В кардиомиоцитах взрослых мышей мы исследовали локализацию и распределение CLIC4 относительно маркера митохондрий (MitoTracker), митофузина 2 [внешняя митохондриальная мембрана (OMM) и MAM] (1) и длинноцепочечного члена семейства ацил-коэнзим А (CoA) синтетазы 4 (ACSL4) (MAM) (10) (рис. 1, A и B). CLIC4 показал более высокую колокализацию с митохондриями (41,2 ± 0,6%, n = 40 клеток) и белками сайта контакта ER-митохондрий с митофузином 2 и ACSL4 (34 ± 1% и 31 ± 2%, n = 25 клеток, соответственно). CLIC4 в изолированных сырых митохондриях (58 ± 10%) и неонатальных кардиомиоцитах (40 ± 4%, n = 28) также показал ассоциацию с нагруженными MitoTracker митохондриями (рис. S1), но CLIC1, паралог CLIC4, показал меньшую колокализацию с сырым митохондриям (39 ± 8%, P = 0,03) или неонатальным кардиомиоцитам (29 ± 3%, P = 0,03, n = 28) по сравнению с CLIC4 (рис. S1). Чтобы установить точную локализацию CLIC4 в кардиомиоцитах, мы очистили митохондрии с помощью 30% градиентного центрифугирования Percoll (11) и наблюдали, что, подобно GRP78 (маркер ER/MAM), присутствие CLIC4 было незначительным в сверхчистой фракции M3 (рис. 1, C и D) (12). Отсутствие CLIC4 в сверхчистых митохондриях и их высокая степень колокализации с кардиомиоцитами, нагруженными MitoTracker, побудили нас оценить их присутствие в МАМ. Вестерн-блот анализ и количественная оценка показали преимущественное распределение CLIC4 в МАМ, а не в сверхчистой митохондриальной фракции, что позволяет утверждать, что CLIC4 является специфичным для МАМ Cl^- каналом (рис. 1, E и F).



Fig. 1. Biochemical characterization of CLIC4.

(A) Representative image of mouse adult cardiomyocytes loaded with MitoTracker, labeled with anti-CLIC4 antibody, anti-ACSL4, and anti-mitofusin 2, and costained with DAPI shows colocalization of CLIC4 to mitochondria (row 1), ACSL4 (row 2), and mitofusin 2 (row 3). (B) Bar graph showing quantification of the colocalization. Data are represented as mean ± SEM; N = 4 isolation; n ≥ 25. (C) Representative Western blot showing fractionation profile of ultrapure mitochondria (M3) indicating the absence of CLIC4 and GRP78 in M3 fraction but the presence of ATP synthase in M3 fraction. (D) Quantification of percentage expression of CLIC4, GRP78, and ATP synthase normalized to total protein as detected by Ponceau S staining in different subcellular fractions. (E) Representative Western blot of MAM fractionation indicates the presence of CLIC4 in MAM but their absence in purified mitochondria. (F) Quantification of percentage expression of CLIC4 and GRP78 normalized to total protein content estimated by Ponceau S stain in various subcellular fractions. The graph in (D) and (F) depicts mean ± SEM for percentage normalized expression of the proteins; N = 3; *P ≤ 0.05, Student's t test. (G) HEK cells transfected with CLIC4 full-length FLAG (row 1), CLIC4ΔC189 (row 2), and CLIC4ΔQ67 (row 3) were loaded with MitoTracker, anti-FLAG antibody, and anti-prohibitin antibody and costained with DAPI, showing colocalization of all CLIC constructs to mitochondria (Merge).

Здесь мы установили, что CLIC4 является новым Cl^- каналом, присутствующим в МАМ. В МАМ выявлено 1212 белков, из которых 1000 были охарактеризованы в головном мозге и печени (4, 35, 36). Некоторые из этих белков являются ионными каналами, которые считаются важными для регуляции гомеостаза Ca²⁺ между ER и митохондриями (4). Поскольку ионные каналы играют решающую роль в определении структурной и функциональной целостности клетки и органелл, их жестко регулируемые функции необходимы для опосредования связи между ER и митохондриями. Помимо SERCA2a и RyR2, в МАМ также обнаружены натриевые (Na+) и калиевые (K+) каналы (4). Однако идентичность не менее важных Cl^- каналов в сердечных МАМ и их потенциальная роль в регуляции функций МАМ еще не расшифрованы. В данном исследовании мы систематически выявили присутствие внутриклеточного белка Cl^- канала, CLIC4, в сердечных МАМ, но не в митохондриях. Кроме того, мы установили, что N-концевая область с интактным TMD является необходимой и достаточной для сохранения его локализации в МАМ. Показано, что CLIC4 (также известный как p64H1, mtCLIC и HuH1) распределен в митохондриях (19, 37, 38) и ER (39), а в условиях клеточного стресса он может транслоцироваться в ядро (31). Наши результаты еще больше подчеркивают дифференциальное распределение CLIC4 в кардиомиоцитах мыши.

