Зародышевые клетки соединяют поколения неограниченно долго, тем самым создавая бессмертную линию. Для выполнения этой задачи передачи между поколениями у животных зародышевая линия обычно отделяется от линий соматических клеток во время раннего эмбриогенеза, что приводит к образованию примордиальных зародышевых клеток (PGCs) (1). Поскольку ранний эмбриогенез происходит в основном в условиях глобальной транскрипционной репрессии, преобладает пост-транскрипционная регуляция материнских транскриптов и пост-трансляционная регуляция материнских белков. Следовательно, развивающийся эмбрион должен освободиться от обучающего груза родительских генных продуктов, пока зиготические генные продукты не возьмут на себя ответственность. Этот переход от материнской к зиготической активности (MZT) представляет собой молекулярную передачу, которая удаляет материнские мРНК и белковые продукты и подготавливает к активации зиготического генома (ZGA) (2). Как этот MZT переход достигается в PGCs, чтобы способствовать бессмертию зародышевой линии, в настоящее время плохо изучено.

В частности, у животных, которые выделяют зародышевую линию путем преформации, происходит задержка MZT в линии, которая ведет к спецификации PGC (2, 3). Инструментом преформации (предваряющих событий) является селективное наследование зародышевой плазмы из ооцитов, которая представляет собой отдельные органеллы, разделенные жидкой фазой (гранулы зародышевой плазмы), в которых хранятся транскрипты мРНК и мРНК-ассоциированные регуляторные белки (1, 4). В соответствии со способностью поддерживать идентичность зародышевых клеток, зародышевая плазма и ее гранулы РНК теряются в соматических линиях, но остаются во всех зародышевых линиях. Тем не менее, некоторые из материнских белковых компонентов, представляющих собой важные пост-транскрипционные регуляторы мРНК, удаляются из PGC до или во время специфической зародышей ZGA во многих системах (5-7), это указывает на потенциальную несовместимость с последующими программами экспрессии зиготических генов. В то время как было выявлено несколько механизмов устранения белков, которые способствуют MZT в соме (5, 8), в PGC они в основном неизвестны. Более того, их влияние на бессмертие зародышевой линии еще предстоит определить для любого организма.

Формирование зародышевой линии у эмбрионов Caenorhabditis elegans представляет собой образцовую модельную систему преформации. Стереотипный каскад из четырех асимметричных клеточных делений отделяет предшественников зародышевой линии (бластомеры P) от сомы (рис. 1, A и B). После того, как в результате гаструляции клетка P4 перемещается во внутреннюю часть эмбриона, два PGC (Z2 и Z3) рождаются в результате симметричного деления клеток примерно на стадии 100 клеток (рис. 1A). Их зародышевая плазма отмечена видоспецифичными белками, такими как PGL (P granule abnormality)-1 (рис. 1, A и B) и, в дополнение к консервативным трансляционным репрессорам, таким как PIE (pharynx and intestine in excess)-1 или NOS (Nanos related)-2 (9-11), также содержит положительно действующие механизмы регуляции мРНК, такие как GLD (defective in germline development)-2 и GLD-3 (рис. 1, A и B). Последние образуют вместе функциональную цитоплазматическую полиаденилат [поли(А)] полимеразу (cytoPAP), которая способствует широкой стабильности мРНК и трансляции специфическим для генов образом (12-14). Поддерживая и удлиняя поли(А) хвосты мРНК в цитоплазме, GLD-2-подобные поли(А) полимеразы противодействуют факторам оборота РНК (т.е. деаденилазам) и трансляционным репрессорам в нескольких моделях животных, включая нематод (15, 16). В отличие от PGL-1, вероятно, общего РНК-связывающего белка, который передается по материнской линии в эмбриональную линию P клеток и постоянно экспрессируется в зародышевой плазме (17, 18), вышеупомянутые важные материнские регуляторы трансляции резко исчезают из PGC до ранней активации генома зародыша между стадиями 100 и ~300 клеток (14, 19) (рис. 1, A и B). Учитывая, что зиготическая реэкспрессия фермента GLD-2 и его стимулирующей субъединицы GLD-3 начинается в ещё недифференцированных половых клетках на ранних личиночных стадиях для содействия постэмбриональному развитию половых клеток (рис. 1А) (14, 20), комплекс cytoPAP служит парадигмой для изучения механизмов, лежащих в основе клиренса посттранскрипционных регуляторов РНК зародышевой плазмы и их влияния на развитие зародышевой линии при возникновении препятствий.

