Посещений:
ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ piRNA



Структурные основы и механизм

Structural basis for piRNA targeting
• Todd A. Anzelon, • Saikat Chowdhury, • Siobhan M. Hughes, et al.
Nature volume 597, pages 285–289 (2021)

PIWI proteins use PIWI-interacting RNAs (piRNAs) to identify and silence transposable elements and thereby maintain genome integrity between metazoan generations1. The targeting of transposable elements by PIWI has been compared to mRNA target recognition by Argonaute proteins2,3, which use microRNA (miRNA) guides, but the extent to which piRNAs resemble miRNAs is not known. Here we present cryo-electron microscopy structures of a PIWI-piRNA complex from the sponge Ephydatia fluviatilis with and without target RNAs, and a biochemical analysis of target recognition. Mirroring Argonaute, PIWI identifies targets using the piRNA seed region. However, PIWI creates a much weaker seed so that stable target association requires further piRNA-target pairing, making piRNAs less promiscuous than miRNAs. Beyond the seed, the structure of PIWI facilitates piRNA-target pairing in a manner that is tolerant of mismatches, leading to long-lived PIWI-piRNA-target interactions that may accumulate on transposable-element transcripts. PIWI ensures targeting fidelity by physically blocking the propagation of piRNA-target interactions in the absence of faithful seed pairing, and by requiring an extended piRNA-target duplex to reach an endonucleolytically active conformation. PIWI proteins thereby minimize off-targeting cellular mRNAs while defending against evolving genomic threats.

Большинство животных производят по крайней мере два типа малых регуляторных РНК: miRNAs и piRNAs4. miRNAs регулируют мРНК во время развития, тогда как piRNAs защищают зародышевую линию от мобильных элементов. На молекулярном уровне miRNAs и piRNAs функционируют как проводники для белков Argonaute (AGO) и PIWI, соответственно, которые используют информацию о последовательности в малых РНК для идентификации транскриптов, предназначенных к репрессии.
Обширные исследования показали, что белки AGO класса miRNAs настраивают связывающие свойства miRNAs для распознавания коротких комплементарных сегментов на мРНК мишени5-8. AGO создают стартовую область miRNAs, предварительно организуя нуклеотиды 2-7, что снижает энтропийную стоимость связывания мишени9,10, и принимают структуру, препятствующую спариванию miRNAs с мишенью сразу после места старта11,12. Таким образом, сайты распознавания в miRNAs являются короткими и точно определенными, что позволяет отдельным miRNAs распознавать сотни мРНК и в совокупности целенаправленно воздействовать на более чем половину мРНК млекопитающих13.
Было высказано предположение, что piRNAs используют механизм целенаправленного воздействия, подобный механизму нацеливания miRNAs 2,3, и действительно, комплементарность небольшого сегмента является характерной чертой мишеней для piRNAs2,3,14-17. Однако отношения между piRNAs и их мишенями принципиально отличаются от отношений для miRNAs. Мишени miRNAs эволюционируют, чтобы быть узнанными, что благоприятно сказывается на развитии18. В отличие от этого, мишени piRNAs являются паразитическими генетическими элементами, которые находятся под селективным давлением, чтобы избежать распознавания, что говорит о пользе механизмов, адаптирующих piRNAs к эволюционирующим угрозам19. Кроме того, репертуар piRNA у животных обычно на порядок выше, чем у miRNAs20, это указывает на необходимость присутствия механизмов, позволяющих избегать замалчивания всего транскриптома зародышевой линии.
Кристаллические структуры белков PIWI насекомых, Drosophila melanogaster Piwi (DmPiwi) и шелкопряда Siwi, также указывают на то, что piRNAs могут отличаться от miRNAs21,22. Эти белки PIWI имеют трехмерное расположение доменов, которое отличается от такового у белков AGO, это указывает на то, что взаимодействие piRNA с мишенью формируется уникальным образом. В предыдущих исследованиях использовались образцы PIWI, содержащие гетерогенные смеси совместно очищенных piRNAs, что не позволило изучить взаимодействие piRNAs с мишенью. Таким образом, механизмы, лежащие в основе распознавания мобильных элементов с помощью piRNAs, а также степень сходства при целенаправленном воздействии piRNAs и miRNAs остаются неизвестными.

