Полимеризация актина приводит в действие фундаментальные клеточные процессы, включая миграцию клеток, динамику органелл и эндоцитоз¹. Пропульсивная сборка разветвленных актиновых сетей связана с потреблением нуклеотидов субъединицами глобулярного актина (G-актина), которые гидролизуют связанный АТФ одновременно с их включением в растущий F-актин¹. Модель упругой Brownian rachet, в которой изгибающиеся филаменты при полимеризации сталкиваются с мембранами^2,3, количественно объясняет преобразование этой химической энергии в механическую работу. Последовательная электронная микроскопия позволила обнаружить большое количество изогнутых филаментов с радиусом кривизны в сотни нанометров в полимеризующихся актиновых сетях, прилегающих к поверхностям in vitro⁷ и в клетках^8-10.

После встраивания в F-актин субъединицы быстро гидролизуют связанный АТФ в течение нескольких секунд. В результате образуется метастабильный ADP-P_i-F-актин, который сохраняется в течение нескольких минут до высвобождения фосфата, что приводит к образованию долгоживущего ADP-F-актина¹. Ретроградный поток одновременно отталкивает старые филаменты от мембраны¹¹, создавая пространственный градиент состояниq нуклеотидов F-актина - биохимический маркер возраста филаментов⁶. Нуклеотидное состояние актина и механические силы^1,4,12,13 модулируют взаимодействия между F-актином и ключевыми актин-связывающими белками (ABPs), которые регулируют динамику актиновой сети. Деполимеризующий F-актин белок кофилин преимущественно связывается с ADP-F-актином^14,15 и рассоединяет его, способствуя селективной разборке старого F-актина дистальной части мембраны. Кофилин и нуклеатор разветвленного F-актина ARP2/3 также обладают механически настроенной⁵ F-актин-связывающей активностью^16-18, специфически реагируя на изгиб филаментов^17,19. Это может способствовать чувствительности к силе в разветвленных сетях F-актина, которые демонстрируют измененную межфиламентную геометрию^20,21 и повышенное производство силы²⁰ в присутствии вызывающих сопротивление нагрузок. Некоторые другие ABP определяют нуклеотидное состояние F-актина^13,22 и силу, действующую на отдельные филаменты^23-25, посредством механизмов, которые неясны.

Полимеризация F-актина связана с переходом от G к F, значительным уплощением субъединицы актина, что делает ее активный сайт нуклеотидной щели компетентным для гидролиза26. В отличие от этого, исследования криоэлектронной микроскопии (cryo-EM) с разрешением 3-4 Å обнаружили лишь скромные нуклеотид-зависимые изменения в F-актине, сообщая либо о локализованных перестройках^27,28 в гибкой D-петле актина^29-31, либо о почти идентичных конформациях основы³². Однако связывание ABPs может вызывать существенные перестройки, в частности, кофилин, который стабилизирует недостаточно скрученную решетку F-актина^33,34. Это несоответствие ставит под сомнение традиционную аллостерическую модель дискриминации состояния нуклеотидов F-актина с помощью ABPs, которые не могут напрямую получить доступ к зарытой нуклеотидной щели актина. Нуклеотидное состояние актина также может модулировать деформируемость F-актина и соответствующую способность к перестройкам, с опосредующим связыванием ABP^13,15, это согласуется с измерениями длины устойчивости в микрометровом масштабе, показывающими, что ADP-P_i-F-актин жестче, чем ADP-F-актин³⁵. Моделирование молекулярной динамики поддерживает механическую регуляцию структуры F-актина³⁶, причем модели, абстрагированные до уровня субъединиц, предсказывают связь между изгибом филаментов и модуляцией скрученности спиральной решетки (связь скрученность-изгиб)³⁷. Недавнее более тонкое моделирование с участием субъединиц, состоящих из нескольких жестких тел, показало кооперативность между гидролизом АТФ и высвобождением фосфата через решетку филамента³⁸ , что предполагает связь между распространением деформаций решетки и состоянием нуклеотидов филамента. Однако в отсутствие прямой структурной визуализации остается неясным, пересекаются ли механически вызванные конформационные переходы в F-актине с состоянием нуклеотидов филамента для контроля зацепления ABP.