Fig. 1.

Maternal GLD-2 and GLD-3 are degraded in PGCs.

(A and B) Starting from fertilization (Z, zygote), maternal GLD-2 protein is specifically maintained in the germline (P) lineage, marked by the permanent P granule component PGL-1. During later embryonic stages, GLD-2 and its activator, GLD-3, are absent during the ZGA stages of either PGC (Z2 and Z3). Germline development continues postembryonically, and PGCs become dividing germline stem cells (GSCs). Zygotic GLD-2 abundance gradually increases in later larval (L) stages and remains high through late female gametogenesis. (C) Fixed ~100-cell stage wild-type embryos, treated with control RNAi, or targeting 26S proteasome (pas-5), autophagosome (lgg-1), or a RING finger gene (grif-1), stained for DNA [4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)] and indicated proteins, whose given color code corresponds to the respective fluorescent detection channel (see Materials and Methods for further clarification). CytoPAP subunits GLD-2 and GLD-3 are stabilized in PGCs upon pas-5 (96%, n = 118) or grif-1 (100%, n более 100) but not control (100%, n более 90) or lgg-1 (100%, n более 100) knockdown. Merge, all channels. Scale bar, 10 µm.

Здесь мы демонстрируем, что протеасомы, а не аутофагия, регулируют устранение материнского цитоплазматического механизма полиаденилирования GLD-2/GLD-3 в PGCs. Мы идентифицировали с трехсторонним мотивом 32 (TRIM32)-подобную E3-лигазу, GLD-2-interacting RING finger protein 1 (GRIF-1), как специфический для зародышевой линии фактор оборота фермента GLD-2 и продемонстрировали его решающую роль в трансгенерационной передаче. Мы обнаружили, что экспрессия материнского GRIF-1 сама зависит от активности cytoPAP GLD-2 и что GRIF-1 ассоциируется с гранулами зародышевой плазмы до начала оборота GLD-2. Мы представляем доказательства того, что длительная экспрессия GLD-2 cytoPAP в PGCs критически препятствует бессмертию зародышевой линии.

... Материнский GLD-2 способствует эмбриональной экспрессии GRIF-1 До этого исследования GRIF-1 характеризовался как материнский донорский транскрипт, который, вероятно, подвергается посттранскрипционной репрессии и активации (11). Поскольку мРНК grif-1, как сообщалось в одном из глобальных исследований, является потенциальной мишенью GLD-2-опосредованной стабильности или транслируемости мРНК (13), мы проверили идею о том, что GLD-2 может быть важен для материнской экспрессии белка GRIF-1 в P4 и его дочерних PGC.

Чтобы избежать ранней эмбриональной остановки, мы разработали режим RNAi, который частично истощал активность gld-2, и обнаружили у редких эскарионов, что активность GLD-2 необходима для эндогенной экспрессии GRIF-1 (рис. 7A). Более того, трансгенный трансляционный репортер, специфичный для зародышевых клеток, под пост-транскрипционным контролем когнитивной последовательности 3' нетранслируемой области (3'UTR) grif-1 (рис. 7B), повторяет материнскую экспрессию GRIF-1 и зависит от активности GLD-2 (рис. 7, C и D), подтверждая, что GLD-2 сам способствует экспрессии GRIF-1 в зародышевой линии.



Fig. 7. GRIF-1 expression depends on posttranscriptional positive regulation via GLD-2 cytoPAP.

(A) Fixed wild-type embryos of late P lineage stages, treated with low doses of RNAi targeting gld-2, and stained for DNA (DAPI) and indicated proteins. In rare escapers that also have mild gastrulation defects, endogenous GRIF-1 expression is compromised in PGL-1-positive P4 or PGC stages (100%, n = 20). Merge, all channels. Scale bar, 10 µm. (B) Cartoon display of strains harboring a genome-integrated green fluorescent protein (GFP) translational reporter transgene (TG) whose mRNA is transcribed from the germline-specific mex-5 promoter and posttranscriptionally regulated through the grif-1 3'UTR. The ORF of GFP is interrupted by three synthetic introns (not shown) and fused in frame to a histone 2B protein piece. Upon translation, the resulting fusion protein accumulates in the nucleus on chromatin. (C and D) Nomarski images of embryos at different developmental embryonic stages with corresponding autofluorescence of the translational reporter GFP signal (100%, n > 50). Scale bars, 10 µm. (C) Translational GFP reporter expression recapitulates developmental GRIF-1 expression profile. (D) RNAi knockdown compromises translational GFP reporter expression in many gld-2, but not in control, embryos. (E) Working model of GLD-2 cytoPAP-dependent grif-1expression in P4 and early PGCs (steps 1 and 2). GRIF-1-mediated turnover of GLD-2 (step 3) stops this feed forward loop of maternal components also for other maternal-and potentially even zygotic-mRNA targets of GLD-2 cytoPAP. We hypothesize that a potential autoregulatory feedback loop of the presumed TRIM E3 ligase GRIF-1 may cause its elimination once its protein targets might be exhausted (step 4).

