Центральное место в (био)печати биомиметических сосудов занимает разработка цитосовместимых (био)паст с подходящими реологическими свойствами, клеточно-доброкачественным сшиванием и соответствующими сосудам механическими характеристиками. Для этой цели очень желательны прочные гидрогели, обладающие превосходными механическими свойствами. Последние достижения в области гидрогелей DN обеспечивают общий метод изготовления гидрогелевых конструкций с беспрецедентными механическими свойствами и хорошей биосовместимостью (30, 31). Исходя из этого, мы разработали набор DN-гидрогелей на основе природных полимеров, состоящих из альгината, физически сшитого кальцием, и желатина, ковалентно поперечно сшитого mTG (рис. 1А). Желатин может образовывать ковалентные поперечные связи между глутаминовой и лизиновой группами при обработке mTG и по своей природе имеет пептидные последовательности аргинилглициласпарагиновой кислоты (ArgGlyAsp или RGD), которые способствуют адгезии и пролиферации клеток (32). Обратите внимание, что mTG - это фермент, одобренный Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США для достижения сшивания, как не вредящий клеткам (33). Ионами сшитый альгинат, также биосовместим, позволяет эффективно рассеивать энергию для улучшения механических свойств (30, 34). Помимо отличной биосовместимости, еще одним важным преимуществом использования этих природных полимеров является наличие электростатических взаимодействий в выбранных компонентах, что позволяет настраивать реологические свойства биопаст. Например, для гибридных (био)паст, содержащих 1% альгината средней вязкости (MAlg) и 15% желатина (MAlgGel15) в дистиллированной воде, альгинат имеет чистый отрицательный заряд, а полиамфолит желатина имеет чистый положительный заряд при pH 5,5 (ниже изоэлектрической точки желатина), что приводит к образованию растворимого комплекса за счет электростатического притяжения. Сильное электростатическое взаимодействие между альгинатом и желатином было подтверждено высокой очевидной вязкостью (7 Pa·s), которая была более чем в 40 раз выше, чем у отдельных компонентов (приблизительно 0,14-0,17 Pa·s) при скорости сдвига 0,1 с^-1 при 37 °C (рис. 1B).



Fig. 1. Design and mechanical properties of tough DN hydrogel (bio)inks.

(A) Schematics of DN hydrogel containing physically cross-linked alginate by calcium as the first network and chemically cross-linked gelatin by mTG as the second network. (B) Apparent viscosities as a function of shear rate for (bio)ink (MAlg1Gel15) and its individual components (MAlg1 and Gel15) at 37°C. (C) Loading-unloading tensile stress-strain curves of MAlg1, Gel15, and MAlg1Gel15 hydrogels cross-linked by CaCl2, mTG, and CaCl2/mTG, respectively. The maximum strain was 25%. (D) Loading-unloading tensile stress-strain curves of the MAlg1Gel15 hydrogels with four different cross-linking and posttreatment methods: CaCl2, mTG, CaCl2/mTG, and CaCl2/mTG/EDTA. The maximum strain was 25%. Tensile stress-strain curves (E), Young's moduli (F), and fracture energies (G) of MAlg1Gel15 hydrogels with four different cross-linking and posttreatment methods: CaCl2, mTG, CaCl2/mTG, and CaCl2/mTG/EDTA. ns, no significant difference. **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001.

Механические свойства гидрогелей DN были изучены с помощью испытаний на растяжение. Сначала мы исследовали механические свойства отдельных компонентов. На рисунке 1С показаны кривые напряжения-деформации при нагрузке для 1% гидрогеля MAlg (MAlg1) и 15% гидрогеля желатина (Gel15) по отдельности, а также гибридных (био)паст, содержащих эти два компонента вместе (MAlg1Gel15), до максимальной деформации 25%. Гидрогель MAlg, физически сшитый 2% CaCl2, и гидрогель желатина, ковалентно сшитый 2% mTG, показали модули 242,1 и 34,6 kPa, соответственно (рис. S1A). Физически сшитый альгинат демонстрировал большой коэффициент гистерезиса (78%) и большую необратимую деформацию (22%). Хотя гидрогель желатина показал низкий коэффициент гистерезиса (9%) и низкий набор деформации (1%), его механические свойства были слабыми из-за отсутствия диссипации энергии. Гидрогель MAlg1Gel15, сшитый 2% CaCl2 и 2% mTG (CaCl2/mTG), имел более низкий модуль Юнга (142,8 kPa), чем чистый гидрогель MAlg1 (рис. S1A), что, вероятно, объясняется подавлением сшивания альгината электростатическими взаимодействиями между альгинатом и цепями желатина. Гидрогель MAlg1Gel15 DN имел более высокую прочность и растяжимость, чем однокомпонентные гидрогели, благодаря двум переплетенным сетям (рис. S1B). Физически сшитая альгинатная сеть в значительной степени способствовала рассеиванию энергии в гидрогеле DN, о чем свидетельствует коэффициент гистерезиса 49% (рис. S1C). Гидрогель DN также показал низкую необратимую деформацию или набор деформации (5%) во время циклов нагрузки-разгрузки при максимальной деформации 25% (рис. S1D), благодаря ковалентно сшитой желатиновой сети. Эти результаты подтвердили, что альгинатно-желатиновый гидрогель является DN-гидрогелем с улучшенными механическими характеристиками.

