Слуховая система обладает удивительной способностью распознавать широкий диапазон частот и амплитуд акустических волн путем преобразования колебательной механической энергии в деполяризацию мембранного потенциала с последующей обработкой сигнала в высших мозговых центрах, что позволяет воспринимать звук¹. Дисфункция слуховой системы, вызванная травмой, воздействием окружающей среды или генетической мутацией, связана с возрастной потерей слуха. Нарушение слуха и глухота затрагивают более 460 миллионов человек во всем мире, а ежегодная стоимость не устраненной потери слуха оценивается в 750-790 миллиардов долларов США. Вход в слуховую и тесно связанную с ней вестибулярную систему, как и в другие сенсорные системы, инициируется активацией рецепторов на периферических нейронах. Несмотря на интенсивные исследования в течение нескольких десятилетий, молекулярный состав, структура и механизм работы комплекса механосенсорной трансдукции (МТ), рецепторов для механосенсорной трансдукции, остаются нерешенными.

Множество направлений исследований, начиная с исследований на людях и модельных организмах, включая мышей, рыбок данио и C. elegans, пролили свет на белки, образующие комплекс МТ, и их вероятную роль в его функционировании². К ним относятся белки, связывающие кончики ресничек, протокадхерин-15 и кадхерин-23, которые в волосковых клетках передают силовые воздействия, возникающие при смещении стереоцилий, эффекты на открытие компонента ионного канала комплекса МТ^3,4. TMC-1 и TMC-2 являются вероятными образующими поры субъединицами комплекса МТ, кандидатами, которые впервые стали известны в генетических исследованиях человека⁵, а в последнее время получили распространение в качестве пути ионной проводимости благодаря биофизическим и биохимическим исследованиям^6-8. Дополнительные белки, некоторые из которых могут быть вспомогательными субъединицами, были связаны с биогенезом или функцией комплекса МТ и включают TMIE^9-11, Ca2+ и интегрин 2 связывающий белок, ^12-14 (CIB2), липома HMGIC fusion-like protein 5^15,16,17 (LHFPL5), трансмембранную О-метилтрансферазу^18,19 (TOMT) и, возможно, анкирин¹³.

Выделение комплекса МТ из позвоночных источников или получение функционального комплекса с помощью рекомбинантных методов до сих пор не увенчалось успехом. Очистка комплекса из нативных источников особенно сложна из-за небольшого количества комплексов на животное, которое оценивается приблизительно в 3 х 10⁶ на улитку млекопитающих²⁰, что является небольшим числом по сравнению с количеством фоторецепторов в зрительной системе, которое составляет приблизительно 4 х 10¹⁴ на глаз у мыши²¹. Чтобы преодолеть трудности, связанные с доступностью комплекса МТ у позвоночных, мы обратились к C. elegans, животному, которое использует комплекс МТ для восприятия тактильных стимулов. Прежде всего, отметим, что C. elegans экспрессирует важнейшие компоненты МТ-комплекса позвоночных , включая белки TMC-1 и TMC-2, в дополнение к гомологу CIB2, известному как CALM-1, а также TMIE¹³. Во-вторых, черви, у которых отсутствует TMC-1, демонстрируют ослабленный ответ на легкое прикосновение¹³. В-третьих, несмотря на ограниченную экспрессию белков TMC у C. elegans, возможно вырастить достаточное количество червей, чтобы выделить достаточное количество комплекса для структурных исследований. Поэтому мы модифицировали локус tmc-1 C. elegans, включив в него флуоресцентный репортер и аффинную метку, что позволило нам контролировать экспрессию с помощью флуоресценции всего животного и флуоресцентно-детекторной размерно-исключающей хроматографии (FSEC)²² , а также выделить комплекс TMC-1 с помощью аффинной хроматографии. Вместе с вычислительными исследованиями мы выяснили состав, архитектуру и мембранные взаимодействия комплекса и предложили механизмы стробирования поры ионного канала как путем прямого взаимодействия белков, так и через мембранный бислой.