Обнаружение CLIC4 в МАМ побудило нас изучить его физиологические роли. Расстояние между ER и митохондриями составляет от 10 до 25 нм (40), поэтому неудивительно, что они пространственно и функционально связаны друг с другом. Взаимодействие между ER и митохондриями связано с переносом ROS и Са²⁺ между ними (41, 42). Мы наблюдали быстрый выброс Са²⁺ в кардиомиоцитах в отсутствие CLIC4, что указывает на утечку Са²⁺ из SR. Это указывает на возможную регуляторную роль CLIC4 в отношении каналов высвобождения Са²⁺, таких как IP3Rs и RyR2s (43). Ранее было показано, что активность RyR2s может модулироваться анионным градиентом, наблюдаемым в SR (44). Известно, что другой член семейства CLIC, CLIC2, отсутствующий у мышей (7), регулирует активность RyR1 скелетных мышц путем модуляции вероятности их открытия, вызывая в них конформационные изменения (45). Подобно этим результатам, мы продемонстрировали роль CLIC4 в модуляции активности RyR2 в кардиомиоцитах мыши. Следовательно, было бы интересно изучить механизм, посредством которого CLIC4 модулирует активность RyR2.

Мы также наблюдали повышенный базальный митохондриальный Ca²⁺ в неонатальных кардиомиоцитах clic4-/-. Более того, этот повышенный базальный митохондриальный Ca²⁺ может быть ответственен за снижение CRC в сердечных митохондриях clic4-/- Однако в сердцах clic4-/- мы не наблюдали изменений в экспрессии MCU, белка, ответственного за поглощение Ca²⁺ митохондриями в микродоменах ER-митохондрий (46). Тем не менее, существует возможность пост-трансляционной модификации MCU, такой как окисление цистеина (47) или усиленное фосфорилирование тирозина (48), которое, как известно, повышает активность MCU. Ранее было показано, что CsA не спасает снижение CRC, вызванное блокатором CLIC IAA-94 (8). Наши результаты показывают, что CsA восстановил снижение CRC, наблюдаемое в сердечных митохондриях clic4-/-, но не в такой степени, как у дикого типа. Это предполагает наличие либо другой мишени IAA-94 в сердечных митохондриях, которая работает в консорциуме с CLIC4 в регулировании эффектов CsA, либо, поскольку сердечные митохондрии clic4-/- уже перегружены Ca²⁺, пороговые уровни достигаются гораздо раньше, чем у дикого типа.

Кроме того, наши данные о вызванном кофеином переносе Ca²⁺ из ER/SR в митохондрии показывают, что быстрое высвобождение Ca²⁺ из SR при активации RyR2 сопровождается более быстрым накоплением Ca²⁺ в митохондриях, что предполагает потенциальную роль CLIC4 как модулятора переноса Ca2+ из ER/SR в митохондрии. Мы не наблюдали изменений в цитоплазматических Ca²⁺ переходных процессах, зарегистрированных в присутствии/отсутствии ISO в clic4-/- кардиомиоцитах взрослых мышей по сравнению с wt, таким образом, предполагая, что отсутствие CLIC4 не влияет грубо на динамику цитоплазматического Ca²⁺, но, вероятно, увеличивает скорость Ca²⁺ потока в ER-митохондриальных доменах в физиологических условиях. Наше исследование свидетельствует о прямой роли MAM-CLIC4 в поддержании гомеостаза Ca²⁺ в ER/SR-митохондриях.

