Многие процессы, управляемые актином, такие как деление клеток, зависят от его АТФазной активности¹. В мономерной форме (G-актин) актин проявляет очень слабую АТФазную активность (7 х 10^-6 s^-1) (ссылка 4), но полимеризация в филаменты (F-актин) вызывает конформационную перестройку, которая позволяет актину гидролизовать АТФ в течение нескольких секунд (0,3 s^-1) (ссылка 5). Отщепленный inorganic phosphate (P_i) не высвобождается сразу после гидролиза (скорость высвобождения 0,006 s^-1) (ссылка 6), что приводит к промежуточному ADP-P_i состоянию F-актина⁷. После выхода P_i, с АДФ-связанный F-актин представляет собой "старое" состояние филамента, который затем может быть деполимеризован обратно в G-актин. In vivo этот циклический процесс жестко регулируется различными актин-связывающими белками (ABPs), часть из которых способна определять состояние нуклеотидов актина^8,9. В качестве яркого примера можно привести из ABPs семейства ADF/кофилин, которые эффективно связывают и разрывают связь ADP-F-актин, способствуя обороту актина, но лишь со слабым сродством связываются с "молодыми" актиновыми филаментами в ATP или ADP-P_i состоянии^10-12.

В дополнение к ABPs, двухвалентный катион, который соединяется с актин-связанным нуклеотидом, Mg2+ или Ca2+, также сильно влияет на скорость полимеризации. В настоящее время принято считать, что Mg2+ является преобладающим катионом, связанным с актином in vivo^13,14. Однако, поскольку Ca2+-ATP-связанный G-актин демонстрирует более медленную кинетику полимеризации и более высокую критическую концентрацию полимеризации^15-17, он используется в качестве стандарта при очистке актина¹⁸, во многих исследованиях in vitro и в большинстве кристаллических структур G-актина¹⁹. Чем обусловлена медленная скорость полимеризации связанного с Ca²⁺-актина, остается неизвестным.

С 2015 года многочисленные крио-ЭМ исследования показали архитектуру F-актина во всех нуклеотидных состояниях^20-22 и в комплексе с различными ABPs, такими как кофилин^23,24 и миозин^25-27. Однако ранее опубликованные структуры F-актина были определены при умеренном разрешении около 3-4,5 Å и поэтому не показывали достаточных деталей для моделирования молекул растворителя и точного положения боковых цепей аминокислот. Следовательно, ключевые механистические события в процессе старения F-актина, такие как гидролиз АТФ, который сильно зависит от молекул воды, остаются неизвестными. Здесь мы представляем 6 крио-электронных микроскопических (крио-ЭМ) структур скелетных филаментов кролика с разрешением приблизительно 2,2Å в трех функциональных состояниях, полимеризованных в присутствии Mg2+ или Ca2+. Структуры освещают архитектуру F-актина в беспрецедентных деталях и подтверждают критическую роль молекул растворителя в сборке и старении актиновых филаментов.

Во-первых, используя оптимизированный рабочий процесс крио-ЭМ (расширенные данные рис. 1 и методы), мы определили структуры Mg²⁺-F-актина в трех соответствующих нуклеотидных состояниях (ATP, ADP-P_i и ADP) с разрешением 2.17-2.24 Å (рис. 1a-d, расширенные данные рис. 2, 3a-f и 4a-c и дополнительная таблица 1; методы).



Fig. 1: Cryo-EM reconstructions of F-actin at 2.2?? resolution.

a, Local-resolution filtered, sharpened cryo-EM density map of F-actin in the Mg2+-ADP-BeF^3- state. The subunits are labelled on the basis of their location along the filament, ranging from the barbed (A_-2) to the pointed (A₂) end. The central actin subunit (A₀) is blue and the other four subunits are grey. Actin subdomains (SD1-4, also known as Ia, Ib, IIa and IIb) are annotated in the central subunit. Densities corresponding to water molecules are red. b-g, Cryo-EM densities of the nucleotide-binding pocket in F-actin in the Mg²⁺-ADP-BeF_3- (b), Mg²⁺-ADP-P_i (c), Mg²⁺-ADP (d), Ca²⁺-ADP-BeF_3- (e), Ca²⁺-ADP-P_i (f) and Ca²⁺-ADP (g) states. Mg2+ and Ca2+ are shown as green spheres. Water molecules that directly coordinate the nucleotide-associated cation are magenta. For the Ca²⁺-ADP structure (g), one coordinating water is hidden behind the Ca2+ ion.

