Основной целью биологии развития является понимание детального молекулярного прогресса всех эмбриональных клеточных линий, от плюрипотентности до взрослой жизни, и того, как клеточные сигнальные пути контролируют выбор линии на каждом этапе дифференцировки. Технологии профилирования регуляции эмбрионального транскриптома с разрешением в одну клетку стали ключевым направлением исследований для этой цели и, следовательно, заложили основу для механистического понимания дефектов развития. Симпозиум "Одноклеточная революция: Эмбриогенез с высоким разрешением", представленный на 60-й ежегодной встрече Общества по изучению и профилактике врожденных пороков развития, рассказал о некоторых основных концепциях профилирования одноклеточных структур, о том, как эта новая технология формирует наше понимание развития эмбриона, а также о возможностях и проблемах для выяснения тератологических механизмов с точностью до одной клетки (https://www.birthdefectsresearch.org/meetings/2020/).

Секвенирование следующего поколения (например, RNA-seq), ставшее возможным благодаря достижениям в области геномики, вывело молекулярное профилирование на передний план в понимании того, как эмбрион реагирует на физиологические очередности (queues), возникающие в процессе развития, и токсические воздействия. Анализ объемных тканей усредняет эти эффекты в пределах клеточной популяции и тем самым маскирует клеточное разрешение, необходимое для точного определения реакции. Методы пространственной локализации, такие как гибридизация in situ и иммуногистохимия, могут локализовать эти реакции, но только для нескольких генов или белков за раз. Одноклеточная транскриптомика (scRNA-seq) позволяет получить полное представление о динамике экспрессии генов, которая программирует или отражает состояние отдельных клеток в ответ на генетические сигналы, физиологические очереди в микросреде и/или клеточную адаптацию к токсикологическому стрессу. Это позволяет проводить комплексный анализ фундаментальной единицы тканевой организации - клетки, каждая из которых имеет свою уникальную родословную, динамику состояния и микрофизиологию. Сочетание scRNA-seq с другими одноклеточными модальностями (например, in toto imaging, CRISPR/Cas9) и реконструктивной вычислительной биологией представляет собой новый мощный подход к пониманию молекулярной картографии систем формирования паттерна в ходе эмбриогенеза и патогенеза (Cao et al., 2019; Chan et al., 2019; Keller, Schmidt, Wittbrodt, & Stelzer, 2008; McDole et al., 2018; McKenna & Gagnon, 2019; Megason, 2009; Pijuan-Sala et al., 2019; Sladitschek et al., 2020).

Впервые представленная в 2009 году, scRNA-seq сегодня насчитывает более 385 подходов (по состоянию на март 2019 года) для предсказания судьбы клеток при дифференцировке (Leuken & Theis, 2019; Ziegenhaein et al., 2017). Типичный рабочий процесс показан на рисунке (Figure 1).



Figure 1 Single-cell RNA-seq reconstruction of gene expression dynamics during embryogenesis. Time-variant experimental tissue samples are prepared by various dissociation methods with microfluidics to isolate and capture individual cells for individual cDNA barcoding. After multiplex RNA-seq analysis, gene ? cell matrices are normalized and processed to identify differentially expressed genes (DEGs). Those highly variable genes (HVGs) are then selected for deconvolution by analytical methods such as t-SNE (t-distributed neighbor embedding) that cluster cells by their individual HVG profile and subsequently reconstruct cell lineage and cell state relationships in pseudotime

Для высвобождения и захвата тысяч клеток необходима определенная форма диссоциации клеток. Ключевым вопросом является знание того, насколько хорошо различные типы клеток и их транскриптомы переносят протоколы подготовки, необходимые для получения изолированных клеток из интактной ткани. Различные методы захвата включают микролуночные планшеты (microwell-seq) (Han et al., 2018), высокопроизводительную инкапсуляцию капель (Drop-Seq, inDrops) (Klein et al., 2015) или одноклеточную комбинаторную индексацию (sci-seq) (Cao et al., 2017). Микрокапельные методы используют микрофлюидику для регистрации образца на тысячи крошечных капель, содержащих отдельные клетки. На практике это, как правило, распределение Пуассона - многие капли содержат 0, некоторые - 1, а некоторые - 2 клетки. Отдельные клетки лизируются, и мРНК подвергается обратной транскрипции при мультиплексном секвенировании.

Библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) штрих-кодируются различными метками, которые позволяют отнести их к исходной клетке. Это позволяет объединить транскриптомы отдельных клеток после обратной транскрипции для мультиплексного секвенирования. Штрих-коды идентифицируют отдельные мРНК, транскрибированные с одной и той же геномной последовательности. Штрих-кодирование может также включать маркировку уникальными молекулярными идентификаторами, которые служат для различения чтений секвенирования с одного и того же транскрипта мРНК от отдельных мРНК, транскрибированных с одного и того же гена. Протоколы настраиваются для оптимизации желаемых компромиссов в производительности, длине чтения, глубине секвенирования и покрытии клеток (Leuken & Theis, 2019).

Матрица количества прочтений генов и клеток строится путем выравнивания прочтений по эталонному геному или транскриптому. Для контроля качества анализируется несколько показателей, включая количество отсчетов на штрихкод (глубина отсчета), количество генов на штрихкод (пороговые значения) и доля отсчетов от митохондриальных генов на штрихкод (признак разрушенной плазматической мембраны). Различные подходы могут быть использованы для фильтрации технических артефактов (например, умирающих клеток, дублетов), эффекта партии, ошибок ПЦР и избыточного секвенирования, которые могут создавать искусственные кластеры клеток. Это важная область для современного развития биоинформатики, особенно для исследований, где стоимость, связанная с глубиной секвенирования, может быть снижена за счет фокусировки на конкретных мишенях (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/551762v2). Уровни экспрессии различных генов обычно нормализуются, чтобы высоко экспрессируемые гены не подавляли сигнал низко экспрессированных генов. Матрица нормализованных генов на количество клеток является отправной точкой для снижения размерности (Leuken & Theis, 2019). Дифференциально экспрессированные гены (DEGs) далее идентифицируются, чтобы сосредоточиться на высоко вариабельных генах (HVGs) (Klein et al., 2015). Таким образом, биологическое многообразие, на котором расположены траектории клеточной экспрессии, может быть в достаточной степени описано в HVGs. Важный компромисс заключается в том, чтобы отличить HVG от артефактов секвенирования.

Двумя распространенными методами визуализации для кластеризации клеток являются t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) и Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Например, график t-SNE отображает клетки в отдельные кластеры на основе корреляции ближайших соседей в профилях экспрессии HVG, что концептуально похоже на то, как BLAST находит ближайшее соответствие в базе данных последовательностей. Затем кластеры могут быть аннотированы на основе того, какие маркерные гены они содержат (Kiselev, Andrews, & Hemberg, 2019). Несмотря на широкое применение, t-SNE лучше всего рассматривать как грубый инструмент визуализации. Он ограничен потерей крупномасштабной информации о межкластерных связях, медленным временем вычислений и неспособностью осмысленно представлять очень большие наборы данных. UMAP сохраняет больше структуры данных, чем t-SNE, и с меньшим временем выполнения (Becht et al., 2019). Это обеспечивает больший охват и разрешение переходных состояний между основными кластерами клеток. Клетки, не отнесенные к основному эталонному кластеру, имеют большой потенциал для понимания клеточной динамики, поскольку они могут отражать ранее не распознанные или новые состояния, которые отражают непрерывные изменения в транскриптоме, иначе не обнаруживаемые при анализе объемных тканей. Диверсификация линий и состояний может быть представлена как континуум развития с помощью динамических моделей экспрессии генов (вывод траектории), которые отображают клеточную плотность в "псевдовремени". Концепция псевдо-времени в одноклеточном коллекторе заключается в реконструкции временных отношений между состояниями клеток, профилированными в реальном времени (см. Saelens, Cannoodt, Todorov, & Saeys, 2019).

