванный Chir, достаточен для того, чтобы вызвать нарушение симметрии и самоорганизацию [99], это указывает на ключевую роль передачи сигналов Wnt в индукции спецификации зародышевого слоя. Два исследования уникальны тем, что оба подчеркивают важность скоординированного совместного развития с другими несердечными типами клеток для генерации органоидов, что позволяет нам классифицировать эти модели как развивающиеся органоиды сердца.

В недавнем исследовании с использованием hiPSCs Silva и др. сообщили, что при добавлении кардиогенного фактора аскорбиновой кислоты, то обработка Chir способствует формированию многоклонального органоида сердца, состоящего из кардио- и энтодермальных доменов [100] (табл. 1). Домены содержат сердечное ядро и область, напоминающую кишечник, состоящую из клеток Панета и Гоблета, которые демонстрируют подобные перистальтике сокращения. В этих органоидах формируется эпикардиальный слой, подобный Tbx18+; однако этот слой окружает весь органоид, а не только область сердца, как это происходит in vivo. Таким образом, степень морфогенеза в этих органоидах трудно оценить. Несмотря на наличие сердечной и энтодермальной областей, сердечная область не похожа на свой аналог in vivo. Вместо этого она образует сердечное ядро, которое не похоже на сердечный полумесяц (присутствующий на ранних стадиях развития), линейную сердечную трубку/петлеобразную сердечную трубку и камерное сердце. Это может быть результатом раннего этапа диссоциации в их протоколе генерации органоидов, где клетки предварительно дифференцируются в 2D культуре перед диссоциацией и повторной агрегацией в 3D культуре на 5 день дифференциации. Тем не менее, способность этих органоидов реорганизовываться после дифференцировки является биологически интересной. Наконец, авторы предполагают, что совместное развитие сердца с эндодермой усиливает созревание CMs согласно различным функциональным показателям. Дальнейшее сравнение с CMs in vivo, которое можно провести с помощью секвенирования РНК одной клетки или функционального анализа, было бы полезно для более точной оценки [101].

В отличие от этапа диссоциации, который влияет на пространственную информацию и межклеточные взаимодействия, у Silva et al., система формирования гаструлоидов позволяет сохранить взаимодействие между типами клеток на протяжении всего развития in vitro. Гаструлоиды используют врожденную способность стволовых клеток к организации и развитию in vivo для формирования беспрецедентных многоосевых эмбрион-подобных структур, состоящих из клеток нескольких зародышевых слоев [99], [102]. Таким образом, использование гаструлоидов для изучения развития сердца позволит беспрецедентным образом ответить на вопросы о том, как перекрестные связи между типами клеток важны в развитии. В одном из последних исследований была предпринята попытка применить принципы гаструлоидов для создания органоида сердца. Rossi и др. стремились использовать межклеточные взаимодействия и передачу сигналов раннего эмбриона для создания сердечных структур, которые проходили в естественных условиях аналогичные процессы развития [103]. Всплеск Wnt-сигнализации на 2-3 день дифференцировки, эпициклическая (orbital) встряска и добавление кардиогенных факторов аскорбиновой кислоты, bFgf и Vegf на 4-й день дифференцировки (рис. 2) позволили повысить кардиогенную способность гаструлоидов. Это привело к образованию кардиологического органоида, который был сформирован по нескольким осям и состоял из клеток из нескольких зародышевых слоев (табл. 1). Более того, эти органоиды воспроизводимо формировали структуры, напоминающие раннее сердце - сердечный полумесяц и линейную сердечную трубку. Важно отметить, что правильное пространственное и временное развитие множества событий, таких как васкуляризация, развитие FHF и SHF, формирование эндокарда и кишечной трубки, сохранялось в этой системе in vitro. Таким образом, эти развивающиеся органоиды сердца верны раннему развитию - они повторяют аспекты самоорганизации, формирования паттерна и формирования структур при развитии сердца. Одним из ограничений этой системы является то, что эти органоиды сердца не сохраняются долгое время после стадии линейной сердечной трубки, что ограничивает их использование для изучения более поздних морфогенных дефектов сердца. Тем не менее, на сегодняшний день эта система гаструлоидов представляет собой наиболее точное воспроизведение раннего развития сердца на структурном, функциональном и транскриптомном уровнях.