Беспрецедентно высокое разрешение реконструкций F-актина позволило смоделировать сотни молекул растворителя, и мы, соответственно, наблюдали четкие плотности для нуклеотида и связанного с ним иона Mg2+ с координирующими его молекулами воды (рис. 1b-d и Дополнительное видео 1). Общие конформации всех структур Mg2+-F-актина очень похожи, со среднеквадратичным отклонением по атому Cα менее 0,6 Å и без изменений в подъеме и скручивании спирали (Дополнительная таблица 1 и Расширенные данные рис. 4g), это указывает на то, что различия заключаются в деталях (см. ниже). Хотя более ранние исследования предсказывали дополнительные сайты связывания Mg2+ и P_i вне нуклеотид-связывающего кармана F-актина^19,28, мы не нашли доказательств наличия этих вторичных ион-связывающих сайтов ни в одной из наших реконструкций.

Мы установили структуры F-актина, используя АДФ в комплексе с фторидом бериллия (BeF_3-, также называемом BeF_x)²⁹ , чтобы имитировать короткоживущее состояние АТФ в филаменте (рис. 1a,b). В структуре Mg²⁺-ADP-BeF_3- F-актина (2.17 Å) мы наблюдали однозначную плотность для моделирования ADP-BeF_3- в нуклеотид-связывающем сайте (рис. 1b). Примечательно, что нуклеотидная конформация Mg²⁺-ADP-BeF_3- в F-актине напоминала Mg²⁺-ATP в G-актине (рис. 2b,c и расширенные данные рис. 5a), что подтверждает пригодность ADP-BeF_3- в качестве замены АТФ.



Fig. 2: Water relocation during the G- to F-actin transition.

a, Schematic cartoon representation of actin flattening during the G- to F-actin transition. b-e, Nucleotide conformation and inner-coordination sphere of the divalent cation in Mg²⁺-ATP-G-actin (Protein Data Bank (PDB) 2V52) (b), Mg²⁺-ADP-BeF_3- F-actin (c), Ca²⁺-ATP-G-actin (PDB 1QZ5) (d) and Ca²⁺-ADP-BeF_3- F-actin (e). Bond lengths are annotated in angstroms. f,g, Water relocation in Mg²⁺-actin (f) and Ca²⁺-actin (g). In f and g, the left panel shows water and amino-acid arrangement in ATP-G-actin. Amino acids are pink for Mg²⁺-actin and light-brown for Ca²⁺-actin, whereas the cartoon representation is shown in grey. Arrows depict the movement of amino-acid regions for the transition to F-actin. The middle panel shows overlay of the amino-acid positions in ADP-BeF_3- F-actin (blue for Mg²⁺-actin and cyan for Ca²⁺-actin) with the solvent molecules in the G-actin structure. The water molecules in the SD3/1 cavity of ATP-G-actin are shown as semitransparent spheres. Arrows indicate the direction of water relocation. Finally, the right panel shows the water and amino-acid arrangement in ADP-BeF_3- F-actin. Nuc, nucleophilic.

Для выяснения механистической основы более медленной кинетики полимеризации Ca²⁺-актина мы установили структуры Ca²⁺-F-актина в комплексе с ADP-BeF₃, ADP-P_i и ADP с разрешением 2,15-2,21 Å (рис. 1e-g, расширенные данные рис. 2, 3g-l и 4d-f, дополнительная таблица 2 и дополнительное видео 2). Реконструкции показали, что, хотя Ca²⁺-актин демонстрирует медленную кинетику полимеризации и быстрой деполимеризации¹⁷ , он принимает стабильные конформации в нитевидном состоянии. В целом, структуры Ca²⁺-F-актина сравнимы со структурами Mg²⁺-F-актина, без изменений в подъеме и закручивании спирали и со среднеквадратичным отклонением Сα атомов <0,6 Å (расширенные данные рис. 4h-k), что указывает на то, что переход от Mg²⁺ к Ca²⁺ не вызывает больших конформационных перестроек в филаменте.

