Концепция эмбрионального развития и определения судьбы клеток была проиллюстрирована знаменитой ландшафтной моделью Waddington, несколько десятилетий назад (Waddington, 1957). Модель Уоддингтона не только показывает важность пространственно-временной точности в дифференциации клеток, но и представляет предопределение клеточной судьбы как последовательное и необратимое событие. В этой иерархической модели эндодерма следует по путям развития вниз и постепенно дифференцируется во множество типов энтодермальных клеток, включая панкреатические клетки. Аналогично, мезодерма остается на путях мезодермальной линии и дифференцируется в эндотелиальные клетки и другие типы мезодермальных клеток. Однако в последние десятилетия многочисленные исследования позволили предположить, что детерминированные клетки способны дифференцироваться преодолевая границы зародышевого слоя путем преобразования эмбриональных и/или взрослых мезодермальных фибробластов в эктодермальные нейрональные клетки (Vierbuchen et al., 2010), мультипотентные нейральные стволовые клетки (Ring et al., 2012), энтодермальные гепатоцитоподобные клетки (Huang et al., 2011; Sekiya and Suzuki, 2011) или панкреатические β-подобные клетки (Zhu et al., 2016) in vitro. Эти исследования подчеркивают возможность преобразования мезодермальных клеток в эктодермальные или энтодермальные клетки in vitro. Несмотря на обширные исследования по преобразованию клеточной судьбы между слоями зародыша in vitro, количество исследований in vivo ограничено. Эктопическая экспрессия Xsox17β у эмбрионов Xenopus привела к перемещению клеток, обычно предназначенных для превращения в эктодерму, в эпителий кишечника, что указывает на возможное изменение судьбы клеток in vivo (Clements and Woodland, 2000). Аналогично, эктопическая экспрессия sox32/casanova в предполагаемых эндотелиальных клетках переключила их клеточную судьбу на эндодерму у эмбрионов рыбок данио (Kikuchi et al., 2001). Более того, агрегированные морулы и химерные мышиные эмбрионы мутантов β-катенина предоставили доказательства формирования прекардиальной мезодермы в энтодермальных тканях in vivo (Lickert et al., 2002). Эти исследования позволяют предположить, что классические границы зародышевых слоев in vivo могут быть не столь четкими, как считалось ранее.

В данном исследовании мы стремились выяснить значение сосудистой сети в регенерации панкреатических клеток, которая играет решающую роль в потенциальных терапевтических стратегиях против диабета. Мы использовали мутантов рыбок данио cloche в качестве аваскулярной модели. Мутация npas4l, главного регулятора судьбы эндотелиальных и гемопоэтических клеток, ответственна за тяжелую потерю большинства эндотелиальных клеток и клеток крови у мутантов cloche (Parker and Stainier, 1999; Reischauer et al., 2016; Stainier et al., 1995). Неожиданно мутация npas4l индуцировала эктопическое образование β-клеток в мезенхимной области за пределами поджелудочной железы после устранения там β-клеток. Клональное отслеживание мезодермальных клеток, экспрессирующих дракулин (drl), npas4l и etsrp (ранее названный etv2), подтвердило мезодермальную линию эктопических β-клеток, которые в норме имеют энтодермальное происхождение. Эти результаты позволяют по-новому взглянуть на предопределение судьбы клеток и найти альтернативный источник β-клеток.

В этом исследовании мы сначала изучили роль кровеносных сосудов в регенерации клеток у мутанта cloche рыбок данио, который несет гомозиготную мутацию npas4l (Reischauer et al., 2016). Затем мы неожиданно обнаружили эктопическую регенерацию β-клеток в мезенхимной области. Эктопические β-клетки, вероятно, были функциональными, поскольку они экспрессировали несколько эндокринных и β-клеточных маркеров, включая Isl1, mnx1 и pcsk1, и были способны реагировать на глюкозу, вызывая колебания кальция во время регенерации β-клеток, хотя мы не знаем, обладают ли они всеми характеристиками полноценных β-клеток. Сочетая гибридизацию in situ, прослеживание линий и конфокальную микроскопию, мы успешно проследили происхождение эктопических β-клеток до мезодермальной линии. В недавнем исследовании сообщалось о превращении сосудистых предшественников при дефиците Etsrp в клетки скелетных мышц и подчеркивалась пластичность предопределения судьбы мезодермальных клеток в пределах одного зародышевого слоя (Chestnut et al., 2020). Наши данные продемонстрировали пластичность дифференцировки клеток в разных зародышевых слоях in vivo, т.е. переключение с мезодермальной на энтодермальную судьбу в условиях регенерации, в то время как гаструляция и определение судьбы клеток в зародышевых слоях считаются необратимыми в процессе развития. Эктопическая поджелудочная железа наблюдалась и ранее, например, у мышей-мутантов Hes1 (Fukuda, 2006; Sumazaki et al., 2004), хотя было показано, что это происходит за счет расширения поджелудочной железы, а не за счет изменений в предопределении судьбы клеток в органах или зародышевых слоях (Jorgensen et al., 2018). Наше открытие, насколько нам известно, является первой демонстрацией эктопических β-клеток мезодермального происхождения in vivo.