Fig. 2. Summary of noteworthy models of in vitro models of the heart. Developmental cardiac organoids [103] form vascular networks, cardiac crescent-like, and linear heart tube-like structures with the addition of pro-cardiogenic factors bFgf, Vegf, and ascorbic acid. Chamber cardiac organoids [106] form patterned chambers regulated by a Wnt-Bmp signaling axis. Microtissues are aggregates of CMs and stromal cell types which allow for study of cell type-cell type interactions. Engineered heart tissues are models of a piece of the heart, and enable enhanced CM maturation for drug discovery and disease modeling.

Если сравнивать Silva et al. [100] и Rossi et al. [103], то перед нами две системы, в которых особое внимание уделяется совместному развитию сердечных и других типов клеток для создания органоидов сердца. Однако подходы к созданию этих органоидов имеют некоторые различия, которые могут лежать в основе расхождений в получаемой структуре. Три заметные области различий в протоколах: виды линий PSC, ранняя диссоциация у Silva et al. и дополнительные кардиогенные факторы (bFgf и Vegf) у Rossi et al. Во-первых, Silva et al. использовали человеческие iPSCs, а Rossi et al. использовали различные линии PSC мыши. В ранних протоколах получения гаструлоидов отмечалось, что при генерации гаструлоидов из hiPSC возникают дополнительные трудности [99]. Как внутренние видовые различия влияют на формирование органоидов, еще предстоит полностью понять, и это, вероятно, определяет некоторые различия, наблюдаемые между этими двумя исследованиями - очень важный момент при оценке всех протоколов создания органоидов. Далее, ранний этап диссоциации у Silva et al. противоречит одному из основных принципов технологии гаструлоидов. В системе получения гаструлоидов значительное внимание уделяется межклеточным взаимодействиям на самых ранних стадиях дифференцировки, что помогает обучить самоорганизации и формированию паттерна в получаемом гаструлоиде, подобно тому, как происходит развитие в естественных условиях. Однако после диссоциации эти взаимодействия, вероятно, сбрасываются, а механизмы, лежащие в основе реорганизации, остаются неясными. Этот ранний этап диссоциации дает представление об уровне организации, которого способны достичь клетки предшественники, что вызывает еще один ряд интересных вопросов для дальнейшего исследования. Наконец, поскольку экзогенные bFgf и Vegf усиливают генерацию in vivo-подобных структур у Rossi et al., было бы интересно посмотреть, как добавление этих факторов повлияет на морфогенез в органоидах Silva et al.

В самой последней версии развивающегося органоида сердца Drakhlis и др. [104] представили метод формирования развивающихся органоидов сердца, полученных из hiPSC, которые состояли как из сердечного, так и энтодермального клонов (аналогично Silva и др. [100]). Для этого они активировали и затем блокировали передачу сигналов Wnt в предварительно сформированных агрегатах, помещенных в Матригель, чтобы получить органоид со слоистой структурой. Интересно, что для такого образования требовался матригель, и такую структуру нельзя было воспроизвести с помощью обычно используемых подходов. Более того, полученные органоиды сформировали уникальную слоистую трехмерную структуру, состоящую из внутреннего энтодермального ядра, окруженного эндокард-подобными клетками, плотного слоя кардиомиоцитов и кардиомиоцитов, перемежающихся с печеночными зачатками и клетками, похожими на septum transversum. Морфогенез этих органоидов был очень интересным, однако не соответствовал организации, обнаруживаемой in vivo. Авторы также отметили, что кардиомиоциты, по-видимому, принадлежат организации SHF (в основном для желудочков с небольшой частью клеток, характерных для предсердий), без существенного вклада со стороны FHF. Таким образом, как видно из этих трех исследований развития органоидов сердца, мы можем оценить аспекты утонченности развития in vivo в подходе in vitro, а также увидеть, где развитие сердца in vitro оказывается неполноценным. С дальнейшей оптимизацией, инновациями и сотрудничеством, мы будем надеяться продвинуться к более развитым органоид сердцаам, которые точно повторяют развитие человеческого сердца и формируют более похожие на in vivo сердечные структуры.