Поскольку континуальные многообразия экспрессии генов снижают размерность расстояний между клетками до виртуальных псевдо-временных траекторий состояний, возникает вопрос, как мы применим scRNA-seq для лучшего понимания процессов развития и патогенеза. Для этого необходимо рассмотреть ряд технических проблем, помимо обычных соображений контроля качества для обычного исследования микрочипов: оценка того, насколько хорошо транскриптомы отдельных клеток выдерживают протоколы диссоциации тканей для получения изолированных клеток из составной системы; сохранение происхождения отдельных клеток при параллельном глубоком секвенировании тысяч клеток; отличие высоко вариабельных генов (HVGs) от технического шума (например, артефакты ПЦР и избыточное секвенирование); и вычислительная реконструкция составной системы из отдельных клеточных кластеров для окончательного развития клона и переходных состояний.

Всеобъемлющие "клеточные атласы", построенные на основе данных scRNA-seq для простых модельных организмов (SMOs), демонстрируют уникальные преимущества в картировании траекторий развития в течение эмбриогенеза. Например, SMOs Caenorhabditis elegans, Planaria и Drosophila поддаются прямому анализу клеточных линий и демонстрируют фундаментальный принцип сохранения передачи клеточных сигналов (Cao et al., 2017; Karaiskos et al., 2017; Plass et al., 2018).

Для классического анализа траекторий развития в анатомически простом организме характерна полная история клеточных линий всех 959 ядер соматических клеток круглого червя, однако знания о молекулярном состоянии каждой клетки фрагментарны. Профили scRNA-seq 50 000 фиксированных клеток, взятых на личиночной стадии L2 (762 соматические клетки на личинку), дали 42 035 штрих-кодированных транскриптомов при глубине секвенирования ~20 000 чтений на клетку, в среднем 431 HVG на клетку. Графики t-SNE сформировали 29 отдельных клеточных кластеров от 131 до 13 205 (31,4% популяции) клеток (рис. 2a). По меньшей мере 10 типов клеток можно было аннотировать с помощью известных маркерных генов, а также было выявлено несколько новых состояний (Cao et al., 2017).



Reconstruction of spatial-temporal dynamics of gene expression defined by scRNA-seq profiling in SMO systems. (Upper left) Caenorhabditis elegans decomposed into 29 main clusters at the L2 larval stage (Cao et al., 2017); (upper right) decomposition of adult planaria (regenerative) into multiple cell states and computational reassembly of divergent lineages in a globally regenerative system (Plass et al., 2018); and (bottom) Drosophila, patterning in a digital embryo visualized during segmentation (Karaiskos et al., 2017)

Плоский червь представляет собой интересную SMOs благодаря своей способности регенерировать части тела из популяции плюрипотентных стволовых клеток во взрослом состоянии, которые могут дифференцироваться в полный набор типов клеток и тканей. Комплексный клеточный атлас, построенный на основе данных scRNA-seq, реконструировал древовидную структуру линий, указывающую на взаимосвязи (рис. 2b). Это создает основу для дальнейших исследований, направленных на обратное клеточное перепрограммирование дерева регенеративных линий (Plass et al., 2018).

Являясь одной из основных животных моделей для изучения генетики развития и формировани молекулярного паттерна, характеристика динамики экспрессии генов на уровне од βночных клеток у плодовой мушки дает новое представление о генетических принципах организации, формирующих план тела (Karaiskos et al., 2017). Drop-seq охарактеризовал более 10 000 клеток при глубине чтения более 8 000 генов на клетку, а участки tSNE аннотировали 84 клеточных кластера, представляющих 87% клеток эмбриона. Поскольку многие из ключевых транскрипционных факторов и сигнально-рецепторных градиентов, определяющих идентичность клеточных кластеров, были нанесены на цифровые карты с помощью традиционной гибридизации in situ (ISH), HVG, полученные на графиках t-SNE, могут быть пространственно реконструированы с помощью "виртуального ISH" для цифровой визуализации и вычислительного прогнозирования их траекторий развития (рис. 2c).