Мы создали трансгенную линию червей, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая mVenus с меткой 3 х Flag, была вставлена в 3' конец кодирующей последовательности TMC-1, непосредственно перед стоп-кодоном (Дополнительный рис. 1). Сконструированную гомозиготную линию червей (tmc-1::mVenus) мы охарактеризовали с помощью спектральной конфокальной визуализации, выявив флуоресценцию mVenus в нейронах головы и хвоста, стенке тела и вульвальных мышцах (расширенные данные рис. 1a), что согласуется с результатами предыдущих исследований, демонстрирующих экспрессию TMC-1 в этих клетках²³. Комплекс TMC-1 был выделен из трансгенных червей tmc-1::mVenus с помощью аффинной хроматографии и далее очищен с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии (SEC) (расширенные данные рис. 1б). Молекулярная масса комплекса TMC-1, определенная с помощью SEC, составляет ~780 кДа, что позволяет предположить, что комплекс содержит несколько протомеров TMC-1 и, возможно, дополнительные, вспомогательные субъединицы.

Чтобы независимо исследовать олигомерное состояние комплекса, мы провели эксперименты по одномолекулярному захвату (SiMPull)²⁴. Следы фотообесцвечивания захваченных комплексов TMC-1 показывают, что около 62% флуорофоров mVenus обесцвечиваются за два этапа, 37% - за один этап и 1% - за три этапа (расширенные данные рис. 1c-e), что согласуется с выводом о наличии двух копий субъединицы TMC-1 в комплексе TMC-1. Несоответствие между предсказанной молекулярной массой димера TMC-1 C. elegans, равной приблизительно 300 кДа, и молекулярной массой комплекса, оцененной методом SEC, указывает на присутствие вспомогательных белков. Поскольку у червей¹³ и позвоночных животных² было выявлено несколько партнеров по связыванию TMC-1, мы проанализировали состав комплекса TMC-1 с помощью масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрический анализ комплекса TMC-1 выявил три белка, которые совместно очищались с TMC-1: (1) CALM-1, ортолог млекопитающего CIB2; (2) ортолог TMIE; (3) ARRD-6, ортолог млекопитающего семейства белков, содержащих домен арестина (расширенные данные рис. 2). Все три белка были обнаружены в образце TMC-1, очищенном из трансгенных червей, но не в контрольном образце, полученном от червей дикого типа, что свидетельствует об их специфической ассоциации с комплексом TMC-1. Ортологи млекопитающих CIB2 и TMIE, вероятно, являются компонентами комплекса МТ млекопитающих; они локализуются на стереоцилии^9-12,14,25 и связываются с экзогенно экспрессированными фрагментами TMC-1 в анализах pulldown¹⁰. В отличие от этого, ARRD-6 не был описан как компонент комплекса TMC-1 ни у C. elegans, ни у позвоночных. Несмотря на неоднократные попытки, мы не нашли доказательств присутствия UNC-44, червеобразного ортолога анкирина млекопитающих, в отличие от предыдущего сообщения о том, что UNC-44 образует комплекс с CALM-1, необходим для опосредованной TMC-1 механотрансдукции и является "ворочающей пружиной" комплекса TMC-1¹³, что ставит вопрос о роли UNC-44 и, в дальнейшем, анкирина в структуре и функции комплексов МТ у червей и позвоночных, соответственно.

Чтобы выяснить архитектуру и расположение субъединиц в комплексе TMC-1, мы провели одночастичную криоэлектронную микроскопию (крио-ЭМ). TMC-1 экспрессируется на низком уровне у C. elegans, и нам потребовалось около 6 х 10⁷ трансгенных червей, чтобы получить приблизительно 50 нг комплекса TMC-1 для крио-ЭМ анализа. Комплекс TMC-1 был визуализирован на 2 нм решетках с углеродным покрытием, которые были разряжены в присутствии амиламина. Крио-ЭМ визуализация выявила практически идеальное распределение частиц, и мы продолжили сбор данных, состоящих из 26 055 видеороликов. Reference-free реконструкция 3D классификации вместе с уточнениями привела к трем четко определенным классам (расширенные данные рис. 3-5 и расширенные данные табл. 1). Два из этих классов представляют комплекс TMC-1 в различных конформационных состояниях, обозначенных как "расширенная" (E) и "сжатая" (C) конформации, обе из которых имеют общее разрешение 3,1 Å (расширенные данные рис. 3 и 5). Третий класс включает вспомогательную субъединицу ARRD-6 и был определен с разрешением 3,5 Å (расширенные данные рис. 4 и 5). Поскольку конформация Е имеет несколько более выраженные особенности плотности, чем конформация С, мы сосредоточились на конформации Е в нашем первоначальном обсуждении общей структуры.