Чтобы выяснить, могут ли тонкие конформационные изменения F-актина объяснить восприятие нуклеотидного состояния ABP, мы определили структуры ADP-F-актина и ADP-P_i-F-актина с улучшенным разрешением. Поскольку протоколы приготовления ADP-P_i-F-актина различаются^13,27,32, мы проверили наш подход (полимеризация G-актина в присутствии 15 мМ KH2PO4) путем мониторинга действия кофилина с помощью флуоресцентной микроскопии (Методы). В соответствии с предыдущими сообщениями^14,15, ADP-F-актин быстро деполимеризовался в течение 5 минут после добавления кофилина, тогда как ADP-P_i-F-актин в основном оставался интактным. Замена KH2PO4 на K2SO4 приводила к промежуточному разделению, что говорит о том, что фосфат вызвал значительно меньший раздел ADP-P_i-F-актина, а не изменение ионной силы буфера (расширенные данные рис. 1a,b). Поэтому мы использовали крио-ЭМ и итеративное спиральное уточнение реального пространства, реализованное в RELION, для определения структур ADP-F-актина и ADP-P_i-F-актина с разрешением 2,4 Å и 2,5 Å соответственно (рис. 1а, Методы, расширенные данные рис. 1c,d и дополнительная таблица 1).



Fig. 1: Nucleotide cleft water networks are remodelled upon phosphate release by F-actin.

a, Cryo-EM maps of ADP-F-actin (left, shades of blue) and ADP-Pi-F-actin (right, shades of orange). ADP (green) and water (magenta) densities are shown. BE, barbed end; PE, pointed end. b, Atomic models of the ADP-F-actin (blue) and ADP-P_i-F-actin nucleotide (nuc.) clefts (orange) are shown in Cα representation. Top, carved transparent grey density is displayed for ADP (green), PO₄^3- (yellow), Mg²⁺ (light green) and water molecules (violet). In ADP/PO₄^3-, nitrogen atoms are blue, oxygen atoms are red and phosphorous atoms are yellow. Bottom, the backbone and side chain residues involved in putative hydrogen-bonding networks (dashed lines) are displayed and coloured by heteroatom. c, Superposition of individual ADP-F-actin (blue) and ADP-Pi-F-actin (orange) protomers, displayed in Cα representation.

...

Для изучения ремоделирования решетки мы гибко вписали атомные модели в эти карты с помощью ISOLDE и измерили мгновенные параметры спирали (подъем и скручивание; рис. 3e и Дополнительное видео 2) вдоль их изогнутых центральных осей (Методы). Это выявило поразительное взаимодействие изгиба и скручивания, соответствующее теоретическим предсказаниям³⁷, с чередованием перекручивания и недокручивания нитей, которое увеличивалось с ростом кривизны оси филамента. Симметричные отклонения закрутки между нитями остаются синфазными, сохраняя каноническую закрутку F-актина как мгновенное среднее между четными и нечетными протомерами для поддержания структурной целостности решетки. Изгиб вызывает отклонения в скрутке до 15°, что значительно больше, чем отклонения в скрутке, индуцированные кофилином (~5°)^33,34. Взаимосвязь изгиба и скручивания каждой нити может быть смоделирована аналитически как бегущая волна вдоль протомеров (Методы), при этом увеличение кривизны модулирует амплитуду и фазу скручивания (рис. 3f, расширенные данные рис. 6a и дополнительная таблица 2). И ADP-F-актин, и ADP-P_i-F-актин демонстрируют почти одинаковые скорости распространения в twist/protomer-index space, но ADP-F-актин отличается большим коэффициентом связи. Это приводит к физической интерпретации того, что заданная кривизна приводит к большим отклонениям от крутки в ADP-F-актине, чем в ADP-Pi-F-актине, что говорит о том, что решетка ADP F-актина более деформируема (расширенные данные рис. 6b и дополнительная таблица 2).