Далее мы проанализировали роль физической и химической сшивки в механических свойствах гидрогелей DN. Были изготовлены гидрогели DN с физической, химической и двойной сшивкой. Чтобы разделить вклад физической и химической сшивки, для избирательного расщепления физической сшивки в гидрогелях ДН использовался хелатирующий агент EDTA. Как показано на рис. 1D, гидрогель DN с двойной сшивкой демонстрировал меньшее рассеивание энергии (меньшая петля гистерезиса) и более высокое восстановление деформации по сравнению с гидрогелями, имеющими только физическую сшивку. Гидрогель только с химической сшивкой с помощью mTG также демонстрировал очевидную петлю гистерезиса (коэффициент гистерезиса 20%; рис. S2A), обусловленную рассеиванием энергии за счет электростатических взаимодействий между альгинатом и желатином. В гидрогеле DN с двойной сшивкой электростатические взаимодействия могут обеспечить физическое закрепление между плотной физической сетью и рыхлой ковалентной сетью, способствуя передаче напряжения и дополнительной диссипации энергии. Поэтому гидрогели DN с двойным сшиванием имели самую высокую прочность на разрыв (197,7 kPa) и деформацию при растяжении (207,3%) по сравнению с односетевыми гибридными гидрогелями (рис. 1E). По сравнению с обычными гидрогелями DN с независимой сшивкой каждого компонента, ионная сшивка и ферментная сшивка в нашем проекте могли влиять друг на друга в полученном гидрогеле DN, на что указывает схожий модуль упругости гидрогеля DN с гидрогелем только с ионной сшивкой (рис. 1F). Этот результат также подтверждается более низким модулем Юнга гидрогелей, обработанных EDTA, по сравнению с гидрогелями, сшитыми только mTG, поскольку быстрая и плотная ионная сшивка альгината, вероятно, может снизить степень ферментативной сшивки желатина из-за сильного сетевого препятствия (35).

Благодаря эффективной диссипации энергии и улучшенной растяжимости, гидрогель DN с двойным сшиванием обеспечил высокую прочность 616,3 J m^-2, превышающую прочность физически сшитого односеточного гидрогеля (14,9 J m^-2) и химически сшитого односеточного гидрогеля (279,5 J m^-2; рис. 1G). После удаления физической сети гидрогеля DN с помощью EDTA энергия разрушения снизилась всего до 121,5 J m^-2, что подчеркивает решающую роль альгинатной физической сети в рассеивании энергии в жестких гидрогелях DN. Хотя альгинатная сеть может быть повреждена при деформации, растяжимая желатиновая сеть сохраняет целостность материала (рис. S2B).

После понимания механических свойств прочные гидрогелевые (био)паст DN были использованы для высокопроизводительного изготовления сосудистых каналов методом коаксиальной ECs extrusion (био)печати. Два типа многоканальных коаксиальных ECs extrusion систем с двумя или тремя каналами использовались для изготовления однослойных или двухслойных сосудистых каналов, соответственно (рис. S3). Раствор CaCl2, протекающий в сердцевинном слое, выступал в качестве физического сшивателя для альгината в гибридных (био)пастах (рис. 2A). После этого (био)печатные каналы обрабатывались раствором CaCl2/mTG для послепечатного отвердения. (Био)пасты с различными составами использовались для (био)печати трубок с широко настраиваемыми механическими свойствами. Перед установкой параметров (био)печати были измерены реологические свойства двух типичных (био)паст. На рис. 2B комплексная вязкость (био)паст MAlg1Gel15 уменьшилась на два порядка величины с температурой перехода при температуре приблизительно 31°C. Выше температуры перехода (био)паста превращались из твердого состояния в жидкое, о чем свидетельствует модуль потери плато, превышающий модуль сохранения (рис. S4A). При более низкой температуре (например, 30°C) вязкость и напряжение сдвига (био)паст MAlg1Gel15 становились очень высокими и поэтому не подходили для микрофлюидной extrusion (био)печати (рис. S4, B и C). Между тем, была измерена и другая гидрогелевая (био)паста DN, содержащая 2% альгината низкой вязкости (LAlg) и 3% GelMA (LAlg2GM3), которая, как было установлено, подходит для инкапсуляции клеток. LAlg2GM3 имел гораздо более высокую вязкость, чем отдельные компоненты, опять же из-за электростатических взаимодействий между компонентами (рис. S4D). Однако его вязкость была очень низкой как при комнатной температуре, так и при 37°C из-за относительно низкой концентрации полимера и слабых электростатических взаимодействий между альгинатом и GelMA (рис. S4, E и F).

Fig. 2. Microfluidic extrusion (bio)printing and mechanical properties of tubular conduits.

...

Реологические свойства различных (био)паст могут быть точно настроены для облегчения коаксиальной ECs экструзионной (био)печати путем изменения температуры. Например, пастау MAlg1Gel15 (био)паста с температурой перехода 31°C можно было нагреть до 37°C, в результате чего получалась жидкость с низкой вязкостью (рис. 2C). Для сравнения, биопасту LAlg2GM3 необходимо охладить, чтобы увеличить вязкость и придать сдвиговое утончение для (био)печати при комнатной температуре (рис. S4, E и F). Обе эти (био)пасты показали низкое напряжение текучести (пересечение G' и G'') в диапазоне температур (био)печати, это позволяет осуществление extrusion (био)пасты при низком напряжении сдвига (shear stresses ) (рис. 2C).