Органоиды сердца, разработанные Silva et al. и Rossi et al., представляют собой ключевое усовершенствование в воспроизведении раннего кардиогенеза in vitro. Однако ни один из них не состоит конкретно из типов сердечных клеток и не воспроизводит важный этап развития, уникальный для сердца, - формирование камер. Недавно многие группы попытались сформировать сердечные камеры in vitro [105-107]. Мы определяем камерные органоиды сердца как трехмерные модели сердца in vitro, которые надежно генерируют стандартные камеры, демонстрируют соотв. структурирование и состоят из нескольких типов кардиальных клеток.

IIsraeli et al. описывает метод формирования множественных микрокамер внутри каждого органоида [105]. После формирования и стабилизации EBs в культуре плюрипотентных стволовых клеток в течение 2 дней и первоначальной активации передачи сигналов Wnt, Bmp, Activin A, с последующей инактивацией Wnt, в каждом органоиде сердца были сформированы многочисленные "микрокамеры" (Таблица 1). Более того, эпикард-подобные клетки формировались после второго всплеска передачи сигналов Wnt. Однако в этой системе микрокамеры были заметно меньше и не формировались по стандартной схеме. Наличие микрокамер само по себе не указывает на сходство с эмбриональным сердцем, учитывая, что такие камеры могут быть сформированы и в других, не подобных in vivo условиях с помощью подходов тканевой инженерии [108]. Тем не менее, транскриптомный анализ, сравнивающий эти органоиды сердца и обычные монослои, дифференцированные сердечной тканью плодов, показывает, что эти органоиды более похожи на сердечную ткань плодов, чем монослои. Необходимо дальнейшее подтверждение этих микрокамер, а также того, контролируются ли они процессами, связанными с формированием камер in vivo.

В качестве усовершенствованного метода формирования камер, система формирования кардиоидов (cardioid ) [106] предлагает протокол для создания более последовательного и надежного формирования камер. Используя множество канонических кардиогенных факторов, таких как Bmp, Fgf, активация и ингибирование Wnt и ретиноевая кислота (рис. 2), удалось добиться самоорганизации формирования камер в сердечной ткани в отсутствие энтодермальных клеток (табл. 1). Хотя эта система вполне воспроизводима, она потенциально отличается от развития in vivo, в частности тем, что формирование полости начинается вскоре после индукции мезодермы (примерно на 2,5 день дифференцировки). Кроме того, авторы отмечают, что небольшие камеры на более ранних стадиях имели тенденцию к объединению в более крупные камеры по мере продолжения дифференцировки. Однако, что интересно, в соответствии с развитием in vivo [109], [110], было показано, что Hand1 необходим для формирования камер органоида и регулируется сигнальной осью Wnt-Bmp. Авторы отметили, что образование полостей не обязательно связано с дифференцировкой сердца - высокие концентрации Wnt приводят к образованию больших камер в ущерб развитию СМs, что позволяет предположить, что образование полостей и спецификация сердца не обязательно связаны между собой. В заключении этой работы авторы добавили экзогенные эпикардиальные клетки в кардиоиды для формирования проэпикардиальных органо-подобных структур или области накопления эпикардиальных клеток на периферии кардиоида. Было бы интересно посмотреть, направлены ли эти способствующие образованию эпикарда органо-подобные скопления на определенную область кардиоида, что свидетельствовало бы о самоорганизации на основе формирования паттерна каждого кардиоида, или же они прикрепляются неспецифически. Эта система демонстрирует самоорганизацию, примитивную структуризацию и некоторое сходство с образованием камер, что позволяет предположить возникновение камерного кардиоидного органоида. Дальнейшее изучение того, почему эта система не проходит ранние морфогенные стадии развития сердца (сердечный полумесяц и линейная сердечная трубка), но при этом формирует камерные структуры, которые регулируются процессами, подобными in vivo, это позволило бы понять, что требуется для воспроизведения каждого конкретного аспекта развития сердца. Поскольку в модели кардиоидов отсутствуют энтодермальные клетки, такие эксперименты позволили бы сравнить их с развивающимися органоидами сердца, которые состоят из множества типов клеток, не относящихся к сердцу. Это, вероятно, облегчит выяснение аспектов морфогенеза, которые регулируются взаимодействием типа клеток и типа клеток и которые могут внутренне регулироваться сердечной мезодермой.

