Клеточный механосенсинг (чувствительность к механическим воздействиям) - способность клетки обнаруживать и реагировать на физическое микроокружение - вовлечен в важные процессы, включая развитие, гомеостаз тканей и болезни (1, 2). Например, восприятие сдвиговой деформации потока (shear flow ) вихревого течения в кровообращении необходимо для правильного развития сосудистой системы, а истощение сенсоров ригидности способствует неопластической раковой трансформации , т.е. росту, не зависящему от сопротивляемости субстрата (3, 4). Механочувствительные ионные каналы и интегрин-опосредованные фокальные адгезивные соединения (слипчивые структуры) являются основными механосенсорами, которые отвечают за преобразование механических сигналов в биохимические сигналы в этих процессах (5).

Механосенсорная функция фокальных адгезий проявляется в зависящей от ригидности сборке и обороте адгезий, в которых участвуют сотни различных белков фокальной адгезии, изменяющих поведение клеток во время распространения и миграции (1). Кроме того, механосенсинг фокальной адгезии регулирует такие пути, как AKT, митоген-активируемая протеинкиназа и передача сигналов Hippo, которые влияют на решения о судьбе клеток (1, 6, 7). Поскольку адгезии влияют на поведение и судьбу клеток, молекулярные компоненты и динамика фокальных адгезий были подробно изучены. Существует надежный процесс набора и обработки белков адгезии на тонко отрегулированных этапах формирования, роста и оборота фокальных адгезий, который коррелирует с принятием решений о состоянии клетки на основе взаимодействия клетки с микроокружением (8). Существуют доказательства того, что белки, чувствующие силу, такие как талин и винкулин, также регулируют функции фокальных адгезий (2, 8-13). В отличие от этого, хотя свойства ионной проводимости многих механочувствительных ионных каналов хорошо охарактеризованы структурными исследованиями и patch-clamp-исследованиями, механизмы преобразования сил матрикса в пропускную способность каналов не очень хорошо изучены (14). Отчасти это объясняется сложной природой передачи сигналов ионными каналами и механически индуцированного притока кальция. Например, механочувствительные каналы связаны как с клеточной пролиферацией, так и с апоптозом в зависимости от контекста, что позволяет предположить, что как распределение, так и динамика механочувствительных ионных каналов важны для понимания критических механосенсорных процессов клетки (15, 16).

Существует множество доказательств перекрестного взаимодействия между механочувствительными ионными каналами и фокальными адгезиями. Локальное поступление кальция является критическим для сборки и разборки структур фокальной адгезии на основе зависимости от calpain обоих процессов (17-21). При сборке структур адгезии (сличивости) во время распространения клеток восприятие ригидности включает зависящее от силы ригидности расщепление с помощью calpain талина, которое необходимо для формирования нормальной слипчивости и роста нормальных клеток (20). В отличие от этого, трансформированные клетки не чувствуют жесткость матрикса, и адгезия значительно меньше, хотя опухолевые клетки развивают более высокие тягловые силы (22). В связи с этим возникает вопрос, используют ли трансформированные клетки кальций для образования адгезии так же, как и нормальные клетки. Кроме того, в нескольких исследованиях было обнаружено, что разборка структур адгезии зависит от силы расщепления с помощью кальпаина (18, 19). Таким образом, существует критическая роль участия кальция в нормальную динамику адгезии, которая изменяется в трансформированных (опухолевых) клетках, а анализ задействованных каналов может раскрыть важные аспекты жизненного цикла фокальных адгезий.

Несколько кальций-проницаемых каналов вовлечены в динамику фокальных адгезий (23-27). Один из них, Piezo1, представляет особый интерес, поскольку первые сообщения о Piezo1 свидетельствуют о его взаимодействии с интегринами (28). Впоследствии Piezo1 был идентифицирован как настоящий механочувствительный ионный канал в клетках млекопитающих (29). С тех пор было показано, что Piezo1 играет множество ролей в важных биологических процессах, и растет интерес к тому, как он функционирует in situ (15, 29-31). Piezo1 широко экспрессируется в соматических типах клеток и связан с механосенсингом при предопределении линии стволовых клеток, регуляции кровяного давления, активации врожденного иммунитета и развитии сосудов (4, 30, 32, 33). Было показано, что активность Piezo1 связана с актиновым цитоскелетом, зависимым от интегринов (26, 34, 35). Когда клетки Neuro2A механически перемешивают с помощью микрометровых бусинок, покрытых коллагеном IV или матригелем, порог напряжения, необходимый для запуска Piezo-зависимого поступления Ca²⁺, значительно снижается (36). Кроме того, сигнальные пути интегринов являются критическими для надлежащего функционирования Piezo1 в контексте ответа эндотелиальных клеток на кровоток (37). Мы хотели бы изучить возможный перекрестный обмен между Piezo1 и фокальными адгезиями.

