Миграция клеток необходима для различных патофизиологических процессов, таких как развитие, гомеостаз тканей, иммунный надзор и метастазирование рака. Хотя было показано, что механические силы, возникающие при взаимодействии клеток с субстратом и окружающей жидкостью, регулируют миграционное поведение клеток^6-8, влияние физиологически значимой внеклеточной вязкости на функции клеток остается неясным. На сегодняшний день большинство функциональных анализов клеток in vitro, включая подвижность, проводятся в среде с вязкостью, близкой к вязкости воды (0,7 сантипуаз (cP) при 37 °C). Однако вязкость интерстициальной жидкости варьирует до 3,5 cP (ссылка 9) и может быть дополнительно увеличена макромолекулами, такими как муцины, секретируемыми не только резидентными эпителиальными клетками различных тканей, но и опухолевыми клетками¹⁰. Рост первичной опухоли может сдавливать лимфатические сосуды и нарушать дренаж¹¹ , что со временем приводит к накоплению макромолекул. Повышенная деградация внеклеточного матрикса в местах опухолей также усугубляет скопление макромолекул¹², что может еще больше увеличить вязкость интерстициальной жидкости¹³. Примечательно, что физиологическая вязкость цельной крови колеблется между 4 и 6 cP, а при патологических отклонениях может превышать 8 cP¹⁴.

Предыдущие исследования показали, что сверхфизиологическая вязкость (≥40 cP) увеличивает подвижность карциномных и нормальных клеток на двумерных (2D) поверхностях^15,16. Это довольно контринтуитивно, поскольку вязкость замедляет движение частиц в жидкостях. Тем не менее, ключевые фундаментальные и трансляционные вопросы остаются без ответа, включая то, как клетки воспринимают физический сигнал повышенной, но физиологически значимой внеклеточной вязкости; изменяет ли повышенная вязкость клеточный фенотип и лежащие в основе механизмы клеточной локомоции; как цитоскелет взаимодействует с ионными каналами и транспортерами для обеспечения эффективной миграции при повышенной вязкости; переносится ли более быстрая подвижность, наблюдаемая in vitro, на условия in vivo и, если да, влияет ли воздействие повышенной вязкости на метастазирование рака.

Чтобы изучить влияние повышенной вязкости внеклеточной жидкости на функционирование клеток in vitro, мы включили в среду для культивирования клеток количество метилцеллюлозы в 65 kDa, необходимое для получения среды с вязкостью от 0,77 cP (0%) до 8 cP (0,6%) при 37 °C без заметного изменения осмолярности среды (расширенные данные рис. 1a,b). Используя в качестве модели клетки рака молочной железы MDA-MB-231, мы обнаружили, что скорость миграции внутри ограничительных (ширина х высота =3,5 х 10 µм²) каналов на основе полидиметилсилоксана (PDMS)¹⁷ (расширенные данные рис. 1c) увеличивалась с ростом внеклеточной вязкости, достигая пика при 5-8 cP (рис. 1a). Среда с повышенной (8 cP) вязкостью с использованием альтернативных биологически инертных макромолекул, таких как декстран (500 кДа)² и поливинилпирролидон K-90, также способствовала ускорению подвижности (расширенные данные рис. 1d-f), в то время как низкомолекулярный декстран (6 кДа), использованный при молярности (~1,95 µМ), аналогичной декстрану 500 кДа, не усиливал ограниченную миграцию (расширенные данные рис. 1g). Эти данные показывают, что повышенная вязкость внеклеточной жидкости усиливает миграцию клеток MDA-MB-231 в ограниченном пространстве независимо от природы макромолекул. Увеличение скорости миграции при повышенной вязкости также наблюдалось с использованием различных опухолевых клеток (метастатические клетки головного мозга MDA-MB-231-BrM2, полученные из рака молочной железы (далее BrM2)¹⁸, из карциномы молочной железы SUM15919 и остеосаркомы человека (HOS)) и нераковых клеток (нормальные фибробласты человека и гладкомышечные клетки аорты человека (hAOSMCs)) (рис. 1б).