Всесторонние клеточные атласы создаются для моделирования динамики экспрессии генов, когда клетки приобретают определенные судьбы в процессе морфогенеза и дифференцировки. По сути, нам необходимо понять, как HVGs определяют в псевдовремени "грамматику развития" у более анатомически сложных видов, часто используемых для экспериментальной эмбриологии (например, Ascidian, Danio, Xenopus).

Оболочечные представляет собой интересный вид SMO, поскольку у них развиваются хорда и спинной полый нервный тяж, но не метамерная схема (например, как это у беспозвоночного хордового), и он имеет относительно простую клеточную линию. С помощью scRNA-seq была определена полная история экспрессии генов для каждой клетки на каждом делении вплоть до гаструляции (стадия от 2 до 64 клеток), что дало 6,65 млрд. scRNA-seq-откликов на 1042 клетки 58 эмбрионов (более 8 K генов на клетку); кроме того, физическое положение каждой клетки было визуализировано с помощью цифровой микроскопии светового листа (Sladitschek et al., 2020). Сочетание прослеживания линий и визуализации in toto позволило создать онлайн библиотеку "цифрового эмбриона", где отдельные гены могут быть выбраны и визуализированы с помощью vISH при динамическом моделировании по мере формирования осевого плана тела (http://digitalembryo.org). Пример показан на рисунке 3а для двух генов (chordin, nodal), которые определяют раннее формирование предшественника хорды. Цитируя авторов: "Способность отслеживать систематические, количественные и пространственно разрешенные изменения экспрессии генов в масштабах генома каждой клетки при каждом клеточном делении у эмбрионов откроет новую эру в биологии развития" (Sladitschek et al., 2020).



Gene expression dynamics during early development in Chordate models. (Top) Ascidian, showing dynamic vISH for two patterning genes selected and viewed dynamically from the vegetal pole (left image) and animal pole (right image). Simulated expression of chordin (top) and nodal (bottom) are represented in red shading between the 4- and 64-cell stage in pseudotime executed from the http://digitalembryo.org cell atlas (Sladitschek et al., 2020). (Bottom) Zebrafish developing between 4- and 24-hpf stage (Wagner et al., 2018). Left panel: a comprehensive map of lineage and state with cell diversification trajectories for 105 individual cells. Middle panel: canalization plot colored by trans-specification potential. Right panel: classical Turing-like representation of canalized cell trajectories for normal and chordin CRISPR/Cas9 injection; chordin crispants showed no new cell types but displayed a change in abundance of different cell types (from the work of Megason, Wagner, and Klein)

Два знаковых исследования на рыбках данио заложили основу для понимания прочности роста и формы с помощью одноклеточной визуализации и секвенирования. В одном исследовании Drop-seq использовалось для построения древовидной линии из 38 731 клеток, полученных от 694 эмбрионов на 12 стадиях, начиная с 3,3 часа после оплодотворения (hpf) (бластула, сразу после начала зиготической транскрипции, когда большинство клеток являются плюрипотентными) до 12 hpf (фарингула, стадия 6 сомитов, когда многие клетки приобретают дифференцированную судьбу) (Farrell et al., 2018). Поскольку стадия фарингулы является филотипической, например, когда сохранение клеточной сигнализации наиболее очевидно в становлении плана тела позвоночных, принципы организации, вероятно, также сохраняются. Линейное дерево повторило траектории развития 25 кластеров клеток. Большинство аннотированных типов клеток были известны из классической эмбриологии; однако исследование выявило переходные состояния в развитии, что соответствует континууму в псевдо-генном многообразии. Другое знаковое исследование рыбок данио отобразило ландшафт экспрессии генов с помощью inDrops scRNA-seq на более чем 92 000 клеток на семи стадиях для создания комплексной карты траекторий клеточных состояний и клеточных линий в развитии рыбок данио в первые 24 hpf (Wagner et al., 2018). Различные алгоритмы, созданные для вывода ландшафтов экспрессии, определили критические точки ветвления по меньшей мере для 10 типов клеток в непрерывном многообразии состояний с течением времени. Когда данные scRNA-seq были сшиты в раскрашенную по времени схему силового направления, виртуальная реконструкция карты судьбы выявила альтернативные пути с разной степенью перекрытия различных траекторий. Для формального представления надежности траекторий и связей вне дерева авторы присвоили "балл канализации" (рис. 3б).