Комплекс TMC-1 существует в виде димера с двукратной осью вращательной симметрии, сосредоточенной в месте контакта между двумя субъединицами TMC-1 (рис. 1). Трансмембранные спирали демонстрируют лучшее локальное разрешение, чем среднее, в то время как неупорядоченные или динамичные периферийные компоненты комплекса обнаруживаются с меньшим разрешением (рис. 1б). Если смотреть перпендикулярно плоскости мембраны, то комплекс имеет форму восьмерки, причем субъединицы TMC-1 сосредоточены внутри долей восьмерки (рис. 1d). Каждый протомер TMC-1 состоит из десяти трансмембранных спиралей с общим расположением, напоминающим Ca²⁺-активируемую липидную скремблазу (scramblase)^26, TMEM16 Cl^- каналы²⁷ и механочувствительные ионные каналы OSCA^28,29 (расширенные данные рис. 6), в соответствии с предсказанными структурами TMC-1^7,30. На стыке лопастей восьмерки интерфейс димера состоит из замененных доменами трансмембранных спиралей 10 (TM10) (рис. 1e), контакты между которыми определяются ван-дер-Ваальсовыми и электростатическими взаимодействиями, а площадь поверхности, доступной для растворителя, составляет 1 781 Ų. Многочисленные упорядоченные липидные молекулы окружают трансмембранный домен, многие из которых интеркалированы в канавки между трансмембранными спиралями, а некоторые расположены под большим углом к плоскости мембраны.



Fig. 1: Architecture and subunit arrangement of the TMC-1 complex.

a, Schematic representation of protein constructs that co-purified with TMC-1. EF1-EF3, EF-hand domains; TM, transmembrane domain. b, Local resolution map of the native TMC-1 complex after 3D reconstruction. c, Overall architecture of the native TMC-1 complex, viewed parallel to the membrane. TMC-1 (dark blue and light blue), CALM-1 (orange and yellow) and TMIE (red and pink) are shown in a cartoon diagram. Lipid-like molecules, N-glycans and putative ions are coloured black, green, and dark red, respectively. d, Cytosolic view of the reconstructed map fit to the model. Subunit densities are coloured as in c and the detergent micelle is shown in grey. e, A top-down extracellular view of the TMC-1 complex shows the domain-swapped dimeric interface. α-helices are represented as cylinders.

Цитозольный домен, предназначенный для обширных взаимодействий с внутренним листком мембраны, включает шесть спиралей, ориентированных почти параллельно мембране. Две спирали, расположенные ближе всего к внутреннему листку, спираль 3 (H3) и H4, являются амфипатическими, что является общей чертой механочувствительных ионных каналов³¹ (рис. 1c,d). Короткий линкер между TMC-1 H3 и H4 состоит из неполярных остатков, которые взаимодействуют с мембраной внутреннего листка, образуя гидрофобные контакты с ацильными цепями двух липидов. Цитозольный С-конец TMC-1, состоящий примерно из 400 остатков, который, по прогнозам, должен быть частично структурирован, не был виден на карте крио-ЭМ. Поскольку масс-спектрометрический анализ очищенного комплекса МТ выявил девять пептидов, которые охватывали всю С-концевую часть, мы подозреваем, что эта область интактна в комплексе TMC-1, но не видна из-за конформационной гетерогенности (расширенные данные рис. 2).