Очистка материнского протеома является законсервированной особенностью MZT, но ранее было неясно, как это происходит в PGC и какие последствия это может иметь для продолжения зародышевой линии. В нашем исследовании предложен специфический для материнских половых клеток механизм прямой передачи, который устраняет ферментативный компонент цитоплазматического механизма поли(А), cytoPAP GLD-2, из гранул зародышевой плазмы в PGC (рис. 7E). Первоначально, как пост-транскрипционный активатор материнской мРНК grif-1, GLD-2 cytoPAP непосредственно способствует специфической для половых клеток экспрессии GRIF-1, предполагаемой E3 убиквитин-лигазы типа TRIM. Через свой IDR, специфичный для половых клеток (рис. 3F), GLD-2 привлекает белок GRIF-1, способствуя его UPS-зависимой деградации. По крайней мере, частично, очищая PGC от всесильного комплекса пост-транскрипционных активаторов, активность GRIF-1 помогает MZT в половых клетках обеспечить трансгенерационную фертильность и бессмертие зародышевой линии.

UPS выполняет свою задачу путем избирательного удаления убиквитинированных белков после того, как они были помечены специфическими для мишени убиквитин-лигазами E3 (43). Для поддержки MZT путем быстрой очистки ранних зигот от материнского белкового груза после оплодотворения у животных было выявлено несколько многосубъединичных E3-лигаз (например, комплексы на основе Cullin и С-концевой комплекс гомологии Lis) у беспозвоночных для удаления регуляторов клеточного цикла и пост-транскрипционных репрессоров РНК из соматических линий (5, 25, 44). Известно, что только у мышей ооцитами предоставляемый донорский белок, содержащий домен с одним RING-пальцем (RNF114), способствует MZT, непосредственно поддерживая ZGA в ранних эмбрионах, тем самым убиквитинируя отдельные регуляторы хроматина и транскрипции (45, 46). Наша работа на PGCs у C. elegans расширяет репертуар UPS-мишеней при MZT до белков TRIM, одного из крупнейших подсемейств одиночных RING E3 лигаз (47, 48). В частности, мы обнаружили у GRIF-1, эволюционное сохранение последовательности которого идентифицирует его как родственника TRIM32 млекопитающих, гена, связанного с заболеваниями человека (48).

Принадлежащий к подклассу TRIM-NHL, TRIM32 наделен двойной функциональностью: лигирование убиквитина к белковым субстратам через свой RING-домен и связывание РНК для пост-транскрипционного влияния на судьбы РНК через свой NHL-домен. Примечательно, что эта двойственность не прослеживается в доменной архитектуре GRIF-1, поскольку у него отсутствует домен NHL - универсальная платформа для связывания РНК, состоящая из повторов NHL. И наоборот, некоторые члены семейства белков TRIM-NHL (C. elegans LIN-41 и Drosophila melanogaster Brat и Wech) лишены функциональных RING-доменов (29, 30), что говорит о том, что этот подкласс белков TRIM подвержен эволюционному изменению функциональности. Однако, связываясь с GLD-2 cytoPAP, широко действующим пост-транскрипционным активатором мРНК в зародышевых клетках, GRIF-1 по-прежнему тесно связан с регуляцией РНК, хотя и косвенно, что еще больше усиливает возможную древнюю общую роль этого семейства белков. Более того, устраняя cytoPAP GLD-2, GRIF-1, как ожидается, косвенно дестабилизирует и материнские мРНК, действуя как косвенный пост-транскрипционный репрессор, что согласуется с документированными пост-транскрипционными функциями РНК-репрессоров РНК-связывающих белков TRIM-NHL. Следовательно, древняя прямая связь с негативной РНК-регуляцией могла быть в конечном итоге изменена в пользу специализации оборота белков в случае GRIF-1. Хотя этот сценарий весьма спекулятивен, он также может предложить потенциальную возможность того, как эта только материнская функция GRIF-1 могла быть исключена. Второй путь давления отбора мог возникнуть в связи с ролью GRIF-1 в поддержании трансгенерационной фертильности (см. ниже).