Source of homogenous PIWI-piRNA complexes


Белки PIWI из природных источников совместно очищаются вместе с гетерогенными смесями эндогенных piRNAs21,22, что затрудняет анализ целенаправленного воздействия. Поэтому мы искали рекомбинантную систему для получения гомогенных комплексов PIWI-piRNAs. Анализ белковых конструкций PIWI из различных животных показал, что белок Piwi-A из пресноводной губки E. fluviatilis23 (далее EfPiwi) может экспрессироваться рекомбинантно, может быть загружен с помощью химически определенной piRNA и очищен как стабильный комплекс PIWI-piRNAs. EfPiwi обычно экспрессируется в тотипотентных археоцитах E. fluviatilis24. Мы также идентифицировали конструкцию для получения комплекса Siwi-piRNAs, хотя и на более низких уровнях, чем EfPiwi (расширенные данные рис. 1a, b).

Unique structural features of the extended PIWI family


EfPiwi принадлежит к древней ветви дерева семейства PIWI, содержащей Drosophila Ago3, Mili, Hili и Zili, и отличается от ветви, содержащей Siwi и DmPiwi25 (расширенные данные рис. 1c). Таким образом, структурные особенности, общие для EfPiwi и Siwi/DmPiwi, могут быть сильно законсервированными в семействе PIWI. Мы использовали криоэлектронную микроскопию (крио-ЭМ) для определения структуры комплекса EfPiwi-piRNA с разрешением приблизительно 3,8 ангстрем (рис. 1a, b, расширенные данные табл. 1, расширенные данные рис. 2). Сравнение структур PIWI и AGO метазоа выявило две особенности, которые, вероятно, влияют на характер нацеливания членов расширенного семейства PIWI.



Рис. 1: Структурные особенности, уникальные для PIWI. a, Segmented EfPiwi-piRNA cryo-EM reconstruction, coloured by domain as indicated. b, Cartoon representation of the EfPiwi model. Disordered piRNA nucleotides are indicated by a dashed red line. The linear domain schematic is shown below. c, Density maps (grey mesh) in space occupied by seed regions of hAGO2 (PDB: 4OLA; top) and EfPiwi (bottom). Modelled guide RNAs are shown as red sticks. d, Superposition of miRNA-class AGO structures (left, PDB: 4KXT, 4OLA, 5VM9, 6OON) and known PIWI structures (right, PDB: 7KX7, 5GUH, 6KR6). AGO central-gate and PIWI seed-gate structures are indicated.

Во-первых, хотя наш образец содержал однородную piRNA, большинство нуклеотидов неупорядочены, включая 3' половину seed области (направляющие гид (g) нуклеотиды g5-g7) (рис. 1c). Белки AGO предварительно организуют 3' конец seed части, заключая g5-g6 в перекрученную петлю, которая прекрасно сохранилась в AGO. Эквивалентная петля в PIWIs содержит громоздкие остатки, которые препятствуют перегибу, необходимому для создания колыбели g5-g6 (расширенные данные рис. 3a, b). Поэтому, в отличие от AGOs, PIWIs белки не реорганизуют всю seed область piRNAs.
Во-вторых, как отмечалось ранее21 , трехсторонний интерфейс доменов L1, L2 и PAZ в PIWIs отличается от такового в AGOs. Важным следствием этого отличия является то, что остатки, соответствующие "центральным воротам" AGO, которые ограничивают взаимодействие гид-мишень в центральной области miRNAs11,12, вместо этого образуют небольшую α-спираль (спираль-6) вблизи seed области piRNAs (рис. 1b, расширенные данные рис. 3c-g). Поэтому у PIWI отсутствуют центральные ворота, а вместо них имеется расширенная центральная щель и удлиненная структура "seed ворот" (рис. 1d).

