Способность генерировать сложную мозг-подобную ткань в контролируемых культуральных средах из стволовых клеток человека открывает большие перспективы для понимания механизмов, лежащих в основе развития человеческого мозга. Церебральные или другие неуправляемые нейронные органоиды развиваются из эмбриональных стволовых (ES) клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток в трехмерный нейроэпителий, который самостоятельно формирует структуру, регионализацию и, в конечном итоге, нейроны различных областей мозга^1-3. Судьба и состояние каждой клетки частично регулируется сложными цепями транскрипционных факторов ( TFs ), сходящихся в регуляторных элементах и взаимодействующих с хроматином для обеспечения точного контроля экспрессии генов. Подходы к секвенированию одиночных клеток позволяют профилировать экспрессию генов и доступность хроматина в отдельных клетках, что открывает новые возможности для изучения набора регуляторных элементов управления в любом данном типе клеток или состоянии (регуломы). Всесторонние атласы клеток мозга мыши и человека могут быть использованы в качестве справочника для понимания состава и развития клеток органоидов^4-6. Прямые сравнения между органоидами и первичными аналогами мыши и человека позволили количественно оценить заметное сходство между профилями транскриптома нейронных предшественников и нейронов^7-9. Органоиды мозга были использованы для успешного моделирования микроцефалии², перивентрикулярной гетеротопии¹⁰, аутизма¹¹ и других нарушений нейрального развития^12,13, которые могут оказывать дифференциальное воздействие на различные области мозга человека. Однако мы еще не понимаем генные регуляторные сети (GRNs), которые координируют раннее развитие мозга человека в нормальных и нарушенных условиях.

Исследования в модельных системах выявили основные сигнальные факторы и программы регуляции генов, которые координируют формирование областей мозга у позвоночных. Первоначально внешние сигналы устанавливают передне-заднюю ось, которая запускает дополнительные локальные градиенты вниз по течению для сегментации нервной трубки в отдельные области мозга. Комбинаторная деятельность морфогенов, включая SHH, WNTs, BMPs, FGFs, NOTCH, нейрегулины и R-спондины, сходится на транскрипционных факторах для осуществления регионализации. Многое из того, что известно об этих путях регуляции морфогенеза мозга, было изучено на не-человеческих модельных системах, и остается неясным, как развитие мозга человека отличалось от такового у наших млекопитающих предков. Более того, детальное изучение механизмов, контролирующих мульти-региональные органоиды мозга, может дать новое понимание процесса самоорганизации мозга¹⁴.

Новые одноклеточные геномные методы позволяют проводить высокопроизводительный и количественный анализ одноклеточных транскриптомов и доступных профилей хроматина. Эти характеристики также могут быть количественно оценены в рамках отдельной клетки и с помощью multi-omic измерений, что позволяет получить представление об экспрессии и регуляции генов в одной и той же клетке. Кроме того, редактирование генов CRISPR-Cas в сочетании со считыванием транскриптома одной клетки^15-17 позволяет проводить объединенные эксперименты по генетическим пертурбациям in vivo¹⁸. Эти стратегии и векторные системы в сочетании с функционализацией iPS-клеток человека индуцибельными системами CRISPR-Cas9 дают возможность нарушать функции генов в органоидах мозга и систематически оценивать эффекты в различных областях мозга человека.

Здесь мы использовали мультимодальный подход для изучения регуляции клеточной судьбы во время раннего развития мозга человека. Сначала мы построили регулом из одноклеточного транскриптома и доступных данных хроматинового профилирования в течение всего периода развития органоида мозга. Возмущение регулома с помощью мультиплексных экспериментов по CRISPR-пертурациям в органоидах выявило влияние на региональные решения о судьбе, а также влияние на состояние клеток после приобретения судьбы. Мульти-omics анализ критического периода формирования регионов мозга в органоидах с нокаутом GLI3 (KO) и при воздействии сигнальной молекулой Sonic Hedgehog (SHH) выявил нарушение регуляции диверсификации дорсовентрального теленцефалона, и с помощью предполагаемого регулома мы выделили прямые и косвенные мишени GLI3. Тем самым мы создали регуляторную перспективу для понимания и изучения раннего развития человеческого мозга.