Fig. 1: Viscosity enhances cell migration and promotes an ARP2/3-mediated dense actin network at the leading edge.

a,b, Speeds of MDA-MB-231 cells (a) and other indicated cell types (b) inside confining channels at prescribed viscosities. The red lines represent the median of ≥ 69 cells from ≥ 3 experiments. c, Cell trajectories on 2D collagen-coated surfaces after 10 h. d, Cells disseminating from 3D spheroids. e, The time required for the first cell dissociation from each spheroid (n≥ 53) from 3 experiments. f, Airyscan images of phalloidin stained cells on collagen-coated substrates. The red arrow indicates high F-actin staining along the cell edge. g, The fraction of cell-projected area with a Lifeact-GFP-rich lamella for n≥ 28 cells from 3 experiments. h, The leading edge of Lifeact-GFP-expressing cells on collagen-coated surfaces at t = 0 min (red) and t = 2 min (cyan) (left). Right, leading-edge lamella growth in n≥ 19 cells from 3 experiments. Data are the moving average ± s.e.m. P < 0.05 for all points t≥ 50 s. Time is shown as min:s. i,j, STORM reconstruction (i) and density quantification (j) of F-actin for cells (n≥ 13) on substrates from 2 experiments. k, The average actin density over time from 20 stochastic simulations. Viscous forces were applied at t = 6 s (red arrow) and maintained until the end of the simulation. l, Confocal images of cells expressing Lifeact-GFP and ARP3-mCherry in confinement. The red arrow indicates high ARP3 intensity at leading-edge protrusions at 8 cP. m, The relative ARP3-mCherry intensity along normalized cell length in confined cells. Data are the moving average ± s.e.m. for n = 21 cells from 4 experiments. ***P < 0.001 for all comparisons at normalized cell length > 0.96. The x axis is discontinued between 0.25 and 0.75 to highlight differences at the cell edges. n, Confined migration speeds of SC versus ARP3/ARPC4 double-knockdown cells (n = 90) from 3 experiments. For e, g, j and n, data are mean ± s.d. Unless otherwise indicated, statistical comparison was performed with respect to 0.77 cP. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis tests followed by Dunn's test (a and n), Mann-Whitney U-tests (BrM2 only) or unpaired t-tests after log-transformation (other cells) (b), unpaired t-tests (e, g and j) and two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Sidak's test (h and m). Scale bars, 250 µm (c), 50 µm (d), 25 µm (f, white), 3 µm (f, red), 10 µm (h), 2 µm (i), 20 µm (l). The cell model was MDA-MB-231 unless otherwise indicated. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. ...

... Хотя модель предсказывала общее увеличение плотности F-актина (рис. 1k и расширенные данные рис. 3a,b,f), более детальная оценка показала увеличение количества заостренных концов по сравнению с capped barbed концами сразу после приложения повышенной вязкой силы (расширенные данные рис. 3g). Этот результат свидетельствует об увеличении разветвленной актиновой сети, поскольку новые актиновые филаменты формируются с заостренными концами, прикрепленными к материнским филаментам. В соответствии с установленной ролью ARP2/3 в нуклеации разветвленного актина^24,25, клетки при 8 cP демонстрировали более интенсивный сигнал ARP3 на их переднем крае и, в частности, на кончиках выступающих филаментов, в отличие от относительно равномерного распределения, обнаруженного при исходной вязкости в клетках на 2D поверхности и внутри ограниченных пространств (рис. 1l,m и расширенные данные рис. 4a). Соответственно, нокдаун ARP2/3 с помощью короткой шпилечной РНК (shRNA), нацеленной на ARP3 и/или ARPC4, или использование специфического для ARP2/3 ингибитора CK666 подавляло миграцию в ограниченном пространстве при повышенной, но не исходной вязкости (рис. 1n и расширенные данные рис. 4b-d). Важно отметить, что истощение ARP2/3 изменило выступающую (protrusive) морфологию ограниченных клеток при 8 cP на bleb-based (расширенные данные рис. 4e). В соответствии с установленным перекрестным взаимодействием между ARP2/3 и фокальными адгезиями¹⁷ , при 8 cP было обнаружено увеличенное количество и размеры фокальных адгезий (расширенные данные рис. 4f-h), которые были преимущественно распределены в передней части клетки (расширенные данные рис. 4i-k), что соответствует схеме локализации ARP3 (рис. 1l,m). В целом, мы продемонстрировали, что ARP2/3-опосредованное разветвление актина происходит как прямой ответ клеток на увеличение вязкости. Далее мы исследовали путь, по которому клетки чувствуют и адаптируются к повышенной вязкости жидкости.