Три частично структурированные петли украшают внеклеточную сторону комплекса TMC-1. Две из петель имеют длину около 60 остатков, соединяя TM1-TM2 и TM9-TM10, и хорошо сохраняются между TMC-1 позвоночных и C. elegans. Особенности плотности, соответствующие гликозилированию, можно обнаружить на N209, расположенном в петле между ТМ1 и ТМ2. В отличие от этого, примерно из 200 остатков внеклеточная петля, соединяющая ТМ5 и ТМ6, не была обнаружена на крио-ЭМ карте. Мы обнаружили два пептида из этой области при масс-спектрометрическом анализе (расширенные данные рис. 2), что указывает на то, что петля присутствует, но не видна из-за гибкости. Предполагается, что эта область содержит элементы вторичной структуры, а также три предсказанных сайта N-связанного гликозилирования, но ее функция неясна. Петля плохо сохраняется между TMC-1 и TMC-2, а ее длина в TMC-1 позвоночных, составляющая около 50 остатков, значительно короче.

Две дополнительные субъединицы, CALM-1 и TMIE, присутствующие в двух копиях каждая, завершают ансамбль белков, связанных с "ядром" комплекса TMC-1. Качество крио-ЭМ карты позволило однозначно отнести вспомогательные субъединицы CALM-1 и TMIE (рис. 1c) к плотностным характеристикам карты комплекса TMC-1, что согласуется с данными масс-спектрометрии. Субъединицы CALM-1 "захватывают" цитозольные стороны каждого протомера TMC-1, а каждая из двух субъединиц TMIE охватывает мембрану, почти "плавая" на периферии комплекса, фланкируя каждую субъединицу TMC-1. CALM-1 имеет обширные контакты с пятью из шести цитозольных спиралей, образуя "шапку" у основания трансмембранного домена TMC-1. Субъединицы TMIE, напротив, определяют дистальные края комплекса, участвуя лишь в нескольких меж-белковых контактах на внеклеточной и цитозольной границах мембранных областей, но с опосредованными липидами взаимодействиями через трансмембранные области. Если смотреть параллельно мембране и перпендикулярно длинной поверхности комплекса, то расположение субъединиц напоминает аккордеон, где трансмембранные спирали TMIE образуют ручки инструмента, а трансмембранный домен TMC-1 определяет сильфон (рис. 1c).

TMIE является важной субъединицей комплекса МТ позвоночных, необходимой для опосредованной TMC-1 механосенсорной трансдукции в волосковых клетках улитки³² и в сенсорных волосковых клетках рыбок данио¹⁰. Множественные точечные мутации в TMIE связаны с глухотой (расширенные данные рис. 7), а недавние исследования предполагают роль TMIE в локализации TMC-1 и TMC-2 и стробировании каналов^9-11,33-35. Комплекс TMC-1 C. elegans содержит две копии TMIE, расположенные на "внешней" стороне каждого протомера TMC-1 (рис. 2a). TMIE состоит из одного трансмембранного домена, за которым следует "локте-подобный" линкер и цитозольная спираль (рис. 2b). Гибкий, положительно заряженный С-концевой хвост не был виден на крио-ЭМ карте. Взаимодействие между TMIE и TMC-1 опосредуется главным образом цитозольным локтем TMIE, при этом высококонсервативные остатки R49 и R52 образуют водородные связи с карбонильными атомами основы TMC-1 TM6 и TM8, соответственно (рис. 2c,e). Эти остатки аргинина могут быть сопоставлены с известными мутациями глухоты у человека (R81C и R84W), что подчеркивает важность этих водородных связей во взаимодействии TMIE-TMC-1. Гидрофобные контакты между неполярными остатками в локте TMIE и TM6 TMC-1, вероятно, усиливают комплекс. Кроме того, W25 TMIE, расположенный вблизи клеточной границы, контактирует с L228 в петле между ТМ1 и ТМ2 TMC-1 (рис. 2d). Мутация соответствующего остатка у людей (W57) в стоп-кодоне является причиной глухоты³⁶. Мы не наблюдали плотности для N-концевых 17 остатков TMIE на крио-ЭМ карте, и пептиды из этой области не были обнаружены в масс-спектрометрическом анализе, что позволяет предположить, что N-концевой участок содержит расщепленный сигнальный пептид (Дополнительный рис. 2). Секвенирование N-конца рекомбинантно экспрессированного TMIE мыши также согласуется с расщеплением сигнального пептида (Дополнительный рис. 2), как и эксперименты по усечению TMIE10 рыбок данио, что подтверждает гипотезу о том, что у C. elegans первые приблизительно 17 остатков TMIE функционируют как сигнальный пептид.