Чтобы изучить механизмы, лежащие в основе развития человеческого мозга, мы получили данные одноклеточного транскриптома и одноклеточного доступного хроматинового профилирования в течение времени развития органоида мозга (рис. 1а, расширенные данные рис. 1а и дополнительная таблица 1). Набор данных включает 11 временных точек из 3 линий iPS клеток человека и 1 линии ES клеток, охватывающих 2 месяца развития, включающих формирование эмбриоидного тела, индукцию нейроэктодермы, нейроэпителизацию, формирование нейронных предшественников и нейрогенез. В каждой временной точке органоидные ткани четырех линий были разобщены, и на одной и той же клеточной суспензии были проведены РНК-секвенирование (scRNA-seq) одиночных клеток и одноклеточный анализ хроматина, доступного для транспозазы, с секвенированием (scATAC-seq) (10x Genomics). Данные секвенирования были демультиплексированы с использованием однонуклеотидных вариантов, специфичных для каждого индивидуума, и два способа для каждой линии и временной точки были интегрированы с помощью canonical correlation analysis (CCA)¹⁹ (расширенные данные рис. 1b-f и дополнительная таблица 2). Мы построили "мульти-омные мета-клетки", содержащие информацию о транскриптоме и доступности хроматина, используя двухстороннее сопоставление с минимальными затратами и maximum-flow bipartite matching²⁰ в пространстве CCA (расширенные данные рис. 1b, g, h). Мы оценили интеграцию с помощью мульти-омного набора данных, в котором транскриптом и доступный хроматин были измерены в одночных клетках, и наблюдали сильную корреляцию (расширенные данные рис. 1i,j). Мета-клетки были интегрированы с помощью спектра кластерного сходства (CSS)²¹ , а интегрированные данные были визуализированы с помощью uniform manifold approximation and projection (UMAP). Это позволило выявить относительно непрерывное распределение состояний клеток на протяжении всего временного интервала (рис. 1а). Развитие органоида происходит от плюрипотентности (например, POU5F1) через состояние нейрональных клеток-предшественников (NPC) (например, PAX6, VIM) к состояниям клеток-предшественников и нейронов дорсального телецефалона (например, EMX1, NEUROD6), вентрального телецфалона (например, DLX5, ISL1, GAD1), нетеленцефалических областей (например, TCF7L2, LHX9) и небольшой мезенхимной популяции (например, DCN, COL5A1), причем клетки из разных линий в значительной степени смешивались (расширенные данные рис. 1f,k,l). 1f,k,l). Высокая размерность данных может быть использована для идентификации маркерных генов и генных регуляторных областей для различных клеточных состояний (рис. 1b, расширенные данные рис. 1l и дополнительная таблица 3). Мы наблюдали псевдотемпоральный каскад изменений доступности хроматина в течение развития, связанный с генами, вовлеченными в поддержание стволовых клеток, формирование нервной трубки, морфогенез, пролиферацию нейронных предшественников, спецификацию судьбы нейронов и другие соответствующие биологические процессы (расширенные данные рис. 1m и дополнительная таблица 4).



Fig. 1: Multi-omic atlas of brain organoid development reveals developmental hierarchies and critical stages of fate decision.

a, Schematic of the experimental design and UMAP embedding of integrated multi-omic metacells. Organoids from three iPS cell lines and one ES cell line were dissociated for paired scRNA-seq and scATAC-seq at time points spanning 4 days to 2 months of development. The two modalities were integrated to form metacells with RNA and ATAC components. EB, embryoid body; IPs, intermediate progenitors; N.ect., neuroectoderm; N.epi., neuroepithelium; PSCs, pluripotent stem cells. b, Examples of loci with differential accessibility during organoid development from pluripotency. c, Schematic of the branch-inference strategy. High-resolution clusters were assigned to branches on the basis of terminal fate transition probabilities calculated based on RNA velocity. d, Branch visualization in a force-directed layout. The circles represent high-resolution clusters of metacells coloured by assignment (neuroepithelium (grey); non-telencephalon progenitors (teal); telencephalon progenitors (plum); dorsal telencephalon (orange); ventral telencephalon (purple)). e, Graph representation of regional branches coloured by mean expression (log[transcript counts per 10,000 + 1]) (top) and gene activity (log[transcript counts per 10,000 +m1]) (bottom) of marker genes. The range of values is indicated for each plot. Norm., normalized. f, Stage- and branch-specific gene expression and motif enrichment z-score (Methods). Values are minimum-maximum (min-max) scaled across rows. N.t., non-telencephalon; t., telencephalon.