piRNAs are more selective than miRNAs


Чтобы определить, как структурные различия влияют на распознавание мишени, мы сравнили свойства EfPiwi, Siwi и человеческого Argonaute 2 (hAGO2), AGO-белка класса miRNA. EfPiwi и Siwi связывали РНК мишени с комплементарностью, ограниченной seed областью (g2-g7), с более чем в 150 раз меньшим сродством, чем hAGO2, нагруженный эквивалентной направляющей гид РНК (рис. 2a, b). Аналогично, оба белка PIWI связывали мишень с расширенной seed комплементарностью (g2-g8) с более чем 7-кратным снижением сродства по сравнению с hAGO2. Слабое сопряжение seed, по-видимому, обусловлено более высокой скоростью отсоединения мишени от PIWI, которые высвобождают РНК мишени с комплементарностью g2-g8 примерно в 7 раз быстрее, чем hAGO2 (рис. 2c). Увеличение комплементарности мишени за счет центральной области гид-последовательности (g9-g12) практически не повлияло на скорость высвобождения hAGO2, что согласуется с моделью, согласно которой hAGO2 избегает центрального сопряжения путем своих центральных ворот11,12 (рис. 2d, расширенные данные рис. 4). Напротив, для EfPiwi и Siwi скорость высвобождения мишени снижалась до уровня менее 1 х 10-3 мин-1 (период полураспада, t1/2 более 12 ч) по мере того, как комплементарность направляющей гид и мишени распространялась через центральную область (рис. 2d, расширенные данные рис. 4).



Fig. 2: piRNAs are more selective than miRNAs. a, The guide RNAs used in this experiment. b, Fraction of target RNAs bound by hAGO2-guide RNA, EfPiwi-guide RNA and Siwi-guide RNA complexes at equilibrium, plotted against the concentration of the protein-guide RNA complex. c, Release rates (dissociation rate, koff) of g2-g8 complementary target from protein-guide RNA complexes. d, Release of 32P-labelled target RNAs from the indicated protein-guide complexes in the presence of excess unlabelled target RNA over time. In b, c, n = 3 independent experiments, data are mean ± s.d.

Мы предполагаем, что различия в структурах PIWI и AGO приводят к различным свойствам целенаправленного воздействия для piRNAs и miRNAs. PIWI предварительно организуют минимальную затравку, делая piRNAs затравку намного слабее, чем miRNAs затравку . Однако, в отличие от AGO, у белка PIWI отсутствуют центральные ворота, и поэтому они могут компенсировать слабое сопряжение с seed за счет расширения взаимодействия piRNAs с мишенью в центральной области. Таким образом, piRNAs более избирательны, чем miRNAs, при идентификации мишеней и могут оставаться связанными с распознанными мишенями в течение гораздо более длительного периода времени.

The seed-gate enforces piRNA target-binding fidelity


Хотя область seed piRNA слабая, для распознавания мишеней для piRNA in vivo требуется идеальное совпадение seed2,3,14-17. Чтобы понять это требование, мы определили структуру комплекса EfPiwi-piRNA, связанного с РНК мишенью с комплементарностью к нуклеотидам piRNA g2-g16, с разрешением приблизительно 3,5 ангстрем (рис. 3a, b, Таблица 1 расширенных данных, Рис. 5 расширенных данных). Реконструкция содержит заметный дуплекс piRNA-РНК мишень длиной 15 п.н. (рис. 3a), который, по-видимому, переводит EfPiwi в более открытую конформацию (рис. 3c). Открытие EfPiwi влечет за собой смещение дуплекса ворота-seed, который перемещается примерно на 12 ангстрем, чтобы избежать столкновения с парами оснований 5-8 дуплекса piRNA-мишени (рис. 3д) и стыкуется с дуплексом на 3' конце участка seed (рис. 3е). Эти контакты, а также контакты доменов MID и PIWI, зондируют основу дуплекса piRNAs-мишени и минорную канавку, вероятно, обеспечивая тем самым идеальное сопряжение с участком seed piRNAs.