В ограниченном пространстве опухолевые клетки мигрируют, набирая и сбрасывая воду на полюсах клеток²¹ , а также проталкивая столб воды впереди себя, что создает гидравлическое сопротивление^3,17. Повышенная внеклеточная вязкость увеличивает гидравлическое сопротивление на переднем крае ограниченных клеток. Двухфазная модель миграции клеток, которая рассматривает цитозоль, состоящий, по сути, из воды, и актиновую сеть как две жидкие фазы, взаимодействующие друг с другом, предсказывает, что высокое гидравлическое сопротивление способствует миграции клеток за счет поглощения воды²⁶. Таким образом, мы исследовали, увеличивает ли гидравлическое сопротивление из-за повышенной вязкости жидкости поглощение воды, что может привести к увеличению объема клеток. Используя конфокальную визуализацию²⁰ , мы продемонстрировали, что повышенная вязкость (8 cP) увеличила объем клеток MDA-MB-231 примерно на 40% на неограниченных 2D поверхностях и внутри ограничивающих каналов (рис. 2а). Учитывая хорошо известную роль NHE1 в регуляции увеличения объема²⁷ и ограниченной миграции²¹, мы изучили его паттерн поляризации, уровень активности и функциональный вклад в подвижность при различных значениях вязкости. В соответствии с предыдущими исследованиями²¹, NHE1 был преимущественно локализован на переднем крае ограниченных клеток при 0,77 cP (рис. 2б,в). Интересно, что поляризация NHE1 в передней части клетки и активность NHE1, отслеживаемая с помощью ратиометрического датчика pH pHRed²⁸, заметно увеличивались при 8 cP (рис. 2b-d). Истощение NHE1 (расширенные данные рис. 5a-c) отменяло вызванное вязкостью увеличение объема клеток на двумерных поверхностях (расширенные данные рис. 5d) и в заключении (рис. 2e). Для моделирования вклада актиновой и NHE1-опосредованной (модель осмотического двигателя) подвижности мы расширили двухфазную актиново-цитозольную модель, включив в нее различные модели распределения фокальных адгезий и NHE1, обнаруженные при повышенной и исходной вязкости (см. раздел "Теоретические методы" в Методах; расширенные данные Рис. 5e). Модель успешно воспроизвела более высокую поляризацию F-актина в передней части клетки при 8 cP по сравнению с 0,77 cP (расширенные данные рис. 5f). Более того, предсказания модели показали, что отмена NHE1-опосредованного потока ионов оказывает большее ингибирующее действие на скорость миграции при 8 cP по сравнению с 0,77 cP, что было подтверждено экспериментально с использованием shNHE1 (рис. 2f). Критическая роль NHE1 в ограниченной миграции была подтверждена с помощью двух различных последовательностей shNHE1 (расширенные данные рис. 5g) и фармакологического ингибирования в различных клеточных линиях (расширенные данные рис. 5h). Предыдущие исследования показали, что NHE1 работает в координации с аквапорином 5 (AQP5) для опосредования поглощения воды в условиях confinement (замкнутого пространства) ²¹. Соответственно, истощение AQP5 было столь же эффективным в снижении миграции в замкнутом пространстве, как и нокдаун NHE1 (расширенные данные рис. 5i).