В процессе коаксиальной extrusion поток CaCl₂ в сердцевине обеспечивал физическое сшивание альгинатного компонента (био)пасты in situ, поддерживая трубчатую форму каналов (36). Кроме того, ванна, содержащая раствор CaCl2/mTG, использовалась для дальнейшего сшивания (био)напечатнных трубок. Вместе с правильно установленными параметрами (био)печати можно было получить высококачественные полые трубки с двойной сшивкой. Как показано на рис. 2D, (био)напечатанные моно- и двухслойные каналы имели однородные размеры и гладкую поверхность. Коаксиальная ECs extrusion (био)печать имеет ряд существенных преимуществ при изготовлении сосудистых каналов. Во-первых, этот метод позволяет получать структурно значимые трубки с настраиваемыми диаметрами и толщиной стенок как для моно-, так и для двухслойных каналов (рис. 3D и рис. S5). Кроме того, этот подход позволяет с высокой производительностью изготавливать длинные, непрерывные трубки (рис. 2E). Например, за один сеанс (био)печати можно было непрерывно экструдировать (создать) до 19 м лишенных клеток каналов без засорения сопла. Более того, коаксиальная (био)печать обеспечила эффективное производство каналов с минимальным количеством отходов (био)паст, что идеально подходит для экономически эффективного и крупномасштабного производства каналов. В качестве демонстрации, 1 мл (био)пасты MAlg1Gel15 может быть использован для создания 165 см монослойного канала с толщиной стенки от 150 до 180 µм и 232,9 см двухслойного канала с диаметром внутренней стенки от 80 до 100 µм (рис. 2F).

Fig. 3. Structural and biological functions of (bio)printed veinous conduits.

(Био)пасты с различными составами были использованы для производства сосудистых каналов малого размера с широко регулируемыми механическими свойствами. Механические свойства (био)напечатанных моно- и двухслойных каналов были изучены и сравнены с полой веной и аортой мыши аналогичных размеров. На рис. 2G показаны кривые напряжения-деформации монослойных кондуитов, (био)напечатанных с помощью различных (био)паст с различным содержанием MAlg (от 0,5 до 2%) и желатина (от 10 до 20%). Модуль Юнга и прочность на растяжение (био)напечатанных трубок очень чувствительны к содержанию MAlg вместо желатина (рис. 2, H - J). Например, для печатных гидрогелей DN, состоящих из 15% желатина, модуль Юнга может увеличиться с 65,3 до 472,0 kPa при увеличении содержания MAlg от 0,5 до 2%. (Био)печатные трубки из гидрогеля DN с содержанием альгината 0,5% были механически слабыми, в то время как жесткость и прочность (био)печатных трубок с 2% MAlg были намного выше, чем у мышиной вены. Напротив, гидрогелевые трубки DN, состоящие из 1% MAlg, имели механические свойства, соответствующие модулю растяжения, деформации разрушения и пределу прочности при растяжении вены мыши. Однако не наблюдалось существенной разницы в механической прочности между трубками из 10-20% желатина с фиксированным альгинатом. С точки зрения механических свойств, трубки на основе гидрогеля MAlg1Gel15 имели прочность 538,0 kPa и деформацию разрушения 183,9%, что аналогично прочности 738,1 kPa и 134,7% для полой вены мыши, соответственно. Рисунок 2K и фильм S1 показывают, что трубки MAlg1Gel15 и полая вена мыши могут быть растянуты до одинаковой длины. Поэтому, учитывая как механические свойства, так и пригодность для печати, (био)паста MAlg1Gel15 были выбраны в качестве оптимальных (био)паст для (био)печати каналов. Была отмечена значительная разница в механических свойствах гидрогелевых пленок MAlg1Gel15 и (био)печатных каналов. По сравнению с образцами пленок, каналы демонстрировали повышенную жесткость и прочность, вероятно, из-за вызванного сдвигом выравнивания альгинатных и желатиновых цепей в продольном направлении во время коаксиальной экструзионной (био)печати (37, 38).

Примечательно, что трубки на основе гидрогеля DN также демонстрировали хорошую физиологическую механическую стабильность. Трубки MAlg1Gel15 сохраняли стабильную жесткость в среде клеточной культуры (например, среде SMC) в течение 2 недель (рис. S6, A и B). Удовлетворительная физиологическая стабильность текущих гидрогелей DN может быть приписана плотной ионной сшивке за счет более высокого соотношения блоков гулуронат/маннуронат используемого альгината (39).

Мы также (био)напечатали двухслойные сосудистые каналы, чтобы имитировать артерию с двумя различными слоями. Механически прочный гидрогель MAlg1Gel15 использовался в качестве внутреннего слоя для обеспечения механической поддержки, а более слабые гидрогелевые (био)пасты, содержащие 3% GelMA и различные типы и концентрации альгинатов, использовались для биопечати внешнего слоя для поддержки роста клеток. При использовании MAlg от 1 до 0,5% модуль Юнга двухслойных трубок снизился с 208,5 до 110,2 kPa (рис. S7). Для дальнейшего снижения жесткости трубки LAlg2GM3 были предложены в виде (био)паст (LAlg2GM3) для (био)печати внешнего слоя двухслойных каналов. Полученные трубки имели низкий модуль Юнга 63,4 kPa при сохранении высокой растяжимости (240,4%), попадая в аналогичный диапазон аорты мыши (58,9 kPa и 158,1%, соответственно; рис. S7).