Мы также наблюдали скромные отклонения при подъеме, которые проявляются как очевидные стоячие, а не бегущие волны, амплитуда которых также увеличивается с ростом кривизны (рис. 3f). Эти волны подъема имеют длину примерно в два раза меньше, чем волны скручивания, и, насколько нам известно, они не были подробно теоретически смоделированы. Хотя физическая основа отклонений подъема менее ясна, мы предполагаем, что они возникают в результате деформации субъединиц для приспособления к перестройке скручивания и увеличения упругой энергии на межсубъединичных интерфейсах. Последовательно, наиболее сильно изогнутые 16-протомерные модели характеризуются нуклеотид-зависимыми изменениями расстояний и углов между субдоменами продольно смежных протомеров вдоль каждой нити⁴⁷ (Расширенные данные, рис. 6c; подробный анализ приведен в Дополнительном обсуждении). Примечательно, что изогнутый F-актин не проявлял четких систематических различий, связанных с уплощением субъединиц, характерным признаком перехода от G к F, ни в одном из нуклеотидных состояний, что позволяет предположить, что изгиб F-актина имеет отдельный структурный ландшафт.

Чтобы подтвердить результаты cryoDRGN, мы разделили сегменты АДФ на три прямых бина, один бином с низкой кривизной и один бином с высокой кривизной, все приблизительно эквивалентного размера. Асимметричные одночастичные реконструкции (Methods) прямых элементов управления (разрешение 7.0 Å , 7.1 Å и 7.2 Å ) показали незначительные отклонения от параметров спирали канонического F-актина, в то время как реконструкции с низкой (разрешение 6.9 Å ) и высокой (6.4 Å ) кривизной демонстрировали изгиб и подъем, согласующиеся с моделями cryoDRGN (Extended Data Fig. 5d,f,g и Supplementary Video 3). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что изгиб вызывает существенные, модулируемые нуклеотидными состояниями конформационные переходы F-актина.

Далее мы попытались визуализировать структурные деформации протомеров, сопровождающие изгиб нити. Предполагая, что постоянная конформационная гибкость ограничивает разрешение 16-протомерной реконструкции, мы сосредоточились на центральных 7 субъединицах (Методы). Сфокусированное уточнение существенно улучшило разрешение обеих реконструкций изогнутого F-актина (ADP-F-актин, 3.6 Å ; ADP-P_i-F-актин, 3.7 Å ; рис. 4a, расширенные данные рис. 7a-c и дополнительная таблица 3), облегчая построение и уточнение прямой атомной модели. Мы также реконструировали два прямых бина ADP-F-актина с совпадающими номерами сегментов - оба дали карты 3,7 Å , по которым мы построили контрольные атомные модели (расширенные данные рис. 7 и дополнительная таблица 3).

Fig. 4: Actin nucleotide state modulates subunit shearing during filament bending.

Мы сравнили эти асимметричные модели с нашими спирально-симметричными моделями путем наложения их центральных протомеров, выявив систематические перестройки только в изогнутых моделях (расширенные данные, рис. 7d). В прямых контролях наблюдались лишь небольшие, случайно распределенные отклонения, что позволяет предположить, что изогнутые структуры отражают конформационные перестройки, а не просто отражают неопределенность построения модели с разрешением 3,6-3,7 Å Чтобы изучить внутренние деформации отдельных субъединиц, мы наложили каждый протомер на субъединицу из нуклеотид-соответствующей спирально-симметричной модели и изучили усредненные по субдоменам смещения Сα (рис. 4б, Методы и Дополнительное видео 4). Это позволило выявить сложные схемы смещения, которые зависели от принадлежности протомера к нити и положения решетки, и в основном характеризовались сдвигом субъединицы вокруг нуклеотидной щели. Эти перестройки отражены индексом сдвига (рис. 4c; точечное произведение указанных векторов), который показывает повышенный сдвиг вблизи колючих концов наших реконструкций, вероятно, из-за локальной ориентации решеток относительно плоскости кривизны. Хотя модели субдоменных смещений были очень похожи между ADP и ADP-P_i (рис. 4б), величина сдвига была больше в ADP (рис. 4в), что согласуется с большей общей средней кривизной изогнутых сегментов ADP и повышенной деформируемостью субъединиц ADP.