При полимеризации субдомены 1 и 2 (SD1 и SD2) актинового мономера поворачиваются примерно на 12,4°, что приводит к более компактному расположению в филаменте (рис. 2а и расширенные данные рис. 6а,б), которое обычно называют уплощением³⁰. Сравнение кристаллических структур G-актина в состоянии АТФ³¹ с нашими структурами F-актина позволяет описать переход G-актина в F-актин в контексте молекул растворителя. Сначала мы проанализировали молекулы воды, непосредственно связанные с нуклеотидным катионом. В Mg²⁺-ADP-BeF_3- F-актина, Mg²⁺ координируется P_β из ADP, фторидным мотивом BeF_3- и четырьмя молекулами воды, определяя гексакоординационную, октаэдрическую координацию, аналогичную координации Mg²⁺ в ATP-G-актине (рис. 1b и 2b,c). Таким образом, наша структура F-актина предоставляет экспериментальное доказательство того, что Mg²⁺ сохраняет координацию с водой во время перехода от G- к F-актину, что ранее предсказывалось только на основе данных молекулярной динамики¹⁹. Далее мы проверили потенциальное перемещение молекул воды вблизи нуклеотид-связывающего кармана. В Mg²⁺-ATP-G-актине (PDB 2V52)³¹ существует большая полость (около 7 Å в диаметре), которая вмещает несколько упорядоченных молекул воды перед АТФ-фосфатом между SD3 и SD1 (полость SD3/1, рис. 2f). Сплющивание актина приводит к смещению вверх Н-петли (остатки 72-77) и перемещению богатой пролином петли (остатки 108-112) и боковых цепей Q137 и H161 в сторону нуклеотида (рис. 2f). В результате полость SD3/1 становится более узкой (около 5 Å в диаметре) и открывается полость в SD1 (считающаяся полостью SD1) (расширенные данные рис. 6a). Из-за сужения полости SD3/1 несколько молекул воды сталкиваются с аминокислотами и поэтому должны переместиться в полость SD1 по пути, который включает перемещение молекулы воды (W_x), связанной между обеими полостями (рис. 2f и Дополнительное видео 3). Примечательно, что перемещение молекул воды в полость SD1 не влияет на координацию связанного с нуклеотидом иона Mg²⁺ (рис. 2c,f).

После конформационного изменения от G- к F-актину в полости SD3/1 остаются только три молекулы воды, не cкоординированные Mg²⁺. Одна из них связана водородной связью с боковой цепью Q137 (рис. 3a и расширенные данные рис. 6c). Из-за перестройки нуклеотид-связывающего сайта в F-актине эта молекула воды находится гораздо ближе (3,6 Å) к Pγ-аналогу BeF_3-, чем в Mg²⁺-ATP-G-актине (>4 Å расстояние от Pγ и 4,6 Å в PDB 2V52; ссылка 31) (рис. 3a и расширенные данные рис. 6c). Поскольку перед нуклеотидом нет других упорядоченных молекул воды, молекула воды, связанная водородной связью с Q137, вероятно, представляет собой нуклеофил (W_nuc), который гидролизует АТФ в F-актине. Угол O-Be-W_nuc в структуре составляет 144° (рис. 3a и расширенные данные рис. 6c,i), тогда как для эффективной нуклеофильной атаки требуется угол более 150°¹⁹. Хотя нельзя исключить, что ориентация нуклеотидов слегка изменена между ADP-BeF_3--связанным и ATP-связанным F-актином, проверка реконструкции показала, что плотность для W_nuc расширена (расширенные данные рис. 6e), это указывает на то, что положение W_nuc не фиксировано, что позволяет ему перемещаться в положение, которое обеспечивает угол O-Be-Wnuc более 150°, оставаясь водородом связанным с Q137. Другими словами, W_nuc, вероятно, обменивается между конфигурациями, способными к гидролизу, и конфигурациями, не способными к гидролизу.