Кроме того, мы измерили давление разрыва (био)печатных моно- и двухслойных каналов, чтобы проиллюстрировать их сходство с нативными сосудами. Согласно закону Лапласа, давление разрыва положительно коррелирует с толщиной стенки (40). В качестве эталонов использовались полая вена и аорта мыши, размеры которых были схожи с размерами (био)напечатанных трубок. Эти сосудистые каналы были хорошо раздуваемыми и могли быть привязаны швами 5-0 к металлическим соединителям (рис. S8 и фильм S2). Монослойные каналы (толщина стенок 100 µм) демонстрировали немного более высокое давление разрыва (1113,1 мм рт. ст.), чем полая вена мыши (897,1 мм рт. ст.) с аналогичной толщиной стенок (рис. 2L). Давление разрыва увеличилось до 1497,6 мм рт.ст. при толщине стенки 160 µм. Давление разрыва двухслойных кондуитов с толщиной стенки 100 µм составляло 1137,8 мм рт.ст., что было немного ниже, чем у аорты мыши (1630,9 мм рт.ст.). Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что (био)напечатанные гидрогелевые трубки DN с использованием оптимизированных нами (био)паст структурно и механически в достаточной степени соответствуют нативным сосудам.

Пропускная способность и селективная проницаемость, основные функции кровеносных сосудов, позволяют проходить потоку и диффузии малых молекул через стенку, в то же время задерживая или блокируя транспорт макромолекул (41). В большинстве ранее опубликованных исследований, включая наши работы (26, 27), (био)напечатные сосудистые каналы на основе гидрогеля уязвимы и механически слабы. Такие сосудистые каналы часто не выдерживают физиологического давления, оказываемого потоком, что ограничивает их применение in vitro и in vivo. Этот факт считается общим недостатком многих коаксиально extruded полых каналов (29, 42).

Тем не менее, разработанные в данном исследовании (био)напечатнные трубки были достаточно прочными, чтобы выдержать хирургические узлы, и легко поддавались введению и фиксации тупых металлических игл, что важно для исследований и применения после биопечати. Для оценки перфузии и проницаемости эти (био)напечатнные трубки были соединены с металлическими разъемами в биореакторе и поддерживали замкнутую систему циркуляции с помощью перистальтического насоса (рис. S8). Флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-конъюгированный декстран (FITC-Dex) двух различных молекулярных размеров, от 3 до 5 и 150 кДа, представляющих малые молекулы и макромолекулы, соответственно, затем перфузировали (прокачивали) через (био)печатные трубки. FITC-Dex (150 кДа) едва диффундировал через стенку монослойного канала в течение 24-часового периода перфузии, тогда как FITC-Dex от 3 до 5 кДа быстро проникал в течение короткого времени и далее распределялся по всему резервуару биореактора в последующие часы, о чем свидетельствовали заметные различия в интенсивности флуоресценции в резервуаре (рис. S9, A - D). Аналогичные профили диффузии наблюдались в двухслойных каналах как для 3-5-кДа FITC-Dex, так и для 150-кДа FITC-Dex (рис. S9, E-H). Проницаемость 150-кДа FITC-Dex была снижена в 16 раз по сравнению с 3-5-кДа FITC-Dex в монослойных кондуитах (каналах), в то время как в двухслойных кондуитах она заметно снизилась с 7,2 х 10^-3 до 0,6 х 10^-3 см s^-1 (рис. S10). Эти результаты свидетельствуют о избирательной проницаемости молекул через стенки (био)напечатанных каналов. Мы смогли поддерживать перфузию FITC-Dex (150 кДа) или среды через сосудистые каналы в течение 3 дней без каких-либо утечек (фильм S4), демонстрируя их потенциал для долгосрочного применения в условиях физиологической циркуляции. Идеальный сосудистый канал должен поддерживать кровоток и выдерживать давление, оказываемое кровотоком, сразу после имплантации in vivo (43). Поэтому мы дополнительно оценили перфузию эритроцитов (RBC) через длинный монослойный канал без заметного разрыва или утечки (фильм S3), иллюстрируя, что (био)печатные каналы могут иметь потенциал для пропуска и выдерживания давления, оказываемого кровотоком, при сохранении структурной целостности.