...

Мозг человека имеет уникальные особенности, отличающие его от других видов. Несмотря на описание с высоким разрешением клеточного состава мозга мыши и человека, полученное в результате недавних работ по созданию клеточного атласа^4-6, изучение механизмов, контролирующих развитие мозга человека, является серьезной проблемой из-за сложности получения тканей на самых ранних стадиях формирования мозга и отсутствия методов систематического манипулирования функциями генов. Здесь мы объединили данные транскриптома, доступности хроматина и генетических возмущений, чтобы получить представление о механизмах, лежащих в основе регионализации человеческого мозга. В широком смысле мы обнаружили, что программы, выявленные в мышиных и других нечеловеческих модельных системах, хорошо сохраняются у человека, и примечательна степень, в которой ткани мозга, полученные из стволовых клеток, воспроизводят эти программы. Мы сосредоточились на GLI3 как хорошо изученном транскрипционном факторе, контролирующем дорсовентральную спецификацию судьбы в теленцефалоне грызунов. Мы нашли четкие доказательства того, что эта же транскрипционная программа хорошо сохранилась у человека. Важно отметить, что эти данные убедительно свидетельствуют о том, что мульти-региональные органоиды человеческого мозга могут быть прогностическими модельными системами. Отметим, что неуправляемые протоколы нейроорганоидов приводят к сильным различиям между линиями стволовых клеток в отношении пропорций регионов, представленных в каждом органоиде или партии.

Мы создали систему GRN-индукции Pando, которая включает в себя особенности регуляторного генома, которые ранее не использовались для глобального анализа программ развития. Pando обобщает основанный на регрессии вывод GRN для мультимодальных наборов данных, объединяя транскриптомы, доступность хроматина, расширенный справочник мотивов семейства TF, известные CRE и эволюционную консервацию в гибкую структуру. Пакет R реализует полную стратегию вывода GRN, включая выбор региона-кандидата, сопоставление мотивов, подгонку модели и обнаружение генов и регуляторных модулей. Кроме того, он предлагает широкий спектр регрессионных моделей, которые можно использовать для выявления GRN. Мы выделили интересные аспекты сети, такие как модули TF, участвующие в переходе от плюрипотентности через нейроэктодерму к нейроэпителию, а также подсети, связанные с регионарными состояниями мозга. Такой анализ сетей может направлять будущие эксперименты, направленные на программирование конкретных состояний нейронов, и может быть использован для интерпретации генных возмущений в органоидах человека⁴⁵. Отметим, что существующие ограничения включают отсутствие всеобъемлющей информации об активных и репрессивных модификациях гистонов и состоянии конформации хроматина во время развития органоидов, а также неполные базы данных мотивов TFs . Мы ожидаем, что это будет активной областью исследований, и Pando обладает гибкостью для включения таких суждений в структуру GRN-интерпретации.

Мы подтвердили критическую роль GLI3 в спецификации клеточной судьбы дорсальной части теленцефала у человека, а также определили вклад GLI3 в спецификацию нейронов MGE и LGE/CGE. Интеграция одноклеточных мульти-омных данных из органоидов GLI3-KO и глобальной GRN позволила предложить модель, в которой GLI3 индуцируется в ранних NPC теленцефалона через передачу сигналов SHH во время регионализации нейроэпителия. Затем GLI3 регулирует нижележащие мишени, активируя приобретение кортикальной судьбы через дифференциальную активность HES5, HES4 и HES1 и ингибируя программу индукции MGE через регуляцию BCL11A, LHX8 и NKX2-1. Наши данные также свидетельствуют о том, что GLI3 может регулировать гены HES напрямую, вероятно, через NOTCH-независимые механизмы, аналогичные тем, что были недавно описаны при развитии конечностей мыши⁴⁶. В более широком смысле, наши данные показывают исключительный потенциал мультимодальных одноклеточных геномных и органоидных технологий для понимания генных регуляторных программ развития человеческого мозга.