Fig. 3: Structural insights into ATP hydrolysis and P_i release. a,b, Isolated amino-acid and water arrangement near the nucleotide in Mg2+-ADP-BeF3? F-actin (a) and Mg2+-ADP-P_i F-actin (b). Regions unimportant for interactions are deP_icted as smaller sticks. Amino acids and the proposed nucleophilic water (W_nuc) and assisting water (Wbridge) are annotated. c,d, Internal solvent cavities near the P_i binding site in ADP-P_i (c) and ADP (d) structures of Mg2+-F-actin. The upper panel shows the F-actin structure as surface with the bound P_i and water molecules. In the lower panel, F-actin is shown in cartoon representation and the amino acids forming the internal cavity are annotated and shown as sticks. Hydrogen bonds are deP_icted as dashed lines. The position of the proposed back door is highlighted in purple in the upper panel. All distances are shown in angstroms.

Хотя Q137 позиционирует W^nuc в непосредственной близости от Pγ, боковая цепь Q137 не может принять протон, чтобы действовать как каталитическое основание для гидролиза. Мы не нашли других аминокислот, которые находились бы достаточно близко, чтобы взаимодействовать с W_nuc. Вместо этого W_nuc находится на расстоянии около 4,2 Å от соседней молекулы воды (W_bridge) (рис. 3a), что недостаточно близко для образования водородной связи, но перемещение W_nuc в положение, способное к гидролизу, также поместит W_nuc на расстояние водородной связи с W_bridge. Образуя водородные связи с D154 и H161, W_bridge может представлять собой основание Льюиса с высоким потенциалом для активации W_nuc и потенциально действовать как начальный акцептор протона во время гидролиза с последующим переносом протона на D154, как ранее было предсказано с помощью моделирования^32,33 или, альтернативно, на H161. В заключение мы предполагаем, что Q137 координирует W_nuc, но за активацию W_nuc и перенос протона отвечает сеть водородных связей, включающая W_bridge, D154 и H161. Действительно, скорость гидролиза АТФ мутанта актина Q137 на аланин (Q137A) замедлена, но не отменена³⁴, тогда как тройной мутант Q137A/D154A/H161A-актина не проявляет никакой измеримой АТФазной активности³⁵.

Далее мы проверили переход G- в F-актин в структурах Ca2+-актина. Ион Ca2+ в G-актине координируется с помощью P_β и Pγ АТФ и пятью молекулами воды в гепта-координированном, пентагонально-бипирамидальном расположении (рис. 2d)^36,37. Напротив, в Ca²⁺-ADP-BeF_3- F-актине ион Ca²⁺ теряет одну координационную воду и демонстрирует октаэдрическую координационную сферу (рис. 2e). Как переход от G- к F-актину приводит к изменениям в Ca²⁺-координации? В целом, уплощение Ca²⁺-актина вызывает перестройки, аналогичные наблюдаемым в Mg²⁺-актине (расширенные данные рис. 6a,b), с аналогичным перемещением упорядоченных молекул воды из сужающейся полости SD3/1 в расширяющуюся полость SD1 (рис. 2g). Однако в Ca²⁺-G-актине одна из перемещающихся молекул воды (W_x) находится в координационной сфере Ca²⁺, что указывает на необходимость изменения гидратационной оболочки иона Ca2+ для перехода G- в F-актин. Таким образом, наш анализ объясняет, почему внутренняя координационная сфера Ca²⁺ меняется с гепта-координированной, пентагонально-бипирамидальной в ATP-G-актине на гекса-координированную, октаэдрическую в ADP-BeF^3- F-актина (рис. 2d,e,g и расширенные данные рис. 5b). Необходимая перестройка Ca²⁺-координационной сферы может представлять собой кинетический барьер для перехода от G- к F-актину, что обеспечивает структурную основу для более медленной кинетики полимеризации Ca²⁺-актина по сравнению с Mg²⁺-актином.