Fig. 2: TMIE resides on the periphery of the TMC-1 complex.

a, Schematic representation of TMC-1 (blue) and TMIE (red) transmembrane helices highlights the proximity of TMIE to the putative TMC-1 ion-conduction pathway. Palmitoylation of TMIE C44 and phospholipids (PL) is shown in black. b, Overview of the interaction interface between TMIE and TMC-1, viewed from the side. c, The interface between the TMIE 'elbow' and TMC-1. Interacting residues are shown as sticks. d, The interface between TMIE transmembrane helix and TMC-1, highlighting key residues and lipids. Palmitoylation is shown in red and phospholipid is shown in black. e, Multiple sequence alignment of TMIE orthologues. Elements of secondary structure are shown above the sequences and key residues are indicated with black arrows. Residues in black are not conserved, those in red are conservatively substituted, and those in bold red are conserved.

TMIE и TMC-1 образуют внутримембранную полость, которая занята несколькими молекулами детергентов или липидов. Несколько липидов устанавливают гидрофобные контакты с неполярными остатками в TMIE и предполагаемыми поро-образующими спиралями TM6 и TM8 TMC-1, соединяя две субъединицы. В соответствии с наблюдаемой плотностью липидов на картах крио-ЭМ, моделирование молекулярной динамики независимо идентифицирует несколько липидов в этой полости (расширенные данные рис. 10). Примечательно, что С44 TMIE на цитозольной границе трансмембранного домена пальмитоилирован, причем ацильная цепь простирается вдоль ТМ8 TMC-1 (рис. 2d,e). Расположение TMIE вблизи предполагаемой поры TMC-1 и его взаимодействие с липидами предполагает роль TMIE и, возможно, липидов благодаря пропускной способности (стробированию) путем определения натяжения мембраны. Эта идея подтверждается недавними исследованиями в кохлеарных волосковых клетках мыши, которые показали, что TMIE связывается с фосфолипидами и что его ассоциация с липидами важна для механосенсорной трансдукции TMC-111.

CIB2 и его гомолог, CIB3, модулируют активность комплекса MT и связываются с субъединицей TMC-1^12,14. В соответствии с ролью CIB2 и CIB3 в функции канала МТ, мутанты CIB2 связаны с несиндромальной потерей слуха^25,37,38. Наши результаты масс-спектрометрии (расширенные данные, рис. 2) показывают, что CALM-1, ортолог CIB2 у C. elegans, совместно очищается с TMC-1, что соответствует тому, что CALM-1 находится внутри комплекса TMC-1. Осмотр карты комплекса TMC-1 выявляет особенности плотности для двух субъединиц CALM-1 на цитозольных гранях каждого протомера TMC-1. Используя кристаллическую структуру CIB3 в комплексе с пептидом TMC-1¹⁴ , мы подогнали модели CALM-1 к соответствующим характеристикам плотности (рис. 3а). Как и другие белки CIB, CALM-1 имеет три мотива EF-hand, два из которых расположены ближе к С-концу и содержат четко связанные ионы Ca²⁺. После суперпозиции среднеквадратичное отклонение между CALM-1 и CIB3 от пептидного комплекса CIB3-TMC-1 составляет 0,69 Å , и вместе со значительным сходством последовательностей подчеркивает сохранение последовательности и структуры между белками червя и мыши (Дополнительный рис. 3).