Канализация (после модели Тьюринга) означает тенденцию развития определенного генотипа по одной и той же траектории в различных условиях (Hallgrimsson, Willmore, & Hall, 2002). Большинство траекторий развития слабо канализированы (например, нервная пластинка, сомитная мезодерма), но некоторые были средне (хордf) или сильно канализированы (зародышевая линия). Поэтому in silico картирование судьбы вдоль ветвей многообразия клеточных линий предполагало несоответствие с прогрессией клеточных состояний (Wagner et al., 2018). Чтобы более точно оценить, как клеточное состояние эволюционировало с течением времени, они использовали линейное кодирование "TracerSeq" с транспозоном Tol2 для оценки тех же клеток dо всем разнообразии. Авторы обнаружили, что клетки могут быть близки по состоянию, но далеки по родословной, демонстрируя не-бинарную смежность с широкими континуумами пространства состояний, сложными схемами ветвления и петлями. Сложная линейных состояний архитектура динамики экспрессии генов подкрепляет парадигму о том, что некоторые клетки сохраняют многосоставной потенциал и могут переходить от одной траектории развития к другой.

Селективное преимущество канализации может заключаться в контроле надлежащего числа клеток во время приобретения клеточной судьбы (bootstrapping) и в детерминанте поведения системы в процессе развития при возмущении генетическими или экологическими факторами (буферизация). Сравнение траекторий у рыбок данио (Wagner et al., 2018) и Xenopus (Briggs et al., 2018) показало, что ортологичные гены демонстрируют в целом вариабельную экспрессию, специфичную для клеточного состояния, (30% консервативны), а транскрипционные факторы являются наиболее консервативными. Это указывает на "функцию над последовательностью", когда транскрипционный контроль генной регуляторной сети и физиологические гены кооптируются в пути для специфической клеточной сигнализации, метаболизма и гомеостаза.

Подавляющее большинство клеточных линий у млекопитающих происходит из слоя эпибласта раннего эмбриона во время гаструляции и раннего органогенеза (эмбриональные дни E6.5-E8.5 у мыши, 14-17 дни после оплодотворения у человека). В этот период также происходит расшифровка фундаментального плана организма посредством формирования примитивной полоски, определяющей передне-заднюю (например, голова-хвост) ось.