Мы также оценили механизм гидролиза АТФ в Ca²⁺-актине, который демонстрирует в пять раз более низкую скорость гидролиза АТФ (0,06 s^-1), чем Mg²⁺-актин (0,3 s^-1) (ссылка 5). Структурное сравнение Ca²⁺-ATP-G-актина (PDB 1QZ5) и Ca²⁺-ADP-BeF_3- F-актином показывает, что вода, соответствующая W_nuc, которая связана водородной связью с Q137, расположена ближе к Be в F-актине (3,7 Å), чем к Pγ в G-актине (4,5 Å) (расширенные данные рис. 6d,h,i). Таким образом, индукция гидролиза АТФ сопоставима в Ca²⁺-актине и Mg²⁺-актине. Однако в Ca²⁺-ADP-BeF_3- F-актина расстояние между Q137 и Wnuc составляет 3,4 Å (3,2 Å в Mg2+-актине), а угол O-Be-W_nuc равен 137° (144° в Mg2+-актине) (расширенные данные рис. 6c-i), что делает положение W_nuc аналогичным, но несколько менее благоприятным для нуклеофильной атаки, что может служить объяснением более медленной скорости гидролиза Ca²⁺-F-актина.

Далее мы проанализировали, как гидролиз АТФ влияет на расположение нуклеотидов F-актина. В состоянии Mg²⁺-ADP-P_i расщепленный мотив P_i отделен от ADP по крайней мере на 2,9 Å (рис. 1c и 3b и расширенные данные рис. 5a), что указывает на то, что ADP и P_i не образуют ковалентной связи. После высвобождения P_i P_i-связывающий сайт занят молекулой воды, что также справедливо для структур мономерного Mg²⁺-ADP-G-актина³⁸ (расширенные данные рис. 5а). В совокупности наши структуры показывают, что Mg²⁺-координационная оболочка является октаэдрической и что Mg²⁺ находится в фиксированном положении под P_β мотивом нуклеотида во всех стабильных состояниях G-актина и F-актина.

После гидролиза АТФ в Ca²⁺-F-актине координация Ca²⁺ также является октаэдрической в состоянии ADP-P_i (рис. 1f и расширенные данные рис. 5b и 6h). Интересно, что одна координирующая молекула воды замещается боковой цепью Q137 (расширенные данные рис. 5c-e). Наконец, после высвобождения P_i структура Ca²⁺-ADP-F-актина показывает, что ион Ca²⁺ меняет положение таким образом, что он непосредственно координируется P_α и P_β ADP (рис. 1g и расширенные данные рис. 5b) и четырьмя молекулами воды в октаэдрическом расположении. Таким образом, в отличие от Mg^2+, положение иона Ca²⁺ не является фиксированным в F-актине, и его координация значительно изменяется во время цикла АТФазы. Отсутствие дискретных различий в аминокислотной конформации между АДФ-состояниями Ca²⁺- и Mg²⁺-F-актина позволяет предположить, что более высокая скорость деполимеризации Ca²⁺-F-актина может быть вызвана различиями в механостабильности филамента на большом расстоянии или конформациями на концах филамента.

Считается, что P_i выходит из внутренней части F-актина через так называемую "заднюю дверь "³⁹ , которая образована боковыми цепями R177 и N111 и задними поверхностями метилированного гистидина 73 (H73) и G74 (рис. 3c,d и расширенные данные рис. 5f,g). В этой модели S14 переключает ротамерное положение, чтобы изменить свое водородно-связывающее взаимодействие с амидом основы G74 на G158, тем самым позволяя P_i подойти к задней двери, где R177 опосредует его выход^22,39. На основе реконструкции с меньшим разрешением было предложено, что задняя дверь открыта в ADP-F-актине²². Однако, водородная связь S14-G74 не повреждена, и задняя дверь закрыта в наших 2.2? Å структурах как ADP-P_i, так и ADP состояний Mg²⁺-F-актина (рис. 3c,d) и Ca²⁺-F-актина (расширенные данные рис. 5f,g). Таким образом, неожиданно наши структуры показывают, что после выхода P_i задняя дверь снова закрывается, это указывает на то, что конформация F-актина, позволяющая выход P_i, является переходным состоянием. Фактически, предложенное ротамерное переключение S14 на G158 само по себе не привело бы к открытию задней двери, что предполагает, что для высвобождения P_i требуются более значительные перестройки, и указывает на то, что механизм высвобождения остается не до конца изученным. Мы предполагаем, что высвобождение P_i можно будет продолжить изучать с помощью моделирования молекулярной динамики или крио-ЭМ в будущих исследованиях, руководствуясь нашими структурами как высококачественными исходными моделями.