Fig. 3: Structural basis for piRNA target binding. a, Segmented cryo-EM reconstruction of an EfPiwi-piRNA-target RNA complex, coloured as in Fig 1. The piRNA-target base-pairing schematic is shown below. b, Cartoon representation of the EfPiwi-piRNA-target RNA model. c, Superposition of EfPiwi-piRNA (grey, semi-transparent) and EfPiwi-piRNA-target (coloured and solid) structures. The arrows indicate movements to the target-bound structure, and the dashed line indicates the hinge in the L1 stalk. d, Close-up view showing shifts in the seed gate of approximately 12 ? upon target binding. The arrows indicate the direction of movement from the guide-only to the target-bound conformation. e, Interactions between EfPiwi and the piRNA-target duplex around the seed region. f, Association rates of target RNAs with three consecutive mismatches binding wild-type EfPiwi(left) and EfPiwi(?seed gate) (right). n?=?3 independent experiments, data are mean ± s.d.

Примечательно, что несовпадения piRNA и мишени в 3' половине seed (g5-g7) практически отменяют связывание мишени, снижая скорость ассоциации kon более чем в 2000 раз по сравнению с мишенью в отсутствие несовпадений (рис. 3f, расширенные данные рис. 6). Связывание с мишенью с несовпадением на участке g5-g7 было восстановлено путем удаления seed gate (EfPiwi (Δseed gate), L520-H537 был заменен на линкер Gly6), что увеличило kon в 14 раз по сравнению с EfPiwi дикого типа (рис. 3f). EfPiwi(Δ seed gate) связывал мишень с несовпадениями на 5' конце seed (g2-g4) с той же скоростью, что и EfPiwi дикого типа. Напротив, EfPiwi(Δseed gate) связывал все мишени с неповрежденной комплементарностью seed примерно в 10 раз медленнее, чем дикий тип. Siwi(Δseed gate) вел себя аналогично (расширенные данные рис. 7a, b). Таким образом, seed gate обеспечивает точность нацеливания, способствуя распространению пары piRNA-мишень, инициированной на 5' конце seed, и ингибируя распространение дуплекса в отсутствие подходящей пары на 3' конце участка seed.

PIWI accommodates mismatches beyond the seed


За пределами области сопряжения с затравкой EfPiwi контактирует с основой дуплекса piRNA-мишень, но не определяет форму минорной канавки (расширенные данные, рис. 7c). Таким образом, EfPiwi может распознавать общую спиральную структуру дуплекса толерантно по отношению к отклонениям от геометрии А-формы и, следовательно, нечувствителен к периодическим несовпадениям за пределами seed. Действительно, по 3nt несовпадающие сегменты после затравки оказывают лишь незначительное влияние (2,5-кратное или менее) на скорость связывания мишени (рис. 3f), и большинство связанных мишеней диссоциируют в течение нескольких часов (расширенные данные рис. 6b, 7d, e). Таким образом, EfPiwi может связываться с мишенями, содержащими 3 или менее несовпадений последовательности в seed, с отличным сродством (константа диссоциации, значения KD в диапазоне pM-fM) (расширенные данные рис. 7f). Нечувствительность к несовпадениям за пределами seed может позволить piRNAs распознавать родственные или эволюционировавшие мобильные элементы.

Extensive piRNA 3' pairing activates target cleavage


PIWI часто эндонуклеолитически расщепляют РНК-мишени21,22,26. Активность расщепления EfPiwi и Siwi намного слабее, чем у hAGO2, но может быть стимулирована с помощью Mn2+ и повышения температуры (расширенные данные рис. 8a-e), это позволило нам охарактеризовать субстратные предпочтения мишени. Активность расщепления с помощью EfPiwi возрастала по мере расширения комплементарности к 3' концу piRNAs, достигая плато при расширении до g18 (рис. 4a, расширенные данные рис. 9a, b). Расщепление с помощью Siwi также увеличивалось по мере увеличения комплементарности 3', достигая плато при сопряжении g16 (расширенные данные рис. 9e, f).