Fig. 3: CALM-1 and ARRD-6 auxiliary subunits cap the cytoplasmic face of the TMC-1 complex.

a,b, The binding interface between CALM-1 and TMC-1 viewed parallel to the membrane (a) and perpendicular to the membrane (b). c, Binding interface between CALM-1 and TMC-1 H1-H3. The electrostatic surface of TMC-1 is shown, where blue represents positive regions and red represents negative regions. CALM-1 is shown in yellow. d, The interface between CALM-1 and TMC-1 H5 and H6. e, Salt bridges between the C terminus of CALM-1 and TMC-1. Putative hydrogen bonds are shown as dashed lines. f, Three-dimensional reconstruction of the TMC-1 complex with ARRD-6 viewed parallel to the membrane. TMC-1, CALM-1, TMIE, and ARRD-6 are shown in blue, yellow, red, and green, respectively. The red dashed rectangle indicates the putative insertion site of the ARRD-6 C-edge loop into the micelle. A schematic diagram of ARRD-6 is shown above the reconstruction, with arrestin N- (Arr-N) and C- (Arr-C) domains. g, The interface between the C-edge loop of ARRD-6 and the membrane. ARRD-6 residues that likely participate in membrane interactions are shown as sticks. h, The interface between ARRD-6 (green) and CALM-1 (yellow), highlighting residues that are important for the binding interaction.

Обширные взаимодействия связывают CALM-1 и TMC-1 вместе, вовлекая площадь погребенной поверхности около 2 903 Ų и предполагая, что CALM-1 может связываться с TMC-1 с высокой аффинностью (рис. 3a). Три отдельные области CALM-1 взаимодействуют с цитозольными спиралями TMC-1, первая из которых включает спирали H1 - H3 TMC-1, ориентированные как "лопасти" почти параллельно мембране (рис. 3б,в). Значительные взаимодействия обнаруживают боковые цепи в петле между H1 и H2, которые образуют гидрофобные контакты с CALM-1, а также кислотные остатки на CALM-1, которые создают отрицательно заряженную поверхность, сопоставленную с дополнительной положительно заряженной поверхностью на лопасти H1-H3 (рис. 3c). Второй интерфейс связывания проходит через гидрофобный карман CALM-1, состоящий из его мотивов EF-hand, и цитозольных спиралей H5-H6 TMC-1 (рис. 3г), что напоминает структуру пептида CIB3-TMC-1. Алифатические и ароматические остатки, включая L308, F309 и Y314 TMC-1, прикрепляются к консервативному гидрофобному ядру в CALM-1, дополнительно стабилизируя комплекс путем захоронения значительной площади неполярной поверхности. Наконец, аминокислоты D192, R195 и R200 на С-конце CALM-1 взаимодействуют с R780, D313 и E160 TMC-1, соответственно, образуя консервативные солевые мостики через внедренную в ткань короткую спираль (191-197) CALM-1 (рис. 3e). Этот интерфейс показывает, что CALM-1 непосредственно взаимодействует с трансмембранными спиралями TMC-1 через петлю между TM8 и TM9 и, таким образом, может модулировать функцию ионного канала.

Множественные миссенс-мутации CIB2 или TMC-1 человека связаны с несиндромальной потерей слуха, поскольку они либо препятствуют взаимодействию между TMC-1 и CIB2, либо снижают склонность CIB2¹⁴ к связыванию Ca²⁺. Некоторые из этих остатков, E178D из TMC-1 человека и E64D, F91S, Y115C, I123T и R186W из CIB2, структурно консервативны в комплексе TMC-1 и CALM-1 C. elegans (Дополнительный рис. 3). Наша структура показывает близость сайтов связывания CALM-1 Ca2+ к интерфейсу CALM-1 и TMC-1, подчеркивая тем самым роль Ca²⁺ и CALM-1 в формировании конформации TMC-1 и, экстраполируя ее, обеспечивая структурное понимание CIB2 в функции волосковой клетки.