В одной из самых интересных последних систем камерных органоидов сердца Lee et al. описывают метод формирования четырехкамерных органоидов сердца путем модуляции ECM и добавления Fgf4 [107] (табл. 1). Авторы сообщают о формировании камер типа RA, LA, RV и LV. Хотя четырехкамерная структура была подтверждена с помощью комбинаторной иммунофлуоресценции, по-видимому, существует определенный уровень вариабельности в морфологии таких органоидов. Более того, авторы утверждают, что в процессе формирования камер органоиды образуют структуры, похожие на сердечный полумесяц, и предполагают, что этот полумесяц состоит из FHF-подобных клеток с прилегающими SHF-подобными клетками на основе иммунофлуоресценции Tbx5 (чтобы предположить FHF-подобные) и Nkx2-5 (чтобы предположить SHF-подобные). Однако, вероятно, это необходимо проверить с помощью более комплексных подходов, включающих дополнительные маркеры каждого поля сердца, поскольку Nkx2-5 также маркирует вклад FHF в сердечный полумесяц (в дополнение к SHF) [111], и использовать 3D light sheet микроскопию [103] (или аналогичные методы), чтобы лучше оценить пространственное расположение и возникающие в результате структуры.

При сравнении таких камерных органоидов снова важно учитывать вид линии PSC при оценке формирующейся структуры. В работах Israel et al. [105] и Hofbauer et al. [106] используются человеческие PSCs, а в работе Lee et al. [107] - PSCs мыши. Аналогично при сравнении развития органоидов, оказывается, что мышиные PSCs лучше воспроизводят морфогенетические события развития in vivo. Условия культивирования или механизмы, обеспечивающие легкость генерации органоидов сердца мыши по сравнению с органоидами сердца человека, остаются неясными и будут интересны для дальнейшего исследования. Кроме того, существуют многочисленные различия в протоколах генерации органоидов в разных исследованиях, которые могут лежать в основе различий между двумя протоколами генерации органоидов сердца человека [105], [106], например, добавление Fgf, ретиноевой кислоты и длительное воздействие Bmp. Дальнейшее изучение роли этих сигнальных путей развития будет иметь решающее значение для оптимизации протоколов получения органоидов камерного сердца человека в будущем.

Область развития органоидов сердца набирает обороты, поскольку исследователи продолжают оптимизировать условия, чтобы добиться воспроизведения раннего развития (т.е. формирования сердечного поля и линейной сердечной трубки) с последующими аспектами развития (формирование камер) [112]. Такая оптимизация, скорее всего, будет включать стадио-специфическую модуляцию канонических кардиогенных путей, используемых в вышеупомянутых исследованиях (Bmp, Nodal, Wnt, Fgf и ретиноевая кислота), и использовать самоорганизующиеся возможности стволовых клеток и клеток предшественников на протяжении всего процесса. Честная оценка каждой модели - где органоид точно повторяет развитие in vivo, а где не дотягивает - будет необходима для того, чтобы такие технологии созрели и развились до своего полного потенциала.