Стенка венозного кровеносного сосуда состоит из внутреннего эндотелия, состоящего из ECs, среднего мышечного слоя, состоящего из SMCs и эластичной ткани, и наружного волокнистого соединительнотканного слоя (44). Вены и венулы имеют более тонкие мышечные стенки, чем артерии и артериолы, в основном потому, что давление и скорость кровотока в венах и венулах намного ниже (рис. 3А) (44). Для воссоздания нативного венозного канала с функциональными эндотелиальным и мышечным слоями, HUVSMC сначала были посеяны на внешней поверхности (био)напечатанного монослойного кондуита. После 3 дней культивирования в статических условиях при 37°C по всей внешней поверхности кондуита образовался компактный слой HUVSMCs. Затем HUVECs перфузировали и позволили им прикрепиться во внутреннем просвете того же канала, уже имеющего внешний гладкомышечный слой. После инкубации канала в аналогичных условиях в течение еще 7 дней (таким образом, в общей сложности 10-дневная культура), полый венозный кондуит со слоем сливающегося эндотелия в просвете и тонкой гладкомышечной оболочкой на внешней поверхности был создан для дальнейших исследований. Здесь, чтобы повысить эффективность посева клеток, мы создали гидрофобную форму для посева клеток из смеси polydimethylsiloxane (PDMS) и воска с присутствующими канавками, размеры которых соответствовали напечатанным каналам. Посеянные клетки в ограниченных канавках избирательно прикреплялись к гидрофильным поверхностям гидрогелевых каналов, размещенных внутри, а не к гидрофобной поверхности формы. Жизнеспособность посеянных HUVSMC оценивали на 3 и 10 дни, а жизнеспособность посеянных HUVEC оценивали на 3 и 7 дни посева HUVEC (т.е. на 6 и 10 дни посева HUASMC на тот же кондуит). Как показано на рис. 3 (B и C), жизнеспособность HUVSMCs составила 90,9% на 3-й день и 89,9% на 10-й день, а HUVECs - 92,9% на 3-й день и 92,0% на 7-й день, соответственно.

Пролиферация и морфология HUVECs и HUVSMCs в (био)печатных и клеточных венозных каналах оценивались с помощью окрашивания F-актина. Экспрессия белков плотных соединений, zonula occludens-1 (ZO-1 в HUVECs указывала на формирование межклеточных соединений между клетками, необходимых для правильного функционирования эндотелиального слоя. Аналогично, ECs спрессия α-гладкомышечного актина (α-SMA), изоформы актина, играющей роль в сократимости сосудистых SMCs, HUVSMCs показала успешное формирование мышечного слоя на внешней поверхности канала (рис. 3D). Кроме того, экспрессия ламинина в HUVECS указывала на то, что HUVECs активно синтезируют ламинин, который представляет собой один из основных структурных компонентов базальной мембраны и необходим для присоединения ECs к базальной мембране и реакции сосудов на напряжение сдвига. Помимо α-SMA, в HUVSMC также обнаружена экспрессия тубулина, еще одного маркерного белка сократительного фенотипа сосудистых SMC (рис. 3E). Экспрессия этих маркеров HUVECs и HUVSMCs подтвердила успешное формирование венозных трубок с функциональным эндотелием, покрывающим внутреннюю стенку просвета, и мышечным слоем на внешней поверхности.

Эндотелий играет ключевую роль в качестве сосудистого барьера, контролирующего экстравазацию биомолекул, питательных веществ и клеток. Доказано, что эта барьерная функция регулируется ECs, выстилающими поверхности просветов сосудов, но не нарушается гомеостаз SMCs (23). Для дальнейшей оценки барьерной функции венозных каналов мы оценили проницаемость FITC-Dex (от 3 до 5 кДа) с помощью эндотелизированных венозных трубок. В качестве контроля использовали бесклеточные каналы того же размера. FITC-Dex пропускали через лишенные клеток и эндотелизированные кондуиты отдельно. Коэффициент диффузии, который измерялся как отношение площади серого цвета диффундировавшего FITC-Dex в фиксированном поле микроскопа в выбранной временной точке, отражал скорость проникновения через стенку канала. Как показано на рис. 3 (G-H), рис. S11 и фильм S5A, FITC-Dex быстро проникал в стенки лишенных клеток кондуитов, а затем выходил из просвета. Напротив, присутствие слоя HUVEC эффективно задерживало скорость диффузии молекулы (фильм S5B). Таким образом, эти результаты подтвердили барьерную функцию эндотелизированных 3D (био)печатных венозных каналов.

Артерии и артериолы имеют относительно толстые мышечные стенки (рис. 4A), поскольку им приходится выдерживать более высокое кровяное давление. Поэтому артериальные каналы с более толстыми мышечными стенками были созданы путем биопечати двухслойных сосудистых кондуитов, состоящих из внешнего слоя, инкапсулированного HUASMC, и внутреннего слоя гидрогеля. После созревания HUASMC в просвет внутренней стенки были посеяны HUAECs. В то время как для создания внутреннего прочного гидрогелевого слоя использовалась та же рецептура паст, что и для (био)печати венозных каналов (MAlg1Gel15), (био)пасты для внешнего слоя были оптимизированы для обеспечения желаемого поведения клеток. Начальный модуль упругости гидрогеля оказывает заметное влияние на морфологию и пролиферацию внедренных в него клеток. В целом, материалы с меньшими значениями жесткости и большими размерами ячеек благоприятны для распространения и пролиферации клеток (45). Соответственно, сначала были протестированы механические свойства (био)печатных монослойных полых трубок с использованием различных составов (био)паст, состоящих из различных комбинаций альгината и желатина или GelMA. При фиксированном содержании GelMA 3% (GM3) начальная жесткость трубок зависела как от содержания альгината, так и от его типа. Как показано на рис. S12 (A - C), начальный модуль Юнга образцов, содержащих 2% LAlg, был ниже 100 kPa. Для сравнения, у трубок MAlg1GM3, полученных с использованием MAlg, модуль Юнга был намного выше (265,3 kPa).