В отличие от многодоменных E3-лигаз, биохимические механизмы переноса убиквитина у белков TRIM представляются более сложными, разнообразными и менее изученными (28, 43). Это также может быть связано с запутанной архитектурой RBCC и различными типами возможных исходов убиквитилирования, осуществляемых TRIM белками (28, 34, 49). Однако общим знаменателем является то, что белки TRIM используют свои RING-домены для катализа лигирования убиквитина и олигомеризуются через свой удлиненный CC-домен; оба эти фактора способствуют связыванию субстрата и переносу убиквитина от E2-конъюгирующих ферментов к мишеням (33, 36). В соответствии с этим представлением, мы обнаружили, что функциональный домен RING finger в GRIF-1 важен для стабильного взаимодействия с GLD-2. Более того, RING-домен GRIF-1 вызывает негативные эффекты на развитие зародышевой линии при эктопической экспрессии в постэмбриональных половых клетках. Хотя одной из причин частично пенетрантной стерильности мог быть низкий уровень экспрессии GRIF-1, она также может отражать ограниченную доступность когнитивного E2-конъюгирующего фермента в этих клетках или физическую недоступность N-концевого IDR GLD-2. В любом случае, GRIF-1 необходим его С-концевой домен CC для связывания с GLD-2 и опосредования клиренса GLD-2 в PGCs. Удаление CC2, как показано на примере GRIF-1(ok1610), негативно сказывается на обороте GLD-2 и бессмертии зародышевой линии. Хотя эти данные согласуются с потенциальной тетрамерной сборкой белков TRIM32 через их CC-домены, способствующие E3-лигазной активности, они также согласуются с вкладом во взаимодействие субстратов (36). Поскольку наши эксперименты не позволяют провести различие между этими возможностями, потребуются дальнейшие детальные биохимические исследования, чтобы получить представление о молекулярных механизмах оборота GLD-2.

На уровне субстратной специфичности мы обнаружили, что GRIF-1 связывается с N-концевым IDR GLD-2. Интересно, что только транскрипты GLD-2 из половых клеток кодируют весь этот IDR полностью; соматические транскрипты кодируют сильно усеченный на N-конце белок GLD-2 (14). Хотя биологические функции соматического GLD-2 неясны, аминокислот с 528 по 923 GLD-2 достаточно для полиаденилирования РНК in vitro (12). Для эффективного выполнения своей молекулярной функции поли(А)-полимеразы GLD-2 должен стимулироваться либо RNP-8, который не передается по материнской линии, либо изоформами GLD-3, которые передаются по материнской линии (20, 50), и оба ферментативных стимулятора GLD-2 cytoPAP связываются взаимоисключающим образом с его центральным каталитическим доменом независимо от IDR GLD-2 (51). В полном соответствии с этими предыдущими результатами мы представили доказательства того, что образуются тримерные комплексы GRIF-1/GLD-2/GLD-3, содержащие различные изоформы GLD-3, и все ферментативные роли GLD-2 могут быть восстановлены с помощью изоформ GLD-2, в которых частично или полностью отсутствуют последовательности IDR. Хотя мы не можем исключить потенциального влияния на ферментативную активность in vivo, наши совместные эксперименты поддерживают идею о том, что весь IDR GLD-2 выполняет важную регуляторную функцию в определении времени дестабилизации cytoPAP во время MZT в PGC, способствуя трансгенерационной фертильности и бессмертию зародышевой линии. Такой длинный IDR может быть особенно подходящим для эффективного привлечения цитозольного GRIF-1, поскольку cytoPAP GLD-2 накапливается в гранулах РНК зародышевой плазмы. С другой стороны, усиленное накопление GRIF-1 в Р-гранулах может увеличить его локальную концентрацию, необходимую для эффективной активности E3-лигазы. Кроме того, мы показали, что при уничтожении GLD-2 происходит деградация GLD-3. Опосредовано ли это также непосредственно активностью E3-лигазы GRIF-1 из-за отсутствия GLD-2 или является следствием других путей оборота белков во время MZT, необходимо изучить в будущем.