Масс-спектрометрический анализ комплекса TMC-1 показал присутствие растворимого белка ARRD-6. После классификации данных крио-ЭМ, полученных с помощью одной частицы, мы обнаружили non-two-fold симметричный 3D класс, определяемый удлиненной плотностью, выступающей из вспомогательной субъединицы CALM-1, и предположили, что он соответствует ARRD-6. Арестины состоят из N-домена и С-домена, каждый из которых состоит из β-сэндвич мотивов, которые вместе дают белок с вытянутой, похожей на фасоль формой. Мы подогнали предсказанную структуру ARRD-6 к соответствующим характеристикам плотности, и хотя локальное разрешение области ARRD-6 ниже, чем у центральной области комплекса, подгонка дала общие коэффициенты корреляции 0,69 (щит (mask)) и 0,65 (объем) (расширенные данные рис. 5). Более того, особенности плотности для ARRD-6 β-листов четко наблюдаются на интерфейсе связывания с CALM-1, а также для скрещенных вытянутых петель N и C доменов на центральном гребне, что дополнительно подтверждает отнесение особенностей плотности к ARRD-6. Мы наблюдали структуру "петля С-края", расположенную на дистальном краю β-нитей в С-домене, которая функционирует как мембранный якорь и необходима для активации аррестина³⁹ (рис. 3f,g). Петля С-края ARRD-6 включает W197 и несколько остатков цистеина (рис. 3g), последний из которых может быть пальмитоилирован и, таким образом, предназначен для закрепления на мембране⁴⁰. Дополнительные контакты между CALM-1 и ARRD-6 включают петлю CALM-1 (P51-K67) с β-нитями в С-домене ARRD-6 (рис. 3h). Структурное выравнивание показывает, что конформация TMC-1 в комплексе ARRD-6 наиболее похожа на конформацию E. Роль аррестина в функционировании канала TMC C. elegans и комплекса TMC-1 позвоночных остается неизвестной. Мы предполагаем, что ARRD-6 может играть регуляторную роль в функции канала TMC-1 или участвовать в эндоцитозе комплекса TMC-1 путем рекрутирования белков цитоскелета, подобно роли аррестина в регуляции G-белок-связанных рецепторов⁴¹. На данный момент мы не знаем, почему мы наблюдали только одну субъединицу ARRD-6, связанную с комплексом, так как в нем достаточно места для двух. Возможно, одна субъединица не связана с комплексом или вторая субъединица занята лишь частично. Для ответа на эти вопросы необходимы дальнейшие эксперименты.

Одноканальные токи, измеренные в волосковых клетках слуховой улитки, показывают, что МТ-комплекс млекопитающих является катион-селективным⁴² с высокой проницаемостью для Ca²⁺. TMC-1 или TMC-2, вероятно, являются поро-образующими субъединицами МТ-комплекса млекопитающих, а эксперименты по мутагенезу цистеина выявили несколько остатков, закрывающих поры, которые являются критическими для TMC-1-опосредованной механосенсорной трансдукции^6,7 (расширенные данные рис. 7a). TMC-1 C. elegans опосредует механосенсорную чувствительность в нейронах OLQ червя и мышцах стенки тела¹³, но его ионная избирательность и проникающие свойства неизвестны, в основном из-за проблем, связанных с гетерологичной экспрессией рекомбинантного комплекса и исчезающе малым количеством нативного материала. Примечательно, что TMC-1 C. elegans и мыши также функционируют как Na+-проницаемые каналы для утечки, которые модулируют потенциал покоя мембраны посредством деполяризующей фоновой проводимости утечки, что позволяет предположить, что TMC-1 может выполнять множество клеточных функций^23,43 и указывает на то, что поры канала проницаемы для большего разнообразия ионов, чем считалось ранее.