Чтобы определить конкретные структурные элементы, испытывающие деформации, мы снова провели псевдо-энергетический анализ деформации каждого остатка (Методы), который нечувствителен к смещениям жесткого тела. Это позволило выявить три основных участка деформации: Н-разъем (расширенные данные рис. 8а (слева)), D-петля (расширенные данные рис. 8а (справа)) и нуклеотидная щель (рис. 4d). Деформация в H-петле и D-петле согласуется с их ролью как основных посредников меж-субъединичных взаимодействий. Примечательно, что изогнутый ADP-F-актин демонстрировал значительно более высокую общую деформацию в остатках, прилегающих к нуклеотиду (отсечка расстояния 7,5 Å ), по сравнению с изогнутым ADP-P_i-F-актином или прямым ADP-F-актином (рис. 4d,e). Измерения объема, доступного растворителю (Методы), также выявили расширение нуклеотидных щелей в изогнутых протомерах ADP-F-актина по сравнению с изогнутым ADP-P_i-F-актином и прямым ADP-F-актином (рис. 4e). Мы также изучили подробные перестройки внутри субъединиц (расширенные данные рис. 8b и 9, дополнительное обсуждение и дополнительные видео 5 и 6). Они в целом соответствовали тому, что нуклеотидная щель актина функционирует как деформируемый локус, координирующий механические перестройки, жесткость которых зависит от фосфатной занятости. Это дает структурно-механистическое объяснение модуляции состояния нуклеотидов актина на механику изгиба F-актина.

Наша прямая структурная визуализация механически регулируемого конформационного ландшафта F-актина, модулируемого состоянием нуклеотидов актина, показывает существенное изменение скрученности спиральной решетки, что приводит к значительным перестройкам в контактах протомер-протомер. Поэтому мы предполагаем, что изгиб F-актина может модулировать связывание многочисленных ABPs, поскольку их сайты связывания обычно охватывают два продольно соседних протомера. Действительно, картирование известных сайтов связывания репрезентативных чувствительных к силе и состоянию нуклеотидов ABPs на изогнутом F-актине позволяет предположить, что они, вероятно, будут подвержены влиянию этих структурных переходов (расширенные данные рис. 10). Хотя возможно, что к нуклеотид-состоянию чувствительные ABPs обнаруживают очень небольшие структурные изменения (наиболее вероятно, увеличение на 0,3 Å ), аллостерически вызванные высвобождением фосфата из ADP-P_i-F-актина^22,27, наши структуры высокого разрешения показывают, что это вряд ли является основным механизмом. Наши структуры изогнутого актина поддерживают альтернативную модель, в которой фосфат одновременно делает ригидным F-актин (в соответствии с предыдущими исследованиями)³³ и изменяет структурный ландшафт, вызванный изгибающими силами, что позволяет осуществлять дискриминацию ABPs. Эта модель также совместима с ригидизацией канонического F-актина фосфатом, ингибирующим участие ABPs, которые должны значительно деформировать решетку для связывания, например, кофилин^15,32,48.

Наши исследования также дают представление о механизмах изгиба F-актина - модели регуляции структуры белка механической силой. Поскольку сила представляет собой делокализованное возмущение по филаменту, остается неясным, как она преобразуется в конформационное изменение субъединиц компонентов. Мы предлагаем концептуальную модель "стерических границ" механической регуляции, в которой перестройки решетки изменяют положение контактирующих соседей субъединицы (рис. 4f). Это изменяет физическое пространство, которое она может занять, побуждая ее деформироваться, чтобы минимизировать столкновения. Модель предсказывает связь между положением субъединицы в решетке, локальной кривизной филамента и ее результирующей конформацией, что согласуется с нашими наблюдениями. Связывание лигандов/химические модификации также могут изменять ландшафт деформации субъединицы, обеспечивая основу для пересечения биохимической и механической регуляции. Как показано здесь для актина и фосфата, это не требует участия лиганда для изменения конформации основного состояния белка, что является отходом от традиционной аллостерической регуляции и напоминает динамическую аллостерию⁴⁹. Однако в рамках стерических границ лиганд регулирует механические деформации, а не изменяет внутренние конформационные колебания белка (распространенный способ регуляции). Последовательно, мы обнаружили, что нуклеотидная щель актина опосредует сдвиговые деформации субъединицы, что позволяет ее биохимическому содержанию модулировать механику F-актина. Это дополнительно предполагает, что сила может модулировать кинетику гидролиза нуклеотидов и высвобождения фосфатов F-актина, как было предсказано ранее50. Мы предполагаем, что помимо F-актина механизм стерических границ может также объяснить совместную механическую и биохимическую регуляцию других много-субъединичных комплексов - это тема для будущих исследований.