У мыши гаструляция начинается на стадии яйцевого цилиндра (E6.25), когда клетки из задней части эпибласта сходятся на средней линии и проходят эпителиально-мезенхимальный переход. Примитивная полоска продвигается в переднем направлении и завершается формированием задних областей к стадии головной пластинки (E8.5). График t-SNE был составлен из 116 312 клеток, полученных с помощью scRNA-seq в девяти временных точках между E6.5 и E8.5, от плюрипотентности до всех основных эмбриональных линий (Pijuan-Sala et al., 2019). Эти авторы аннотировали 37 основных кластеров на основе известных генов-биомаркеров для молекулярной диверсификации клеток собственно эмбриона и связанных с ним вне-эмбриональных мембран (рис. 4a). Выводы о сложной сигнализации были основаны на инновационном анализе химерных эмбрионов. Эмбрионы с дефицитом транскрипционного фактора TAL1 погибают в возрасте E9.5 из-за дефектов мезодермальной диверсификации, которые приводят к тяжелой анемии; однако судьбу клеток Tal1(-/-) можно проследить в химерных эмбрионах, полученных путем микро-инъекции меченых эмбриональных стволовых клеток в бластоцисту Tal1(+/+), из которых формируются здоровые эмбрионы (Pijuan-Sala et al., 2019). Оценка scRNA-seq меченых и немеченых клеток, отсортированных из химерных эмбрионов на стадии сгибания головы (E8.5), подтвердила, что мутантные клетки не вносят вклад в кроветворную линию; кроме того, обратный эксперимент показал, что меченые клетки Tal1(+/+) вносят вклад в кроветворную линию при инъекции эмбрионам-хозяевам Tal1(-/-). Сочетание временной и транскрипционной информации может пролить свет на функцию гена.



Profiling cell developmental trajectories in the mouse embryo using scRNA-seq. (Left) Gastrulation-early organogenesis when most cell lineages of the embryo proper emerge; t-SNE lineage identified 37 main clusters staged from 116,312 cells epiblast (E6.5) to headfold (E8.5), graphed in pseudotime by cell frequency (Pijuan-Sala et al., 2019). (Right) composite t-SNE annotated for 38 main cell clusters during organogenesis, the period when most organ systems form; pseudotime representation is superimposed on the composite t-SNE structure for the 151?K cells recorded on E9.5, 370?K cells on E10.5, 603?K cells on E11.5, 468?K cells on E12.5, and 435?K cells on E13.5 (Cao et al., 2019)

В E8.5 эмбрион на стадии головы переходит к органогенезу, увеличиваясь с сотен тысяч до более десяти миллионов клеток, формируя почти все зачатки основных систем органов между E9.5 и E13.5. Этот период был оценен с помощью комбинаторного индексирования на основе одноклеточной РНК-секвенирования изолированных ядер (зафиксированных параформальдегидом) из 61 замороженного эмбриона C57BL/6J, собранных с интервалом в пять дней (Cao et al., 2019). Их методика сбора, не требующая физической изоляции клеток, позволила получить библиотеки со штрих-кодом, где каждая клетка может быть проиндексирована по эмбриону, из которого она происходит. В 26 183 DEGs они идентифицировали 2 863 маркерных гена, специфичных для клеточного типа, что позволило аннотировать 38 основных клеточных кластеров (рис. 4b).

Соответствующий атлас клеток мышиного органогенеза (MOCA, (http://atlas.gs.washington.edu/mouse-rna/)) создает условия для проведения "виртуальных экспериментов" с целью более глубокого анализа ландшафтов клеточных состояний. Из 38 основных кластеров клеточных типов, полученных на основе t-SNE графиков эмбрионов мыши, собранных E9.5-E13.5, более глубокий анализ, основанный на различных траекториях состояний, позволил получить 655 подкластеров (Cao et al., 2019). Например, псевдо-временное упорядочивание клеток апикального эктодермального гребня (AER) на основе 710 DEGs, связанных с известными маркерами для специфической экспрессии AER, позволило выделить траекторию, отличную от общего эпителия, где этот транзиторный тип клеток увеличился до пиковой частоты на E10.5-E11.5 (Cao et al., 2019). Ландшафт клеточных состояний у эмбриона мыши, как и урыбок данио, не строго соответствует карте клеточных линий.