Известно, что дисрегуляция связи между ER и митохондриями изменяет физиологию сердца и очень хорошо связана с IR-повреждением сердца (49). Предыдущие исследования также показали, что блокирование Cl^- каналов с помощью IAA-94 отменяет кардиопротекцию, опосредованную ишемическим/фармакологическим прекондиционированием (9, 50) и CsA (51), а также вызывает раннее начало открытия mPTP (8). В данном исследовании мы продемонстрировали, что сердца мышей clic4-/-, подвергнутые in vivo или ex vivo испытаниям на повреждение IR, показали усиление MI и ухудшение функции левого желудочка по сравнению с мышами wt (дикого типа). Более того, мы наблюдали снижение CRC у мышей clic4-/- по сравнению с сердечными митохондриями, выделенными из мышей wt при IR-травме ex vivo. Это позволяет предположить, что повышенный уровень Ca²⁺ в базовых условиях в кардиомиоцитах clic4-/- может привести к более раннему началу открытия mPTP при стрессовых стимулах, таких как IR-травма. Как и в других отчетах (8, 9, 50), сердца wt, предварительно кондиционированные с помощью IAA-94, показали увеличение MI, но в сердцах clic4-/- таких изменений не наблюдалось. Кроме того, в присутствии IAA-94 сердца wt обнаруживали инфаркт, аналогичный инфаркту clic4-/- сердец, кондиционированных с помощью транспортного средства, что исключает возможность участия других CLIC в кардиопротекции от повреждения IR. Таким образом, кардиодеструктивные эффекты IAA-94 опосредованы воздействием на CLIC4. Ранее было показано, что CLIC1 присутствует во внутриклеточных органеллах, таких как ER, лизосомы и ядро (7). В кардиомиоцитах CLIC1 локализован в ER (19); однако у мышей с нулевым мутантом CLIC1 не наблюдалось различий в MI после IR-травмы, что позволяет предположить, что анионный градиент, поддерживаемый ER-CLIC1, не влияет на клеточный ответ на травму. В совокупности мы можем убедительно объяснить кардиопротекторную роль CLIC4 при IR-повреждении путем модуляции физиологии митохондрий. В отказывающих сердцах человека и сердцах мышей, подвергшихся хроническому повреждению миокарда (8 недель LCA), наблюдалась повышенная экспрессия CLIC4 в срезах сердца. Далее мы провели субфракционирование сердечной ткани (32) и обнаружили, что экспрессия CLIC4 в цитозоле по сравнению с фракциями мембран органелл была повышена в отказывающих человеческих сердцах по сравнению со здоровыми контрольными. Интересно, что CLIC1 не показал никаких различий в своем распределении в сердечной ткани при HF. Меньшая степень интернализации растворимого CLIC4 в мембрану органеллы в сердце с недостаточностью может способствовать снижению его функциональной активности во внутриклеточных мембранных фракциях, таких как МАМ, и потенциально приводить к патологическим последствиям при HF. Таким образом, механизм изменения распределения CLIC4 в субклеточных фракциях при HF необходимо выяснить для полного понимания его роли.

Известно, что ингибирование CLIC4 индуцирует апоптоз в клеточной линии сквамозной карциномы головы и шеи человека (HN4), вызывая деполяризацию митохондриальной мембраны (52). Здесь мы обнаружили, что кардиомиоциты clic4-/-, подвергнутые повреждению HR, показали повышенный апоптоз и деполяризацию митохондриальной мембраны по сравнению с кардиомиоцитами wt. Известно, что увеличение перегрузки Ca2+ и выработка ROS вызывают образование и открытие mPTP, что приводит к гибели клеток (53). При повреждении HF кардиомиоциты clic4-/- показали повышенную продукцию ROS по сравнению с кардиомиоцитами wt, что позволяет предположить, что в дополнение к повышенной перегрузке Ca²⁺, наблюдаемой в сердцах мышей clic4-/-, повышенная продукция ROS во время реперфузии может быть ответственна за деполяризацию митохондриальной мембраны и гибель клеток. Наши результаты свидетельствуют о прямой роли MAM-CLIC4 в кардиомиоцитах в защите клеток от HF повреждения.

Подводя итог, можно сказать, что наши результаты показывают наличие нового Cl-канала CLIC4 в МАМ, который играет фундаментальную роль в регуляции гомеостаза Са²⁺ в ER/SR и митохондриях (рис. 6). Более того, наши результаты подчеркивают беспрецедентную роль MAM-CLIC4 в регуляции повреждения миокарда и сердечной функции после гипоксии/IR-повреждения путем регуляции мембранного потенциала митохондрий и окислительного стресса (рис. 6). Таким образом, мы предполагаем, что роль MAM-CLIC4 в опосредовании ER-митохондриальной коммуникации также влияет на другие физиологические и патофизиологические процессы.