Далее мы изучили зависящую от состояния нуклеотидов конформационную подвижность D-петли (остатки 39-51) и С-концевой части на внутридольковом (или продольном) интерфейсе в актиновом филаменте^21,40. Внутридольковое расположение в текущих структурах Mg²⁺-F-актина высокого разрешения в значительной степени соответствует таковому в предыдущих реконструкциях²¹, со смесью открытых/закрытых конформаций D-петли в "молодых" АТФ-связанных филаментах и преимущественно закрытой D-петлей в "старом" ADP-F-актине (расширенные данные рис. 7). В структуре Mg²⁺-ADP-BeF_3- F-актина мы смогли выделить две внутриклеточные конформации с помощью целенаправленной классификации (расширенные данные рис. 8a,b). Первая конформация (около 37% частиц, разрешение 2.32 Å) представляет собой открытую D-петлю, где D-петля изгибается наружу и взаимодействует с удлиненным С-концом соседней субъединицы актина. Во второй конформации (около 63% частиц, разрешение 2,32?? Å) С-концевой участок остается вытянутым, но отворачивается от сложенной внутрь закрытой D-петли (расширенные данные, рис. 7). В Mg²⁺-ADP-P_i F-актине С-конец образует компактную, замкнутую D-спираль, а D-петля преимущественно закрыта, тогда как структура Mg²⁺-ADP-F-актина напоминает удлиненный С-конец и закрытую D-петля конформацию состояния Mg²⁺-ADP-BeF₃ (расширенные данные, рис. 7).

Далее мы проанализировали, как конформационные изменения в нуклеотид-связывающем кармане передаются на поверхность филамента. Удивительно, но мы не смогли определить прямой путь связи между D-петлей и нуклеотид-связывающим участком (расширенные данные рис. 8c-e). Таким образом, наши структуры не объясняют, почему внутрицепочечный интерфейс может принимать две конформации в АТФ-состоянии Mg²⁺-актина. Однако мы смогли определить структурную основу для нуклеотид-зависимой конформации С-концевого участка. После гидролиза АТФ Q137 в нуклеотид-связывающем кармане перемещается вверх примерно на 0,4 Å в состоянии ADP-P_i так, что оказывается в пределах 3,1 Å от P_i (рис. 3b и 4 и Дополнительный видеоматериал 4). Это движение Q137 вверх запускает последовательность небольших движений в SD1; богатая пролином петля (остатки 108-112) перемещается немного вперед и запускает перемещение солевого мостика E107-R116, что позволяет предпоследнему остатку C374 перевернуться в гидрофобный карман, позволяя R116 взаимодействовать с карбоксилатной группой С-концевого остатка F375 (рис. 4 и Дополнительное видео 4). В целом, эти изменения приводят к образованию компактной, сложенной С-концевой спирали, которая затем снова разворачивается, когда Q137 перемещается вниз после высвобождения P_i (расширенные данные, рис. 9). В заключение, наши данные свидетельствуют о том, что Q137 и окружающие его остатки представляют собой крупную область, способную определять состояние нуклеотидов и передавать его на периферию.



Fig. 4: Structural coupling of the nucleotide-binding site to the filament surface.

Top: differences in the SD1 of F-actin in the Mg²⁺-ADP-BeF_3- and Mg²⁺-ADP-P_i structures. Residues thought to be important for the movement are annotated. Bottom: zoom of the nucleotide-binding site (1) and C-terminal region (2) of the SD1. Arrows depict the direction of the putative movement from the Mg²⁺-ADP-BeF_3- to the Mg-ADP-P_i structure. All distances are shown in angstroms. Distances shown in the Mg²⁺-ADP-BeF_3- structure are blue, whereas those in the Mg-ADP-P_i structure are orange.