В данном исследовании мы показали, что в нормальных клеточных линиях Piezo1 необходим для сборки зрелых структур адгезии и локализуется в адгезиях по мере их созревания. В нормальных клеточных линиях из многих тканей Piezo1 концентрируется в фокальных адгезиях в зависимости от силы и диссоциирует после разборки интегринов адгезий. Его локализация коррелирует с локальным поступлением кальция и разборкой адгезий, вероятно, посредством кальпаин-зависимого процесса. Напротив, в трансформированных клетках Piezo1 распределен диффузно и не влияет ни на сборку, ни на разборку адгезий, а поступление кальция в адгезивное соединение незначительно. Эти исследования показывают, что Piezo1 обычно взаимодействует преходяще с адгезиями во время сборки, а затем его зависящее от силы привлечение к зрелым структурам адгезий катализирует специфическую для интегринов разборку адгезивных соединений. Эти динамические адгезивные взаимодействия утрачиваются в трансформированных клетках и, вероятно, являются ключевым неопластическим изменением...

В данном исследовании мы показали, что Piezo1 выполняет важные функции в динамике фокальной адгезии в нормальных клетках, но не в трансформированных клетках. Нормальные фибробласты, эпителиальные и эндотелиальные клетки на фибронектине образуют фокальные адгезии, где Piezo1 участвует в процессах, зависящих от силы. Время жизни Piezo1 в адгезиdys[ соединениях аналогично времени жизни интегринов и больше, чем у типичных белков адгезии, это предполагает, что он стабильно взаимодействует с белками, связанными с адгезией. Для локализации Piezo1 в адгезиях необходимы постоянные тянущие силы, а когда они ингибируются, он может покинуть адгезивное соединение до диссоциации компонентов адгезии, таких как интегрины и талин. Локализация Piezo1 в фокальных адгезиях приводит к диссоциации интегриновых β3-содержащих адгезий, но не интегриновых β1 адгезий на фибронектине. Эта локализация также теряется в трансформированных клетках, включая трансформированные вирусами соматические клетки (например, HEK293T) и линии опухолевых клеток из различных тканей. Когда соматические клетки трансформируются, как в случае нокдауна TPM 2.1, привлечение Piezo1 к адгезиям заметно снижается, как и в трансформированных раковых линиях. Уровень кальция вблизи структур адгезий выше и имеет гораздо больше локальных колебаний в нормальных клетках по сравнению с трансформированными клетками. Соединение с адгезиями зависит от неструктурированного цитоплазматического домена Piezo1 (аминокислоты с 1418 по 1656). Эти данные свидетельствуют о том, что Piezo1 имеет ряд сложных взаимодействий, которые зависят от сократимости, трансформированного состояния и специфических взаимодействий интегринов с матриксом. Piezo1, по-видимому, имеет множество контекстно-зависимых функций в нормальных и трансформированных клетках, которые необходимо анализировать во временном и пространственном аспектах в определенной механической среде.

Piezo1 был впервые идентифицирован как белок, взаимодействующий с интегрином, который играет роль в формировании адгезии (28). Наши результаты подтверждают эти выводы и указывают на то, что Piezo1 связывается в комплекс с интегринами, а не с белками адгезии, такими как талин или паксиллин, которые имеют гораздо более быструю скорость восстановления после фотообесцвечивания. Более того, ингибирование активности PTP-PEST или экспрессия эффектора Shigella IpaA стабилизирует белки адгезии даже после ингибирования миозина, но не предотвращает диссоциацию Piezo1. Быстрая диссоциация Piezo1 при ингибировании миозина быстро сменяется вымыванием ингибитора миозина. Скорость возвращения к адгезии намного быстрее, чем во время начального формирования адгезии, это указывает на то, что рекрутирование Piezo1 в адгезии может зависеть от белка, чувствительного к тянущей силе, или от активации фермента, зависящего от силы, который удерживается в местах адгезии во время ингибирования миозина. Избыточная экспрессия линкерной области Piezo1 человека (аминокислоты с 1418 по 1656) действует как доминирующий негатив, вытесняя Piezo1 из адгезий, это предполагает, что эта линкерная область Piezo1 содержит взаимодействующий сайт для связывания со структурами адгезии. Отсутствие созревания адгезии после истощения Piezo1 убедительно подтверждает гипотезу о том, что Piezo1 играет важную роль в зависящем от силы созревании структур адгезии на жестких поверхностях, а в трансформированных клетках этого не происходит.