Когда клетки подвергаются механическим возмущениям, баланс сил на поверхности клетки показывает, что натяжение клеточной мембраны изменяется, что может привести к активации мембранных каналов⁷ , тем самым позволяя клеткам ощущать внешние сигналы и реагировать на них, опосредуя приток кальция через механо-/осмо-чувствительные ионные каналы (MOSICs). В соответствии с этим представлением, клетки, подвергнутые воздействию повышенной вязкости (8 cP, демонстрировали заметное увеличение натяжения мембраны (рис. 2g,h), как это наблюдалось для клеток, подвергнутых воздействию гипотонических растворов (расширенные данные рис. 5j), и количества кальциевых шипов (рис. 2i и расширенные данные рис. 5k). Более того, как непроницаемые для клеток (BAPTA), так и проницаемые (BAPTA AM) кальций-хелатные агенты отменяли индуцированное вязкостью усиление миграции клеток (расширенные данные Рис. 5l,m), тем самым предполагая потенциальное участие MOSICs в этом процессе. Возможные Са2+-проницаемые MOSICs, экспрессируемые в клетках MDA-MB-2313 , включают PIEZO1 и PIEZO2, TRPM7 и TRPV4. Нокдаун PIEZO1 или PIEZO2 не уменьшил усиление подвижности клеток при повышенной вязкости (расширенные данные рис. 5n,o). Нокаут TRPM7 на основе CRISPR-Cas9, ключевого механосенсора гидравлического давления^3,17 и напряжения сдвига² , также не блокировал усиление миграции при 8 cP (расширенные данные рис. 5p). Аналогично, 2-аминоэтоксидифенил борат (2-АФБ), который блокирует TRPC1, TRPC6 и TRPM7 и ограничивает высвобождение Ca2+, не оказывал ингибирующего эффекта на подвижность клеток (расширенные данные рис. 5q). В соответствии с влиянием вязкости жидкости на реснитчатые эпителиальные клетки^29,30, клетки, подвергшиеся воздействию 8 cP, демонстрировали повышенный ток TRPV4 по всей клетке и кальциевые осцилляции, которые были отменены с помощью shTRPV4 или лечения ингибитором TRPV4 HC067047 (рис. 2i,j и расширенные данные рис. 6a-c). Хотя наши измерения концентрации внутриклеточного кальция не предоставили точной локализации кальциевого сигнала, сообщалось, что генерируемый TRPV4 приток кальция действует либо локально³¹, либо вдали от места его генерации³². В соответствии с кальций-зависимым эффектом вязкости на миграцию ограниченных пространством клеток (расширенные данные рис. 5l,m), нокдаун TRPV4 был достаточным для отмены вызванного вязкостью усиления подвижности клеток в ограничении (рис. 2k), тем самым иллюстрируя, что TRPV4 является ключевым MOSIC, активируемым повышенной внеклеточной вязкостью. Критическая роль TRPV4 была подтверждена с помощью второй целевой последовательности для shTRPV4 (расширенные данные рис. 6a,d) и специфического фармакологического ингибитора GSK2193874 (расширенные данные рис. 6e). Чтобы обобщить наши результаты, мы показали, что ингибирование или истощение TRPV4 в клетках SUM159, HOS, U87 и BrM2 снижало миграцию в ограниченном пространстве при 8 cP до уровней при исходной вязкости (расширенные данные рис. 6f). В целом, повышенная вязкость способствует NHE1-зависимому набуханию клеток, что приводит к увеличению мембранного напряжения, которое запускает приток кальция через MOSIC TRPV4. В соответствии с предложенной моделью, ингибирование NHE1 отменяло опосредованное вязкостью увеличение мембранного напряжения (рис. 2h), цельноклеточных токов TRPV4 (рис. 2l и расширенные данные рис. 6g) и кальциевых шипов (рис. 2i и расширенные данные рис. 6c). Напротив, снижение экспрессии β1-интегрина, который, как предполагается, участвует в механической активации TRPV4³³, не уменьшало кальциевые всплески при 8 cP (расширенные данные рис. 6h).