Было высказано предположение, что внутриклеточный интерфейс представляет собой основной сайт для ABPs, таких как кофилин, для определения нуклеотидного состояния F-актина. Кофилин связывается и изменяет спиральную закрутку актиновых филаментов, вклиниваясь между С-концом и D-петлей^23,24,41,42, что может быть ингибировано открытой конформацией D-петли²¹. В структурах Ca²⁺-F-актина мы наблюдали сходное расположение внутриклеточного интерфейса по сравнению со структурами Mg²⁺-F-актина, за исключением того, что конформация открытой D-петли используется (adopted) в меньшей степени в Ca2+-ADP-BeF_3- F-актина (расширенные данные, рис. 7). Поэтому мы предположили, что если D-петля представляет собой доминирующий сигнал узнавания, то кофилин будет эффективно связывать и разрывать Ca²⁺-F-актин независимо от состояния нуклеотидов. Чтобы оценить это, мы инкубировали кофилин-1 и Mg²⁺- или ^Ca2+-связанный F-актин в трех нуклеотидных состояниях и измерили кофилин-зависимый разрыв филамента. Анализ показал, что, по сравнению с Mg²⁺-F-актином, кофилин-1 существенно разрывает только ADP-состояние, но не ADP-BeF_3- и ADP-P_i-связанный Ca²⁺-F-актин (расширенные данные рис. 10a). Таким образом, конформация D-петли не является единственным сенсором для связывания кофилина-1. Какой еще механизм использует кофилин для определения состояния нуклеотидов? Наши структуры показывают, что BeF_3- и P_i осуществляют водородно-связанные взаимодействия с S14 SD1; и с каркасными (backbones) G158 и V159 SD3 (расширенные данные рис. 10c-h). Таким образом, γ-фосфатная молекула образует мост между двумя субдоменами, который отсутствует в состоянии АДФ. Предыдущие исследования показали, что плотное связывание кофилина с F-актином требует изменения спиральной закрутки филамента²⁴ , что включает вращение SD1 и 2 (ссылка 42; расширенные данные рис. 10b). Этот поворот включает перемещение петли S14, что невозможно, когда S14 связан водородной связью с γ-фосфатом нуклеотида в ATP или ADP-P_i-F-актине (расширенные данные рис. 10c-i). Таким образом, наши результаты подтверждают ранее предложенную модель, согласно которой кофилин не может образовывать прочный комплекс с F-актином при наличии фосфатной связи²³ и потенциально воспринимает механические свойства филамента. Это согласуется с многочисленными биохимическими наблюдениями, согласно которым белки ADP/кофилин могут разрывать актиновые филаменты только при удалении P_i или BeF_3- из активного сайта^10,11,43.

Структуры F-актина с разрешением около 2.2 Å показывают архитектуру филамента и расположение нуклеотид (АТФ)-связывающего кармана в непревзойденных деталях, что позволяет нам пересмотреть некоторые утверждения о гибкости и стабильности F-актина. Традиционно структура F-актина описывается как полиморфная⁴⁴, а "старый" ADP-F-актин рассматривается как структурно дестабилизированная форма филамента⁴⁵. В отличие от этого, наши структуры удивительно похожи во всех разрешенных нуклеотидных состояниях, показывая, что ADP-F-актин не следует рассматривать как дестабилизированный, а скорее как "праймированное состояние" ('primed state'), которое демонстрирует более высокую скорость деполимеризации на концах филамента и чувствительно к связыванию и разрыву с помощью кофилина из-за отсутствия γ-фосфатной связи. Эта модель хорошо согласуется с результатами недавнего исследования, которое показало, что состояние нуклеотидов влияет на изгиб и механические свойства филамента, а не на крупные аминокислотные перестройки⁴⁶. Кроме того, мы показали, как механизм гидролиза АТФ в F-актине и медленная скорость полимеризации Ca²⁺-актина зависят от положения молекул воды, подчеркнув, что структуры высокого разрешения имеют решающее значение для объяснения этих важных аспектов сборки и старения филаментов. Наш оптимизированный рабочий процесс крио-ЭМ теперь также открывает путь к получению структур высокого разрешения F-актина, связанного с ABPs, что улучшит наше понимание ремоделирования цитоскелета. Наконец, мы предполагаем, что наши структуры F-актина, визуализирующие молекулы растворителя, могут служить высококачественными шаблонами для разработки малых молекул, связывающих актин, которые могут быть адаптированы для визуализации и, возможно, даже для терапевтического применения^47,48.