С момента открытия роли Piezo1 как механочувствительного ионного канала в эукариотических клетках, механизм регуляции функции Piezo1 в различных физиологических действиях клеток подвергается интенсивному исследованию (53, 54). Классическая модель физиологической функции Piezo1 предполагает, что он диффундирует в плазматической мембране и активируется локально через натяжение мембранного бислоя или изменения кривизны, которые происходят через цитоскелет-зависимые механические события (26, 34, 38, 49, 55). В нашем исследовании мы систематически изучали пространственное распределение Piezo1 среди многих типов клеток из различных тканей происхождения и обнаружили, что локализация в адгезивных соединениях Piezo1 гораздо более заметна в нетрансформированных нормальных клетках по сравнению с трансформированными клетками, такими как большинство линий опухолевых клеток. Связывание с адгезиями в нормальных клетках катализирует созревание и разборку структур адгезии, что коррелирует с ростом клеток.

В отличие от сниженных кальциевых переходных процессов, которые мы наблюдали в покоящихся трансформированных клетках, мы недавно сообщили, что механические возмущения, такие как растяжение или ультразвуковая обработка, вызывают Piezo1-зависимое увеличение цитоплазматических уровней Ca²⁺ и последующий апоптоз трансформированных, но не нормальных клеток (16). Эти наблюдения трудно объяснить с точки зрения колебаний механических сил в адгезиях или натяжения мембраны, тем более что в трансформированных клетках наблюдается меньшее количество колебаний Ca²⁺ , в то время как в нормальных клетках часто наблюдаются колебания Ca²⁺ вблизи мест адгезии. Что касается натяжения мембраны, то типичные измерения натяжения мембраны в клетках показывают значения, которые на два-три порядка меньше, чем те, которые необходимы для активации Piezo1 in vitro (56, 57). Конечно, характер активации Ca²⁺ в клетках HFF вблизи адгезий согласуется с предыдущими результатами (58-60), но он не соответствует упрощенной модели очень высокого мембранного напряжения для всей клетки. Скорее всего, существуют локальные события активации, в которых участвуют элементы из адгезий, которые могут изменять местное натяжение/кривизну мембраны или ассоциацию мембранных/цитоскелетных белков, которые могут модулировать механическую пропускную способность Piezo1 (55, 61, 62). Хотя Piezo1 проявляется во многих различных механических функциях, механизм активации Piezo1 сложен, и как вклад от натяжения мембраны, так и взаимодействие с цитоскелетными белками могут модулировать его активность (35, 61).

Недавно мы показали, что в трансформированных раковых клетках отсутствуют локальные сократительные единицы, реагирующие на ригидность (22, 45). Существует консервативный набор цитоскелетных белков, которые могут собираться в локальные, чувствительные к ригидности сократительные структуры в нормальных клетках. После истощения любого из нескольких цитоскелетных белков, критически важных для выявления жесткости и сборки сократительной пары, клетка трансформируется и перестает ощущать ригидность субстрата. Трансформация также включает изменения в морфологии и составе структур адгезии (22). Вопрос о различиях в компонентах адгезии в нормальных и трансформированных клетках, которые способствуют фенотипу адгезии, остается открытым, но уровни мРНК более 700 белков изменяются при трансформации путем истощения TPM 2.1. Важной функцией сенсоров ригдности является созревание фокальных адгезий, содержащих Piezo1, а без Piezo1 зрелые адгезии не образуются. Это также согласуется с отсутствием каких-либо различий между адгезиями трансформированных клеток с Piezo1 и без него. Таким образом, мы предполагаем, что в норме как созревание, так и разборка фокальных адгезий катализируются Piezo1. Кроме того, вопрос о том, вызваны ли различия в рекрутировании Piezo1 в трансформированных и соматических клеточных линиях изменениями в молекулярных взаимодействиях или состояниях напряжения этих клеток, остается открытым.

Наша модель функции Piezo1 на рис. 8 подчеркивает каталитическую роль поступления Ca²⁺ в жизненный цикл адгезий в нормальных клетках. Вначале зарождающиеся адгезии запускают формирование актиновых филаментов, биполярные филаменты миозина тянутся за актином при сокращениях, чувствительных к жесткости, и происходит кальций-зависимое расщепление талина1, необходимое для роста (8). Если матрикс ригидный, то адгезии созревают за счет ферментативных модификаций, которые запускают процесс созревания. Компоненты адгезии растягиваются под действием сил тяги и затем могут связывать Piezo1, что позволяет входить Ca²⁺ в цикл положительной обратной связи для дальнейшего созревания адгезии. Однако, когда концентрация Piezo1 достигает порогового значения, происходит чрезмерное поступление Ca²⁺ и привлечение кальпаина, который теперь гидролизует компоненты адгезии, вызывая ее разборку. Процесс созревания требует наличия комплекса жесткость-чувствительности к ригидности и не происходит в трансформированных (раковых) клетках. Эта модель показывает, что для связывания Piezo1 необходима ковалентная модификация компонентов адгезии во время созревания и силы тяги на этих компонентах. Дальнейшее понимание функций Piezo1 требует динамических исследований Piezo1 в соответствующее время и месте во время распространения или миграции клеток.