Fig. 4. Structural and biological functions of (bio)printed arterial conduits.

Далее мы оценили изменения их физиологической стабильности в культуральной среде SMC. На рис. S12 (D и E), модуль упругости трубок LAlg2Gel3 заметно снизился с 62,0 до 29,6 kPa после 4 часов инкубации в среде SMC. Поскольку физическая сеть LAlg может быстро деградировать через ионный обмен под воздействием среды. Плато стабильного модуля в течение длительного времени обработки было обусловлено химически сшитой сетью желатина. Высокая жесткость LAlg2Gel3 могла бы ограничить надлежащую клеточную деятельность. С этой целью мы заменили желатиновый компонент на GelMA с меньшим количеством остатков лизина, чтобы уменьшить ферментативное сшивание. Хотя полученные трубки LAlg2GM3 имели высокую начальную жесткость 112,3 kPa из-за плотной ионной сшивки, после обработки средой механические свойства трубок LAlg2GM3 стали слишком мягкими для проведения тестов после 1-дневной культуры в среде SMC. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что гидрогели на основе LAlg обладают плохой физиологической стабильностью в буферном растворе или среде. Следовательно, гидрогель LAlg2GM3 демонстрировал значительное снижение жесткости во время культивирования, что благоприятно для клеточных функций. Напротив, материал внутреннего слоя MAlg1Gel15 в качестве механической опоры трубок показал хорошую физиологическую стабильность (рис. S6), предполагая, что тип альгината играет ключевую роль в определении стабильности получаемых гидрогелей.

Далее была проведена оценка поведения клеток в вышеуказанных (био)пастах. Биопасты, состоящие из 3% GelMA и 0,5, 1 или 2% LAlg, обеспечивали распространение HUASMCs, о чем свидетельствовали результаты окрашивания F-актина (рис. S13). Напротив, биопасты, содержащие MAlg, ингибировали рост HUASMC даже при содержании альгината до 0,5%. Также было отмечено, что (био)пасты, содержащие LAlg в количестве менее 2%, плохо поддаются печати. Соответственно, LAlg2GM3 был выбран в качестве оптимальной биопасты с хорошим клеточным поведением и пригодностью к печати для биопечати внешних слоев трубок с инкапсулированными HUASMCs. Наполненные HUASMC биопечатные каналы инкубировали при 37°C не менее 14 дней до образования плотного объема HUASMC во внешних слоях. На рисунке 4B представлена жизнеспособность бионапечатанных HUASMCs на 3 и 10 дни биопечати. Окрашивание F-актином биопечатных HUASMCs показало равномерное распределение HUASMCs в артериальных каналах (рис. 4C).

Примерно через 14 дней HUAECs были дополнительно посеяны в просвет путем перфузии клеточной суспензии, следуя той же процедуре, которая использовалась для посева венозных кондуитов. После дополнительных 7 дней культуры были получены полые артериальные трубки со слоем эндотелия в просвете и относительно толстой гладкомышечной оболочкой на внешней поверхности. Средняя толщина слоев HUASMC в артериальных кондуитах составила 55 µm, что было заметно больше, чем в венозных кондуитах (~20 µм). ECs спрессия ZO-1 на HUAECs и α-SMA на HUASMCs показала формирование эндотелиального слоя в стенке просвета и компактного гладкомышечного слоя на внешней поверхности кондуита (рис. 4D). Аналогичным образом, барьерная функция артериальных кондуитов была подтверждена перфузией FITC-Dex (от 3 до 5 кДа). Проницаемость FITC-Dex через эндотелизированные артериальные кондуиты показала, что наличие компактного слоя HUAEC явно замедляло скорость транспорта этих флуоресцентных молекул по сравнению с контролем без эндотелия (рис. 4E, рис. S14 и S15 и фильм S5, C и D).

Кровеносные сосуды, особенно артерии и артериолы, постоянно получают различные сосудосуживащие и сосудорасширяющие стимулы, на которые реагируют SMCs в мышечном слое, вызывая сужение или расширение сосудов для регулирования сосудистого тонуса и, следовательно, кровотока и кровяного давления (46). Вазоконстрикция - это сужение просвета в результате сокращения мышечного слоя, в то время как вазодилатация - это расширение просвета в результате расслабления мышечного слоя (47). Чтобы оценить сократимость и, следовательно, фенотип HUASMCs в мышечном слое наших биопечатных артериальных трубок, на артериальные кондуиты наносили фенилэфрин, один из мощных вазоконстрикторов (48). Поскольку фенилэфрин вызывает вазоконстрикцию через α-адренергический рецептор, перед оценкой сократимости мы оценили экспрессию α-1a-адренергического рецептора артериальными SMC в артериальных каналах (рис. 4F). Стимуляция α-1a-адренорецепторов фенилэфрином (10 µМ) вызвала заметное уменьшение диаметра артериальных каналов, что отражает сужение артериальных SMC в мышечном слое артериальных кондуитов (рис. 4, G и H). Аналогично, исследования показали, что ацетилхолин, вазодилататор, расслабляет сокращения сосудистой гладкой мускулатуры, индуцированные фенилэфрином, опосредованные мускариновым ацетилхолиновым рецептором М3 (49). Как показано на рис. 4F, артериальные SMC в артериальных кондуитах демонстрировали ECs спрессию M3 мускаринового ацетилхолинового рецептора. Затем реакцию на ацетилхолин (10 µM) исследовали в преконстриктивных артериальных кондуитах, индуцированных фенилэфрином. Применение ацетилхолина действительно расслабляло вызванные фенилэфрином сокращения артериальных SMC, что приводило к расширению артериальных кондуитов примерно до исходного размера (рис. 4, G и H). Таким образом, бионапечатанные артериальные SMCs в артериальных каналах проявляли важные физиологические функции, т.е. вазоконстрикцию и вазодилатацию, в ответ на стимулы вазоконстриктора и вазодилататора.