Время начала экспрессии GRIF-1 коррелирует со спецификацией зародышевой линии и может отмечать молекулярное начало MZT в материнской зародышевой линии. Мы обнаружили, что начало синтеза белка GRIF-1 ограничено начальным PGC P4 и зависит от GLD-2, посредством пост-транскрипционной регуляторной информации, закодированной в 3'UTR мРНК grif-1. В соответствии с этим, в других исследованиях сообщалось, что мРНК grif-1 поступает в эмбрион по материнской линии, где она, вероятно, подвергается предварительной пост-транскрипционной репрессии, поскольку экспрессия эпитоп-тегированного Y51F10.2 (он же GRIF-1) начинается в P4 (11, 52). Дополнительные крупномасштабные исследования подтверждают положительную экспрессию GRIF-1, опосредованную GLD-2, и сообщают, что более длинный поли(А) хвост мРНК grif-1 в ранней линии P зависит от активности gld-2 (13, 53). Эта пост-транскрипционная регуляция может также зависеть от POS (posterior segregation)-1, материнского мРНК-регулятора, обогащающего линию P (6, 11, 53). Продлевает ли cytoPAP GLD-2 или POS-1 стабильность РНК для последующего обогащения мРНК grif-1 в P4 или способствует также дерепрессии и трансляции мРНК grif-1, необходимо выяснить в дальнейших экспериментах. Независимо от этих механистических деталей, материнская экспрессия GRIF-1 является следствием трансляции de novo, вероятно, зависящей от активности cytoPAP GLD-2. Как часть MZT в PGCs, это приводит в движение механизм feed forward, который прекращает положительно способствующий регуляторный потенциал механизма cytoPAP, унаследованного от матери. Однако вероятны и другие белковые мишени GRIF-1, и можно предположить еще более широкий эффект на MZT. Узкое окно экспрессии GRIF-1 в PGC утверждает, что GRIF-1 является особенно подходящим фактором для продвижения MZT и обеспечения молекулярной перезагрузки для развивающейся зародышевой линии.

GRIF-1 необходим для трансгенерационной фертильности, и его активность предотвращает смертность зародышевой линии. Мы приводим доказательства того, что длительная активность cytoPAP способствует этому явлению, но также вероятно, что другие еще не идентифицированные мишени GRIF-1 могут играть роль в бессмертии зародышевой линии. Это может включать потенциальное перекрестное взаимодействие с другими путями, связанными с РНК, которые предотвращают зародышевую смертность, такими как ядерный RNAi (39), регуляция хроматина с помощью Piwi-взаимодействующего механизма РНК (54, 55) или эндонуклеазная регуляция мРНК (56), и эти вопросы должны быть изучены в будущих исследованиях. Поскольку полиаденилирование является основной функцией cytoPAP, которая обычно стабилизирует мРНК и повышает их трансляционную компетентность (42), наши данные позволяют предположить, что генные регуляторные механизмы цитоплазматического полиаденилирования должны быть остановлены во время MZT в PGC. Можно представить по крайней мере два, взаимно не исключающих, сценария продления способности цитоплазматического полиаденилирования: (i) Длительная активность cytoPAP может либо продлить период полураспада материнского транскриптома, способствуя стерильности зародышевой линии за счет подавления параллельно действующих механизмов распада мРНК (напр, (ii) пердурантность (perdurance ) cytoPAP может также вмешиваться в пост-транскрипционную регуляцию зиготического транскриптома PGC. Хотя о смертельном фенотипе зародышевой линии не сообщалось для NOS-2, известного негативного регулятора материнских мРНК (10), дважды мутантные nos-2;grif-1 (он же Y51F10.2) матери производили стерильное потомство (11), что предполагает, что расширение экспрессии материнской мРНК может вмешиваться в спецификацию PGC. Поскольку о раннем зиготическом транскриптоме PGC у C. elegans пока мало что известно (10), необходимо провести дальнейшие детальные исследования. В любом случае, наше исследование доказывает, что активаторы трансляции несовместимы с независимостью зиготы, и их клиренс должен быть завершен до ZGA.

Поскольку многие другие животные используют ферменты типа GLD-2 для трансляционной регуляции программ экспрессии материнских мРНК генов (57-59), мы рассматриваем клиренс cytoPAP в PGC как потенциально консервативный механизм обеспечения трансгенерационной пригодности у животных, использующих преформацию зародышевой линии. В пользу этого предположения говорит ряд наблюдений над ортологией GLD-2 у дрозофилы, которые показывают, что материнский Wispy, который стабилизирует мРНК зародышевой плазмы для обогащения в PGCs, подвержен протеасомному обороту (5, 60, 61). Участвует ли в этом процессе TRIM-подобный фактор оборота, еще предстоит выяснить.