Fig. 8. Model of Piezo1's regulation in normal and transformed cells.

(Top) In normal cells, Piezo1 is recruited to maturing focal adhesions in a force-dependent manner, where it regulates both the growth and turnover of focal adhesions. (Bottom) In transformed cells, Piezo1's localization is diffusive, and it no longer regulates adhesion morphology, which might contribute to the misregulated calcium signaling observed in cancer cells including stretch-dependent apoptosis (16).

Появляется все больше доказательств того, что ковалентные модификации в созревающих адгезивных соединениях изменяют белки адгезии и, возможно, мембранные белки в нормальных клетках (20, 63). Высвобождение Ca²⁺ вблизи адгезий способствует переработке белков сигнальным центром адгезии, который необходим для созревания адгезии и роста клеток на жестком фибронектиновом матриксе, возможно, через локальный кальпаин-зависимый путь. Наш новый paxillin-ассоциированный кальциевый индикатор показывает, что Piezo1-зависимые кальциевые транзиты намного многочисленнее, чем наблюдаемые с цитоплазматическим кальциевым индикатором. Таким образом, локализация Piezo1 на адгезиях под действием тянущей силы обеспечивает очень локальную активацию кальпаина и других кальций-зависимых ферментов для модификации адгезий и мембранных белков в определенных местах. Помимо Piezo1, в регуляции морфологии, динамики и миграции клеток участвуют и другие ионные каналы, такие как transient receptor potential V4 (TRPV4), Orai1, каналы L-типа Ca²⁺, TRPM4 и TRPM7 (20, 23, 64, 65). Отсутствие взаимозаменяемости этих каналов предполагает, что между ними может существовать кооперативность, например, кальций-зависимое высвобождение кальция (66).

В трансформированных клетках рост, по-видимому, не зависит от локального поступления Ca²⁺ в ригидных участках матрикса, а Piezo1 отделен от сил тяги и сигналов адгезии. Принято считать, что трансформированные клетки связаны с заживлением ран, когда для восстановления необходим рост клеток, а локализованная передача сигналов от матриц не нужна (67). Более того, при многих видах рака повышенная скорость роста коррелирует с высоким уровнем кальпаина, который может усиливать небольшие утечки Ca²⁺ для поддержания активности роста. Это может помочь объяснить, как растяжение может вызвать общие изменения в плазматической мембране, активируя поступление Ca²⁺ через Piezo1 путем локального натяжения или изменения кривизны мембраны, что может привести к апоптотическому процессу (16). Общая активация роста в раковых клетках, по-видимому, происходит без локализованной передачи сигналов Piezo1 в адгезиях. Сохраняются ли наблюдаемые нами закономерности локализации Piezo1 в нормальных и трансформированных клетках в сложном микроокружении опухоли in vivo, требует дальнейшего изучения. Кроме того, поскольку считается, что трансформированное состояние клеток частично приобретает клеточные особенности, такие как воспаление и стволовость, представляет интерес изучение пространственно-временной регуляции Piezo1 в других физиологических и патологических состояниях клеток (68, 69).

В общей картине созревания структур адгезии существует множество белков адгезии, которые связываются с адгезинами в зависимости от силы (70, 71). Однако неожиданно, что ингибирование высвобождения многих белков адгезии путем ингибирования PTPN12 или экспрессии вирулентного бактериального белка IpaA не блокировало высвобождение Piezo1 при ингибировании миозина. Более того, Piezo1 прочно связан с адгезиями и имеет время жизни, сходное с интегрином β3 в адгезиях, зависящих от сократимости. Более прочное удержание Piezo1 в адгезиях при переходе от интегринов β3 к интегринам β1 может способствовать стабилизации этих адгезий для развития более высоких сил на контактах c матриксом за счет постоянного локального притока кальция (72). Зависимость динамики Piezo1 от подтипа интегринов может иметь большое значение для физиологической функции Piezo1, например, в развитии сосудов (4). Мыши с нокаутом Piezo1 погибают в эмбриональном возрасте из-за дефектов сосудов, а инактивация интегринов β3 подавляет процесс ангиогенеза. Механические силы, такие как силы сдвига (shear forces), очень важны в этих процессах (4). Зависимая от силы колокализация и оборот Piezo1 в адгезиях с интегрином β3 может быть синергичным с последующими событиями и обеспечивает механизм зависящего от напряжения роста сосудов, который является критическим в развитии. Таким образом, мы предполагаем, что зависимое от сократительной способности привлечение Piezo1 к фокальным адгезиям является новым механизмом перекрестного взаимодействия между двумя основными механотрансдукционными узлами клетки, играющими критическую роль в функции адгезии, которые утрачены в большинстве опухолевых клеток (рис. 8).