Итак, повышенная вязкость увеличивает механическую нагрузку, которая запускает формирование более плотной сети актина на ведущем крае клеток, где высокая концентрация ezrin способствует поляризации NHE1 и NHE1-зависимому набуханию клеток Это приводит к увеличению напряжения мембран, которое, в свою очередь, активирует TRPV4 и регулирует приток кальция .

...В целом, мы показали, что повышенная внеклеточная вязкость вызывает механическую нагрузку на передний край клетки, что вызывает внутреннее ремоделирование актина, способствующее привлечению NHE1 к клеточной мембране через его партнера по связыванию ezrin. Обогащение NHE1 в передней части клетки увеличивает объем клетки за счет поглощения воды, как постулируется в модели осмотического двигателя²¹ , что приводит к увеличению напряжения мембраны, которое, в свою очередь, вызывает активацию TRPV4 для опосредованного входа кальция и повышения RHOA-опосредованной сократимости. Согласованное действие модели осмотического двигателя, ARP2/3-опосредованной более плотной актиновой сети и более толстого кортекса, поддерживаемого активным RHOA на переднем крае клетки, усиливает подвижность при повышенной внеклеточной вязкости (рис. 3i).

Чтобы выяснить, вызывает ли повышенная вязкость TRPV4-зависимую механическую память через транскрипционную регуляцию, мы провели слепой анализ РНК-последовательности (RNA-seq) для сравнения транскриптомов клеток SC, подвергнутых исходной или повышенной (8 cP) вязкости в течение 6 дней, а также клеток shTRPV4, подвергнутых повышенной вязкости. Анализ главных компонент (PCA) показал, что первая и вторая главные компоненты (PC1 и PC2) в совокупности объясняют 91% различий между этими наборами данных (расширенные данные, рис. 11a). Парные сравнения выявили множество дифференциально экспрессированных генов (DEGs, коэффициент ложного обнаружения (FDR) < 0,05) между клетками SC при 8 cP по сравнению с клетками 0,77 cP или клетками shTRPV4 при 8 cP (расширенные данные рис. 11b). Проанализировав эти DEGs с помощью ingenuity pathway analysis, мы определили путь Hippo как наиболее ингибированный в клетках SC, подвергнутых 8 cP по сравнению с 0,77 cP или по сравнению с клетками shTRPV4 при 8 cP (расширенные данные рис. 11c). YAP и TAZ являются ключевыми эффекторами сигнального пути Hippo, которые активируют нижележащие транскрипционные программы в ответ на механические воздействия⁴³. Интересно, что YAP1 и TEAD2 повышены в клетках SC при 8 cP, тогда как shTRPV4 восстанавливает их экспрессию до исходного уровня вязкости (расширенные данные рис. 11d). Чтобы подтвердить участие сигнального пути Hippo в формировании механической памяти о вязкости, мы сначала продемонстрировали, что воздействие на клетки 8 cP увеличивает ядерную транслокацию YAP в течение первых 4 часов по сравнению с воздействием 0,77 cP (расширенные данные рис. 11e). Во-вторых, ингибирование YAP вертепорфином (0,1? µМ) отменяло развитие памяти, индуцированной повышенной вязкостью, о чем свидетельствует отсутствие у предварительно кондиционированных клеток повышенной подвижности (расширенные данные рис. 11f). Примечательно, что ингибирование YAP не влияло на подвижность при исходной вязкости (расширенные данные рис. 11f). В совокупности эти данные позволяют предположить, что клетки, предварительно подвергнутые воздействию повышенной вязкости, приобретают TRPV4-зависимую механическую память через транскрипционный контроль пути Hippo.