Врожденные пороки сердца (ВПС) могут возникать после нарушения развития клеток-предшественников сердца или мультипотентных клеток нервного гребня. Например, у мыши генетический дефицит Hand2 приводит к ВПС, но связать патогенез с типами клеток-предшественников, на которые влияют такие мутации, до сих пор не удается. С помощью профилирования одиночных клеток было отобрано 36 000 клеток из кардиогенной области эмбрионов мыши на трех этапах развития: сердечный полумесяц (E7.75), сердечная трубка (E8.25) и сердечная петля (E9.25) (de Soysa et al., 2019). Одноклеточная транскриптомика определила Hand2 как критический определитель линии клеток миокарда, что согласуется с дефектами отводящего тракта и тяжелой гипоплазией правого желудочка, наблюдаемыми у мышей с дефицитом Hand2 (рис. 5). Неожиданно, однако, эта дисрегуляция распространялась только на спецификацию клеток-предшественников миокарда, предназначенных для отводящих путей сердца, а не для правого желудочка.



Profiling early cardiogenic trajectories in the mouse embryo. (Top) Stages of cardiogenesis depicted in the mouse embryo at the cardiac crescent (E7.5), heart loop (E8.5), and outflow tract/secondary heart field stage (E9.5) (from http://www.ibdm.univ-mrs.fr/equipw/genetic-control-of-heart-devlopment/) (Bottom) scRNA-seq profiling of the heart in pseudotime comparing cell cluster sizes in wild-type and Hand2-null embryos. Pseudotime trajectory for the anterior heart field (AHF), outflow tract (OFT), and right ventricle (RV) at E8.25 colored by cluster identity (a), genotype (b), and cell state (c) (de Soysa et al., 2019)

Чтобы лучше понять несоответствие между анализом одноклеточных линий и наблюдаемым фенотипом (например, невозможность связать гипоплазию правого желудочка с недостаточной экспрессией Hand2 у эмбрионов дикого типа), был проведен анализ scRNA-seq на вторичном поле сердца у эмбрионов Hand2-нулевого типа. Это подтвердило транскрипционную дисрегуляцию с потерей функции Hand2 в сердечной петле в E7.75, задолго до явного дисморфогенеза, и, кроме того, выявило дисрегуляцию передачи сигнала ретиноевой кислоты (ATRA) в качестве первичной основы гипоплазии правого желудочка. Механистически это было связано с ATRA-индуцированной постеризацией перспективного правого желудочка в более переднюю (предсердно-подобную) судьбу (de Soysa et al., 2019). Это один из немногих примеров, демонстрирующий набор данных по одиночным клеткам об откровенном врожденном дефекте, и подчеркивающий потенциальное применение данного подхода.

Исследования молекулярного профилирования показали, что плюрипотентные mESCs наиболее похожи на эпибласт, который является предшественником почти всех клеточных линий в эмбрионе мыши (Cheng et al., 2019; Han, Chen, et al., 2018; Klein et al., 2015; Pijuan-Sala et al., 2019). Перед гаструляцией с помощью scRNA-seq была построена молекулярная дорожная карта, которая выделяет клетки эпибласта, проходящие через состояния плюрипотентности по мере приобретения ими склонности к формированию примитивной полоски (Cheng et al., 2019). Эпибласт отвечает на сигналы от внезародышевых тканей, постепенно выходит из состояния плюрипотентности и становится готовым к многолинейной спецификации. Линии стволовых клеток мыши, полученные из эмбриобласта (mESCs) и эпибласта (EpiSCs), функционально и морфологически отличаются друг от друга и являются аналогами in vitro в различной прогрессии развития: (1) нативная плюрипотентность (ground-state), представленная пре-имплантационной внутренней клеточной массой и культивированными mESCs; (2) промежуточные эпибласт-подобные клетки (pregastrula); и (3) primed-pluripotency (mid-late gastrulation). Cheng et al. (2019) использовали scRNA-seq для 1 724 клеток, собранных из 28 эмбрионов в E5.25, E5.5, E6.25 и E6.5 (прегаструла) для отслеживания молекулярных состояний по мере прохождения эпибластом своего предполагаемого континуума плюрипотентности. Из 3000 HVG с помощью t-SNE были отображены три основных кластера клеток: эпибласт (768 клеток, кластеризованных в домене Pouf5f1); висцеральная эндодерма (671 клетка, кластеризованная в домене Amn) и вне-эмбриональная эктодерма (ExE, 285 клеток, кластеризованных в домене Bmp4).