Пандемия коронавирусной болезни 2019 (COVID-19), вызванная инфекцией SARS-CoV-2, поразительно повлияла на нашу жизнь с декабря 2019 года (50). SARS-CoV-2 связывается с рецептором ангиотензин-превращающего фермента 2 (ACE2) через гликопротеин в spike для проникновения в клетки хозяина (51). SARS-CoV-2 инфицировал более 539 миллионов человек, вызвав более 6,3 миллиона смертей по всему миру (50). Новые варианты SARS-CoV-2 постоянно развиваются из-за мутаций в геноме SARS-CoV-2, некоторые из которых классифицируются как варианты, вызывающие беспокойство, поскольку они более агрессивны, высокотрансмиссивны, вакциноустойчивы и вызывают более тяжелые проявления болезни по сравнению с исходным штаммом SARS-CoV-2 (52). Кроме того, были зарегистрированы многочисленные реинфекции и рецидивы SARS-CoV-2 (53). Примечательно, что хотя COVID-19 в первую очередь считается респираторным заболеванием, он может поражать несколько других жизненно важных систем органов, включая сердечно-сосудистую, почечную и мозговую системы. Например, недавно клинические наблюдения и исследования in vivo на животных показали, что неблагоприятное воздействие COVID-19 на многочисленные органы связано с усилением сосудистой дисфункции, такой как негерметичность сосудистого барьера и усиление экспрессии фактора фон Виллебранда, что вызывает повышенную коагуляцию, высвобождение цитокинов и воспаление (54-56).

3D (био)напечатанные кровеносные сосуды, повторяющие основные характеристики нативных кровеносных сосудов, могут быть использованы в качестве надежных доклинических моделей in vitro для изучения прямых сосудистых реакций на инфекции SARS-CoV-2. Таким образом, мы оценили применимость (био)печатных каналов в качестве 3D сосудистых моделей для изучения инфекции SARS-CoV-2 с использованием pCoV-VPs и эффективности лечения противовирусными препаратами с помощью двух клинически одобренных противовирусных препаратов, remdesivir (RMD) и amodiaquine (ADQ), которые давали пациентам с COVID-19 (57, 58). Кровеносные сосуды подвержены инфекции SARS-CoV-2, поскольку рецептор ACE2 экспрессируется всеми структурными клетками сосудов, включая ECs, SMCs, фибробласты и перициты, среди других типов клеток (59, 60).

Перед заражением pCoV-VP экспрессию рецептора ACE2 оценивали в венозных каналах. Как показано на рис. 5А, HUVSMCs в венозных трубках демонстрировали высокий уровень экспрессии рецептора ACE2. Венозные кондуиты были инокулированы меченными mCherry pCoV-VPs при кратности заражения 0,5 в течение 48 часов для определения восприимчивости вируса in vitro в присутствии противовирусных препаратов. В качестве контроля использовали кондуиты, инфицированные pCoV-VPs в отсутствие препаратов. После 48 часов воздействия инфекцию клеток с pCoV-VPs можно было наблюдать при флуоресцентной микроскопии (рис. 5B). Количество pCoV-VPs в инфицированных венозных каналах было определено количественно путем измерения активности люциферазы. Попадание вируса в необработанные венозные каналы было установлено как 100%. Инфицирование венозных кондуитов pCoV-VPs снизилось до 38,3% в присутствии RMD и до 73,2% в присутствии ADQ (рис. S16). Аналогично, цитопатический эффект pCoV-VPs был проанализирован с помощью анализа "живые/мертвые" (рис. 5C) и (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолиевого (MTS) анализа (рис. 5D). Цитопатическое действие pCoV-VPs снижалось в присутствии противовирусных препаратов при одновременном повышении показателей жизнеспособности клеток и метаболической активности. Таким образом, эти препараты значительно подавляли проникновение вируса и вызванную инфекцией гибель клеток под действием pCoV-VPs, экспрессирующих белки-шипов SARS-CoV-2.



Fig. 5. In vitro, ex vivo, and in vivo applications of (bio)printed vascular conduits.