Еще один интересный подход, который применяют биологи сердца и стволовых клеток для изучения взаимодействия между несколькими типами клеток, заключается в совместном объединении нескольких типов клеток в 3D культуре [113-117]. Эти модели включают уже дифференцированные CMs с поддерживающими типами клеток, такими как сердечные фибробласты [113], [115-117] и/или эндотелиальные клетки [113-117] в 3D агрегаты (рис. 2). Мы определяем микроткани как трехмерные в in vitro модели сердца, которые включают типы сердечных клеток, но демонстрируют ограниченную самоорганизацию, структурирование и формирование структур. Тем не менее, эти модели позволяют исследовать взаимодействие клеток CMs со стромой и улучшить функциональность CMs.

Интересно, что совместное культивирование с сердечными фибробластами или эндотелиальными клетками, по-видимому, оказывает влияние на кардиомиоциты внутри каждого агрегата [113], [115]; однако биологическую значимость таких взаимодействий еще предстоит выяснить. Richards et al. описали и оптимизировали систему агрегации CMs, полученных из hiPSC, с экзогенными фибробластами сердечного желудочка человека и эндотелиальными клетками из пупочной вены человека (HUVECs). В этой системе после совместной агрегации внутри сфероида формировалась предполагаемая сосудистая сеть с примитивной структурой, напоминающей просвет. Эта модель пригодна для моделирования инфаркта - состояния, в которое тесно вовлечены клеточные типы, не относящиеся к CMs [114], и демонстрирует патологический фиброз, связанный с инфарктом. Однако, хотя в сосудистой системе сфероида и наблюдается определенный уровень организации, в ней отсутствуют элементы структурирования или формирования камер сердца. Giacomelli и др. объединили CMs, полученные из iPSC, и эндотелиальные клетки. После формирования сфероидов иммунофлуоресценция показала диффузную экспрессию эндотелиальных маркеров по всей микроткани, хотя уровень организации сосудистой сети неизвестен. Однако по сравнению с микротканями, состоящими только из CMs, эндотелиальные микроткани демонстрировали более взрослую экспрессию генов [113]. Когда к микротканям добавляли сердечные фибробласты из hiPSC, созревание CMs еще больше улучшалось, что указывает на важную роль не-CMs в созревании [115]. Опять же, эти сфероиды не демонстрируют заметной организации или структурирования. Однако функциональные улучшения CMs позволяют предположить, что эти клеточные взаимодействия имеют решающее значение для улучшения созревания CMs и создания органоидных моделей в будущем. Любопытно, что в работе Hookway et al. авторы предполагают, что такие функциональные преимущества уменьшаются со временем [116]. Это говорит о том, что клеточного перекрестного взаимодействия недостаточно для поддержания или следования программе развития созревания CMs.

Интересно, что в микротканях диссоциация и реагрегация не приводят к значительным уровням реорганизации или структурирования. Это контрастирует с развивающейся органоидной системой Silva и др., которая демонстрировала структурирование и организацию после диссоциации. Фундаментальное различие между этими двумя подходами к диссоциации заключается в степени предварительной дифференциации клеток перед диссоциацией и реагрегацией. В микротканях окончательно дифференцированные CMs и стромальные клетки диссоциируют и реагрегируют, в то время как в работе Silva et al. в 3D-культуре диссоциируют и реагрегируют мезэнтодермальные предшественники, но не окончательно дифференцированные CMs. Вместе взятые, эти результаты свидетельствуют о том, что органоиды сердца не могут быть созданы путем реагрегации дифференцированных кардиальных и родственных типов клеток, но лучше создаются путем агрегации клеток-предшественников, что позволяет разделить траектории развития для достижения более in vivo-подобного формирования паттерна.