Чтобы установить in vivo значимость вызванной вязкостью более быстрой миграции клеток, клетки рака молочной железы MDA-MB-231 культивировали либо при 8 cP (прекондиционированные), либо при 0,77 cP (нативные) в течение 6 дней и ресуспендировали при исходной вязкости перед введением в дорсальную аорту 3х дневных эмбрионов рыбок данио⁴⁴. Движение клеток в узких межсегментарных сосудах отслеживалось с помощью конфокальной микроскопии (рис. 4d,e). В соответствии с результатами, полученными in vitro, предварительно кондиционированные по сравнению с нативными клетки двигались со значительно большей скоростью (рис. 4f) и устойчивостью (расширенные данные рис. 10b-d) в узких межсегментарных сосудах эмбрионов рыб.

Чтобы определить, приводит ли повышенная склонность опухолевых клеток к миграции in vivo, предварительно кондиционированных при повышенной вязкости, к более высокой экстравазации и колонизации тканей, мы использовали модели инъекции в хвостовую вену эмбриона цыпленка и мыши⁴⁵. Клетки MDA-MB-231, культивированные при 3 cP (прекондиционированные) или 0,77 cP (нативные) в течение 6 дней, были ресуспендированы при исходной вязкости и введены в сосудистую сеть хориоаллантоидной мембраны цыпленка (CAM). Предварительно кондиционированные клетки продемонстрировали более высокий потенциал экстравазации in vivo по сравнению с нативными клетками (расширенные данные рис. 10e). Аналогично, заметно большее количество предварительно кондиционированных (8 cP) по сравнению с нативными (0,77 cP) опухолевых клеток колонизировало легкие мышей через 48 часов после введения в хвостовую вену (рис. 4g,h), о чем свидетельствует количественная оценка одиночных человеческих виментин-положительных клеток MDA-MB-23145 (расширенные данные рис. 10f). Одноклеточные колонии, обнаруженные через 48 часов, в конечном итоге привели к образованию большего количества метастатических очагов в легких через 3 недели (рис. 4g,i,j). Эти наблюдения показывают, что предварительно кондиционированные по сравнению с нативными клетки более успешно экстравазировали в легкие, что привело к образованию большего метастатического бремени у мышей через 3 недели после инокуляции. В соответствии с критической ролью TRPV4 в обеспечении повышенной миграционной способности предварительно кондиционированных клеток in vitro, истощение TRPV4 отменяло повышенный потенциал предварительно кондиционированных по сравнению с нативными клетками колонизировать легочную ткань in vivo как через 48 часов, так и через 3 недели (рис. 4k,l). Для подтверждения наших измерений колонизации легких с помощью конфокальной микроскопии из легких была выделена ДНК и содержание ДНК человека было оценено с помощью количественной ПЦР (qPCR) с праймерами, специфичными для длинных пересекающихся ядерных элементов человека (hLINE)¹⁹. qPCR подтвердила повышенную способность предварительно кондиционированных клеток образовывать как микро-, так и макрометастазы in vivo (рис. 4m,n). Нокдаун TRPV4 устранял усиление индуцированного вязкостью высева одиночных клеток в легкие через 48 часов с тенденцией к подавлению высева предварительно обусловленных, но не нативных клеток (рис. 4m). Это вмешательство также заметно уменьшило метастатическое бремя как нативных, так и предварительно кондиционированных клеток на 3 неделе (рис. 4n).

Здесь мы показали, что вязкость внеклеточной жидкости является физической подсказкой, которая способствует более быстрой подвижности и диссоциации клеток из 3D опухолевых сфероидов in vitro, а также экстравазации и распространению рака в животных моделях. Учитывая, что физиологически значимая вязкость жидкости in vivo выше, чем у воды, а также тот факт, что клетки могут развивать вязкостную память, данное исследование открывает новый путь для контроля метастатического потенциала раковых клеток. Также будет интересно исследовать, влияет ли внеклеточная вязкость на другие физиологически значимые клеточные процессы, такие как морфогенез.