Fig. 4: Extensive pairing activates piRNA-target cleavage. a, Representative denaturing gel showing intact and cleaved target RNAs, with increasing amounts of complementarity to a piRNA, after incubation with excess EfPiwi-piRNA for 1 h. Results are representative of 3 replicates. b, Relative number of RNA sequencing reads of cleavage products after treating a pool of 256 target RNAs with excess EfPiwi-piRNA. The heat map indicates the number of mismatches opposite piRNA nucleotides g11-g18 in each sequence. The dashed line denotes the 26 most abundant products. n?=?3 independent experiments, data are mean ± s.d. c, Three examples of 2D class averages of EfPiwi-piRNA complex bound to a target with complementarity from g2-g25. Scale bar, 5 nm. d, 3D cryo-EM reconstruction fit with the MID/PIWI lobe and extended piRNA-target duplex. The piRNA 3? end is indicated. e, Docking the EfPiwi-piRNA-target model with pairing limited to g2-g16 (Fig. 3) reveals that the N, L1 and PAZ domains sterically clash (gold highlights) with the extended piRNA-target duplex.

Мы исследовали, как несоответствия на 3' конце piRNAs влияют на расщепление (расширенные данные рис. 9c, d). Пул из 256 последовательностей РНК мишени с комбинациями несоответствий g11-g18 обрабатывали избытком EfPiwi-piRNAs. Секвенирование продуктов расщепления РНК показало, что на верхние 10% (26 из 256 последовательностей) приходилось 80% всех событий расщепления и не содержалось сегментов с 3' или более последовательными несоответствиями (рис. 4b, расширенные данные рис. 9f). Таким образом, нуклеазная активность EfPiwi определяется расширенным 3' сопряжением, оптимально с 2 или менее несоответствиями на 3' конце piRNAs.

Extended pairing drives EfPiwi into an open conformation


Мы также исследовали структуру EfPiwi-piRNAs, связанной с РНК мишенью, комплементарной g2-g25, методом крио-ЭМ. Хотя дуплекс piRNA-мишень был очевиден в 2D, EfPiwi оказался меньше, чем ожидалось (рис. 4b). Трехмерная реконструкция с разрешением приблизительно 7,0 ангстрем соответствовала доменам MID и PIWI, связанным с концом дуплекса piRNA-мишень (рис. 4c). Исследование (Docking ) полной модели EfPiwi-piRNA-мишени (с сопряжением с g2-g16) показал, что после положения 15 расширенный дуплекс piRNA-мишень стерически сталкивается с сегментами доменов N, L1 и PAZ (рис. 4d). Поэтому удлиненное сопряжение piRNA-мишени приводит к раскрытию центральной щели до такой степени, что вся доля N-L1-PAZ-L2 становится конформационно несвязанной с долей MID-PIWI.
Мы предполагаем, что нуклеазная активность EfPiwi может быть активирована расширением центральной расщелины, вызванным образованием удлиненного дуплекса piRNA-мишени. Несовпадающие сегменты длиной не менее 3 нт могут придавать гибкость дуплексу направляющей гид РНК-мишень, уменьшая склонность к открытию расщелины и стимулированию расщепления. Продукты расщепления piRNA, идентифицированные в семенниках мыши, обычно не содержат несовпадающих сегментов длиной 3 нт и более15,17,27, а расщепление мишени иммуно-очищенных Miwi также требует высокой комплементарности piRNA-мишень26.