Создание взрослых тканей сердца из человеческих плюрипотентных стволовых клеток стало одной из самых интересных областей регенеративной медицины сердца. Используя методы, разработанные в тканевой инженерии, исследовательские группы создали ткани, которые могут служить уникальными системами для моделирования заболеваний человека и поиска лекарств. В частности, такие модели предлагаются для того, чтобы помочь PSC-CMs преодолеть остановку в развитии, которая исторически ограничивала их применимость в качестве системы. В этих тканях используются различные вмешательства, такие как механическое растяжение, электрическая стимуляция, совместное культивирование со стромальными клетками и биопринтинг (рис. 2). Мы считаем, что такие ткани, которые другие называют инженерными тканями сердца, отличаются от органоидов сердца по ограниченному формированию паттерна и масштабу на уровне ткани, а не на уровне органа. Кроме того, они отличаются от микротканей, поскольку их структура формируется с помощью определенного уровня биомиметической инженерии (растяжение, электростимуляция и т.д.). Многие из этих новых интересных моделей кардиоинженерных тканей сердца используют посев клеток для формирования полосок, похожих на структуру сердечных тканей [117-123]. Платформа "Biowire" требует высева CMs с фибробластами в микролунку между двумя гибкими проводниками (wires) на обоих концах лунки [117], [122]. После высева клетки подвергаются процессу уплотнения, в результате которого они образуют трубко-подобную структуру, подвешенную в лунке и прикрепленную к проводам с обеих сторон, и подвергающуюся электрической стимуляции. Авторы затем создали атриовентрикулярный биопровод, благодаря которому каждый кусочек ткани имеет отдельные области, похожие на предсердие и желудочек, которые можно изучать в одном и том же образце. Опять же, подчеркивая ключевое различие между инженерными тканями сердца и сердечными органоидами, эти атриовентрикулярные биопровода формируются путем добавления CMs предсердий и желудочков к противоположным концам микроячейки. Такая принудительная агрегация контрастирует с самоорганизованной структуризацией и формированием структуры в органоидах сердца. Однако, как и в случае со многими другими инженерными системами тканей сердца, целью таких тканей может быть не воспроизведение развития в масштабах органа, а создание системы, позволяющей эффективно моделировать заболевания и открывать лекарственные препараты in vitro.

Аналогичным образом, во многих других исследованиях сообщалось о методах, включающих посев клеток в формы, окружающие подпорку, которые затем могут быть использованы либо для механического растяжения тканей [121], либо для удержания тканей на месте при сокращении CMs [118-121], [123]. Интересно, что большинство из этих методов требуют дифференциации в монослое для создания кардиальных и стромальных типов клеток перед посевом в различные формы. Полученные ткани состоят из нескольких типов клеток, присутствующих в сердце (CMs, сосудистая сеть, эпикард-подобные клетки), и представляют собой привлекательную систему для моделирования заболеваний и поиска лекарств, так как полученные ткани обладают свойствами более похожими на свойства взрослой сердечной ткани. В этих моделях CMs выравниваются, формируются трубчатые эндотелиальные структуры, а эпикардиальные клетки располагаются к периферии ткани. Выравнивание и растяжение CMs может способствовать созреванию этих тканей, потенциально моделируя интересный процесс развития, важный для функционирования сердца. Эти ткани не демонстрируют заметной структурированности, что подчеркивает ключевое отличие от органоидов сердца. Тем не менее, эти ткани будут представлять невероятную ценность для областей регенеративной медицины и биологии развития, облегчая высокопроизводительное изучение сердечных тканей взрослых in vitro.

Применяя общие принципы органоидов - самоорганизацию, структурирование и формирование структуры, мы проводим различия между исследованиями, чтобы помочь внести ясность в быстро развивающуюся область. Основываясь на таких принципах, объединение концепций развивающихся органоидов сердца и камерных органоидов сердца с принципами биоинженерии представляется перспективным подходом. Как обсуждалось в [124 ], для этого, вероятно, потребуется согласование таких технологий, как микрофлюидика, инженерия клеточных поверхностей и высокопроизводительное масштабирование с врожденной способностью клеток-предшественников к самоорганизации и структурированию. Кроме того, как уже упоминалось, другие неорганоидные in vitro модели сердца, такие как микроткани и инженерные ткани сердца, предоставляют уникальные инструменты для создания взрослых тканей сердца in vitro для моделирования заболеваний и поиска лекарств. В целом, области сердечных органоидов/тканевой инженерии быстро развиваются и прогрессируют, и будет интересно увидеть, как эти технологии продолжат развиваться и совершенствоваться.