In vitro, ex vivo, and in vivo applications of (bio)printed vascular conduits. (A) Fluorescence confocal images showing the expression of ACE2 receptors by HUVSMCs and HUVECS in the bioprinted vascular conduits. The cells were counterstained with DAPI for nuclei. Red, ACE2 receptors; blue, nuclei. Scale bars, 100 μm. (B) Fluorescence and bright-field microscopic images showing mCherry-expressing pCoV-VP–infected HUVSMCs and HUVECs in the bioprinted vascular conduits in the absence of antiviral drug (pCoV-VPs) and in the presence of 10 μM of RMD (pCoV-VPs + RMD) or 10 μM ADQ (pCoV-VPs + ADQ). Scale bars, 100 μm. (C) Fluorescence microscopic images showing live/dead staining of cells in the bioprinted vascular conduits after pCoV-VP infection without antiviral drugs (pCoV-VPs) and with 10 μM of RMD (pCoV-VPs + RMD) or 10 μM of ADQ (pCoV-VPs + ADQ). Green, live cells; red, dead cells. Scale bar, 100 μm. (D) MTS assay showing metabolic activities of cells in the bioprinted vascular conduits after pCoV-VP infection in the absence and presence of antiviral drugs. *P < 0.05. (E) Ex vivo connection and perfusion of bioprinted vascular conduits linked to native vessels by bioglue. (i and ii) A small-sized printed vascular conduit (1-mm outer diameter) anastomosed with a mouse aorta; (iii and iv) a printed larger-sized (5-mm outer diameter) vascular conduit anastomosed with a human popliteal vein. Scale bars, 20 mm. (F) In vivo implant and perfusion between mouse vena cava and a printed vascular conduit in mouse. (i) Schematic diagram showing in vivo connection between mouse vena cava and a (bio)printed vascular conduit; (ii) exposure of mouse vena cava; (iii) perfusion of the blood after anastomosis. Scale bar, 1 mm.

Наконец, для изучения будущего трансляционного потенциала в качестве сосудистых трансплантатов, (био)напечатанные трубки разного диаметра были соединены с нативными сосудами. Сначала мы (био)напечатали трубку диаметром 1 мм и приклеили ее к эксплантированной ex vivo аорте мыши для достижения анастомоза. Оранжевые флуоресцентные бусины перфузировали из одного открытого конца (био)напечатанного кондуита, чтобы пройти место соединения и выйти из открытого конца аорты мыши. Как показано на рис. 5E (i и ii) и в фильме S6, краситель беспрепятственно проходил через весь свободный от утечек просвет. Чтобы усилить эту концепцию, мы впоследствии использовали свежевыделенную подколенную вену, взятую у пациента, которому проводилась операция шунтирования, для соединения с (био)напечатанным каналом большего размера (5 мм в диаметре). Аналогично, не наблюдалось утечки во время перфузии зеленых флуоресцентных шариков из естественной вены в (био)напечатанный сосудистый кондуит (рис. 5E, iii и iv, и фильм S7). С этой целью мы провели испытание in vivo на мышах (рис. 5F, i), где обнажили полую вену (рис. 5F, ii), а затем приклеили к ней с обоих концов стерильный (био)напечатнный сосудистый канал. После снятия зажимов наблюдалось быстрое течение крови через полую вену в (био)печатный кондуит и в полую вену без заметной утечки (рис. 5F, iii). Этот набор результатов показал, что (био)напечатанные кондуиты могут быть анастомозированы с нативными сосудами в различных сценариях, что является прямым доказательством потенциального применения для реконструкции сосудов in vivo, хотя необходима дальнейшая оптимизация.

Таким образом, мы разработали прочные гидрогелевые (био)пасты DN, состоящие из желатина (или GelMA) и альгината с подходящими реологическими свойствами и клеточно-доброкачественным сшиванием для микрофлюидической (био)печати сконструированных сосудистых кондуитов малого диаметра. Биопечатные венозные и артериальные каналы, состоящие из внутреннего эндотелиального слоя и внешнего гладкомышечного слоя, имитировали важные особенности нативных вен и артерий, соответственно. Они демонстрировали превосходные механические свойства, включая давление разрыва, эластичность, растяжимость и жесткость, сравнимые с таковыми у нативных сосудов. В дополнение к перфузии и селективной проницаемости, в (био)напечатанных кондуитах наблюдалась экспрессия соответствующих биомаркеров. Очень важно, что компактный эндотелиальный монослой обеспечивал барьерную функцию, а более толстый гладкомышечный слой артериальных кондуитов позволял кондуитам сужаться и расширяться подобно нативным артериолам. (Био)печатные сосудистые кондуиты также могут служить хорошими сосудистыми моделями in vitro для изучения сосудистых реакций на вирусную инфекцию и эффективности противовирусных препаратов. Кроме того, эти (био)напечатанные каналы показали потенциал использования в качестве сосудистых трансплантатов для применения in vivo. По сравнению с существующими достижениями в этой области, коаксиально (био)напечатанные сосудистые трубки в данном исследовании имеют преимущества как по физическим свойствам, так и по физиологической стабильности (таблица S1). Однако наша технология не лишена ограничений. Например, несмотря на высокую прочность, сшивание этих гидрогелевых трубок оказалось непростым из-за их недостаточной способности удерживать шов. В настоящее время предпринимаются дополнительные усилия по дальнейшему совершенствованию рецептуры наших (био)паст. В некоторых областях трубок, SMCs на кондуитах ориентированы продольно параллельно трубкам, что отличается от ориентации SMCs в нативных сосудах, несмотря на наблюдаемый уровень функций. В связи с этим, окружное выравнивание SMCs может быть более желательным для инженерных кровеносных сосудов, чтобы имитировать их нативные структуры и функции. Дальнейшие исследования могут быть направлены на достижение окружного выравнивания SMC на этих (био)печатных сосудистых каналах. Кроме того, необходимо провести всесторонние оценки in vivo.