Штрихкодирование InDrop было применено к mESCs в качестве модели для оценки проблем параллельной обработки тысяч клеток и всестороннего захвата мРНК (Klein et al., 2015). В данном исследовании они сравнили mESCs ± LIF (лейкемический ингибирующий фактор, цитокин, поддерживающий плюрипотентность) для более 10 000 штрих-кодированных клеток и 3 034 случайно отобранных mESCs, дифференцирующихся в течение 7 дней. Для 935 mESCs, HVG были обогащены для транскрипционной регуляции и плюрипотентности, причем большинство из них отражали гетерогенность между состояниями ICM (высокая плюрипотентность) и эпибласта (низкая плюрипотентность). В соответствии с этим, графики t-SNE показали континуум состояний от высокой до низкой плюрипотентности при отмене LIF, отражающий преимущественно линии эпибласта и примитивной эндодермы, что соответствует внутренней клеточной массе (эмбриобласт) in vivo. Они обнаружили незначительные признаки формирования паттерна на 0 день, слабое формирование паттерна на 2 день, сильное формирование паттерна на 4 день, а на 7 день он исчезает. Таким образом, mESCs находятся в "исходном состоянии" нативной плюрипотентности, которую можно поддерживать с помощью LIF. Вскоре после имплантации (in vivo) или отмены LIF (in vitro) популяция ICM или mESCs, соответственно, переходит в "начальное состояние" спецификации линий, характеризующееся беспорядочной экспрессией генов, которая становится более совершенной по мере постепенной потери плюрипотентности в ходе открытой дифференцировки. Хотя линии стволовых клеток могут быть получены из постимплантационных EpiSCs, они являются линейно-primed (например, с низкой плюрипотентностью). Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (iPSCs) обладают молекулярной и функциональной идентичностью пост-имплантационных EpiSCs.

Embryoid bodies (EB), полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) in vitro, повторяют эмбриональную эктодерму и мез-энтодерму. Одиночные H9 hESCs (n = 4 822) были отобраны для профилирования с помощью scRNA с глубиной чтения 5000 генов на клетку на стадиях naïve (n = 1 491), primed (n = 695) и EB (n = 2 636) (683 клетки на 4-й день, 1953 клетки на 8-й день) (Han, Chen, et al., 2018). Они сообщают о четырех основных кластерах: два (naïve, primed) относительно однородны и два (EB-эктодерма и EB-мез-энтодерма) неоднородны из-за спонтанной дифференцировки. Основываясь на DEGs, они составили карту клеточного ландшафта для primed EB линий, показав слабую гетерогенность на 4-й день по сравнению с 8-м днем (как и следовало ожидать); однако в этом случае они определили три линии предшественников на EB-4 (неопределенная, нейронная, мез-энтодермальная) и шесть линий предшественников на EB-8 (мышечная, стромальная, эндотелиальная, нейронная, эпителиальная, печеночная). Построение траектории ранней дифференцировки EB-8 в псевдовремени выявило две основные ветви (нейроэктодерма, мез-энтодерма), аналогичные развитию in vivo primed EPI в эмбриональную эктодерму + примитивную полоску (эмбриональная мезодерма и эндодерма). Эти авторы (Han, Chen, et al., 2018) также показали, что переходные состояния взаимопревращаемые при определенных условиях in vitro. Например, primed H9 hESCs могут быть стабильно переведены в состояние naïve через 15-20 дней в культуре с коммерческой средой "RSeT" (Han, Chen, et al., 2018). Эта система обеспечивает модель для построения "траекторий сброса" в псевдо-времени в течение культуры H9 с 0-го по 20-й день.