Недавнее геномное исследование эмбрионов рыбок данио подтвердило решающую роль npas4l в ранней спецификации эндотелия и крови, поскольку экспрессия некоторых эндотелиальных и гемопоэтических генов, таких как tal1, etsrp, lmo2, gfi1aa и gata1a, была снижена у гомозиготных мутантов npas4l (Marass et al., 2019), предполагая, что некоторые популяции мезодермальных клеток, возможно, не приобрели свои назначенные клеточные судьбы и оставались в более пластичном состоянии. В соответствии с важной ролью etsrp в определении судьбы эндотелиальных клеток, Chestnut et al., 2020 сообщили о значительном уменьшении кластеров эндотелиальных клеток и эндотелиальных клеток-предшественников у гомозиготных мутантов etsrp при RNA-seq анализе одиночных клеток. Интересно, что они также показали значительное увеличение кластера мезодермы латеральной пластинки, что указывает на возможность того, что в гомозиготных мутантах etsrp остался больший пул более универсальных мезодермальных клеток. Однако из этих транскриптомных данных трудно сделать вывод о том, почему эти мезодермальные клетки с нарушенными клеточными судьбами будут компетентны дифференцироваться в эктопические инсулин-экспрессирующие β-клетки, поскольку популяция этих компетентных мезодермальных клеток может быть очень мала по сравнению с количеством эктопических β-клеток, которые мы наблюдали, а их РНК-секвенирование в одиночнфх клеткакх не проводилось после абляции β-клеток.

Поскольку мы смогли проследить происхождение эктопических β-клеток от линий drl, npas4l и etsrp, мы полагаем, что универсальная мезодерма боковой пластинки, расположенная близко к поджелудочной железе, может способствовать регенерации β-клеток у мутантов npas4l или морфантов etsrp. Отслеживание линий с помощью ранних мезодермальных, энтодермальных и эндокринных маркеров и сортировка этих клеток, отслеженных по разным линиям, могут быть необходимы для транскриптомного исследования одиночных клеток, чтобы полностью понять клеточный статус этой небольшой популяции универсальных клеток и далее выяснить лежащие в основе молекулярные механизмы. До расшифровки этих механизмов мы не можем формально исключить возможность того, что механизмы образования эктопических клеток у мутантов npas4l и морфантов etsrp могут быть разными.

Мутировавший ген у мутанта cloche был назван npas4l, поскольку кодируемый им белок имеет общую гомологию с NPAS4 человека (Reischauer et al., 2016). Хотя введение мРНК NPAS4 человека или мРНК npas4l рыбок данио в эмбрионы cloche-мутанта рыбок данио на одноклеточной стадии может спасти мутантов, нокаутные мыши Npas4 вряд ли будут иметь такие же серьезные сосудистые и кроветворные дефекты, как мутанты npas4l рыбок данио, поскольку нокаутные мыши Npas4 доживают до взрослого возраста (Lin et al., 2008). Это несоответствие предполагает, что другие члены семейства белков NPAS млекопитающих или другие белки могут быть функционально избыточными по отношению к NPAS4 в развитии сосудов и кроветворения. Было показано, что NPAS4 млекопитающих выполняет важные клеточно-автономные функции в β-клетках (Sabatini et al., 2018; Speckmann et al., 2016). У рыбок данио npas4a является основным паралогом npas4, экспрессируемым в β-клетках (Tarifeno-Saldivia et al., 2017), что означает, что маловероятно, что фенотип, выявленный нами на ранних стадиях развития у мутантов npas4l, связан с функциями Npas4 в β-клетках. Дальнейшие исследования NPAS4, родственных bHLH транскрипционных факторов и ETV2 у млекопитающих должны прояснить, способствует ли инактивация этих факторов формированию β-клеток с существенным нарушением развития клеток крови и сосудов или без него.

В целом, мы показали, что мутация npas4l и нокдаун etsrp вызывают эктопическое перерождение β-клеток из мезодермы. Наши результаты свидетельствуют о пластичности мезодермальных клеток для дифференцировки в энтодермальные клетки, включая β-клетки (рис. 7). Будущие исследования по ограничению этой пластичности не только расширят наше понимание роли Npas4l и Etsrp в определении судьбы клеток, но и помогут использовать альтернативный источник для регенерации клеток.



Figure 7 Npas4l/Etsrp restricts the plasticity of the mesoderm.