Обсуждение


piRNAs и miRNAs являются древними генетическими регуляторами, которые, возможно, помогли начать эру многоклеточной жизни животных4. Многие животные также производят малые интерферирующие РНК (siRNA), которые обычно ассоциируются с отдельным классом siRNA белков AGO25, который остается не изученным на структурном уровне. Наши результаты показывают, что белки AGO класса PIWI и miRNAs обладают различными структурными особенностями, что позволяет piRNAs и miRNAs выполнять различные роли в эволюции животных.
Основной функцией piRNAs является поиск и подавление мобильных элементов. Учитывая огромное разнообразие репертуара piRNAs, нацеливание должно быть достаточно строгим, чтобы избежать случайного замалчивания клеточных РНК. EfPiwi достигает этого путем создания слабых seed и тщательного контроля сопряжения через ворота seed. Поэтому комплементарность участка seed необходима, но недостаточна для распознавания мишени. Для расщепления мишени требуется дуплекс piRNA-мишень, достаточно сильный для активации эндонуклеазного механизма. Строгость может также регулироваться недавно обнаруженным фактором, стимулирующим расщепление28. Избирательность на этапе расщепления мишени может помочь защитить от попадания клеточных РНК в пути биогенеза piRNAs через цикл пинг-понга1.
С другой стороны, гибкость в распознавании мишени позволит piRNAs реагировать на эволюционирующие последовательности мобильных элементов19. Гибкость целенаправленного воздействия в плане связывания обеспечивается за пределами seed, где центральная щель PIWI безразлична к несовершенству спирали, возникающему при несовпадении piRNA и мишени, так что связывание высокого сродства требует меньшей комплементарности, чем расщепление in vitro. Примечательной особенностью комплекса PIWI-piRNAs является то, что высвобождение связанных молекул-мишеней происходит очень медленно, подобно времени жизни наиболее стабильных мРНК в эмбриональных стволовых клетках29. Таким образом, после того как PIWI свяжет мишень, она потенциально может оставаться связанной до конца существования транскрипта. Мы предполагаем, что распознавание мобильных элементов может включать накопление нескольких комплексов PIWI-piRNAs на каждом транскрипте-мишени, что приводит к мультивалентным ассамбляжам, которые рекрутируют гистоны и/или факторы метилирования ДНК к локусам мобильных элементов в ядре30-33, или перемещают цитоплазматические транскрипты в фазово разделенные компартменты, которые связаны с замалчиванием и производством piRNAs34. Мы предполагаем, что, формируя взаимодействие piRNA с мишенью, PIWI могут использовать огромный пул piRNA для ограничения выхода мобильных элементов из-под надзора при минимизации смещения мишени, и таким образом поддерживать зародышевые линии метаза на протяжении последних 800 миллионов лет...

Построение и уточнение модели


Начальная модель EfPiwi была получена путем наложения первичной последовательности EfPiwi на кристаллическую структуру Siwi (PDB: 5GUH) с помощью SWISS-MODE46. Затем дискретные домены были пристыкованы к реконструкции EfPiwi-piRNAs с помощью UCSF Chimera, а затем вручную построены модели с помощью Coot47. Модель EfPiwi-guide-target была построена аналогичным образом, используя структуру EfPiwi-guide в качестве начальной модели. Модели уточнялись путем итеративных раундов ручного построения и исправления геометрических и ротамерных выбросов в Coot и уточнения в реальном пространстве с оптимизацией глобальной минимизации, параметров атомного смещения и поиска локальной сетки с помощью PHENIX48. Сопряжение оснований между направляющей гид РНК и РНК мишени поддерживалось путем включения атомов водорода. Большинство остатков в N-домене обеих моделей были усечены до аланина в конце уточнения, чтобы отразить отсутствие подтверждающей плотности крио-ЭМ. Оценку моделей проводили с помощью серверов MolProbity (http://molprobity.biochem.duke.edu)49 и PDB валидации (https://www.rcsb.org). Структурные фигуры были сделаны с использованием PyMOL (Schradinger, LLC) и UCSF ChimeraX50. Предсказание структуры seed-gate у большего числа членов семейства Piwi было выполнено с помощью PSIPRED 4.051,52. Структура EfPiwi была сравнена с предыдущими структурами AGO человека53-55 на рис. 1.