Чтобы получить представление о природе и функции ион-проводящего пути TMC-1 C. elegans, мы наложили субъединицу TMC-1 на структуры TMEM16A и OSCA1.2, выявив сходную архитектуру трансмембранных доменов (расширенные данные рис. 6). Димеры TMEM16A и OSCA1.2 содержат две поры - по одной в каждой субъединице - которые определяются спиралями TM3-TM7. Структурное сходство между TMEM16a и OSCA1.2 позволяет предположить, что TMC-1 также имеет две поры и может проводить ионы через структурно аналогичный путь, состоящий из TM4-TM8 (рис. 4a). Предполагаемый путь ионной проводимости представляется закрытым, с узкой порой, блокированной тремя сужениями (рис. 4б,в). Полярные и базовые остатки образуют первый участок сужения вблизи входа во внеклеточную пору, а неполярные остатки доминируют во втором участке сужения, расположенном примерно на 20 Å дальше по пути проводимости, в направлении цитоплазмы. Расположение второго сайта сужения хорошо согласуется с узкой "шейной" областью предполагаемой поры OSCA1.2, которая состоит в основном из гидрофобных остатков, а также с гидрофобными воротами TMEM16a^28,44. Оставшиеся 40 Å проводящего пути выстланы в основном полярными и заряженными остатками (рис. 4d). Семь основных остатков выстраиваются вдоль поры, два из которых (H404 и H731) частично определяют третий и самый узкий участок сужения. Эксперименты по цистеиновому мутагенезу выявили восемь остатков, выстилающих поры в TMC-17 мыши,⁴⁵ и, хотя пять из этих остатков не являются консервативными у C. elegans, расположение всех восьми совпадает с позициями выстилающих пору в TMC-1 C. elegans (расширенные данные рис. 7a), что подтверждает их местоположение в пути ионной проводимости. Мы визуализировали две сферические небелковые плотности вблизи двух кислотных остатков (D683 и D695), которые могут соответствовать связанным катионам (рис. 4b). Однако при нынешнем разрешении структуры мы не можем определить, являются ли эти особенности ионами Ca²⁺. Оба остатка аспарагина являются консервативными в TMC-1 человека, что позволяет предположить, что они важны для координации ионов. Хотя ионизируемые остатки, выстилающие закрытую пору, являются преимущественно основными (щелочными) и, таким образом, не соответствуют каноническому Ca²⁺-проницаемому каналу, который обычно содержит кислые остатки, остается неизвестным, какие остатки выстраивают путь проницаемости в открытой конформации. Кроме того, общий состав остатков похож на состав механочувствительного ионного канала OSCA1.2²⁸. OSCA1.2 демонстрирует активируемые растяжением неселективные катионные токи с 17-21% Cl^- проницаемостью⁴⁶ , что позволяет предположить, что TMC-1 C. elegans может обладать аналогичными свойствами проницаемости.



Fig. 4: The putative ion-conduction pore of TMC-1.

a, The location of the pore (gold mesh) is shown in the context of the TMC-1 complex. Putative calcium ions are shown as red spheres. b, An expanded view of the ion permeation pathway, highlighting pore-lining residues, shown as sticks, and putative ions (red). c, van der Waals radius of the pore plotted against the distance along the pore axis, calculated by MOLE 2.0. d, The electrostatic potential of pore-lining residues is depicted in different colours: grey, nonpolar; yellow, polar; red, acidic; and blue, basic. Acidic and basic residues are labelled. e, Multiple sequence alignment of selected residues from TMC-1 putative pore-forming helices.

Для визуализации поры ионной проводимости комплекса МТ позвоночных мы использовали структуру комплекса C. elegans и построили гомологическую модель комплекса TMC-1 человека, включающую TMC-1, CIB2 и TMIE (рис. 8 расширенных данных). При изучении этой структуры мы обнаружили, что предполагаемая пора выстлана двумя основными и пятью кислыми остатками, что соответствует тому, что канал проницаем для Ca²⁺. Кроме того, здесь относительно больше полярных остатков по сравнению с ортологом червя, а гистидиновые остатки, которые закрывают второе место сужения у C. elegans в TMC-1, заменены на M418 и A579 в человеческой модели. Комплекс МТ позвоночных также наделяет волосковые клетки проницаемостью для органических молекул, включая краситель FM1-43 ⁴⁷. Хотя наша структура не дает прямого представления о путях проникновения малых молекул, несколько гидрофобных щелей, включая липидное пространство между TMC-1 и TMIE, обеспечивают возможные пути для трансмембранного прохождения малых молекул, таких как FM1-43.

Мы наблюдали вторую конформацию комплекса TMC-1 по 3D классификации, обозначенную как С-конформация (расширенные данные рис. 9). Субъединицы TMC-1 в конформациях E и C имеют схожую общую структуру, обе включают закрытые ионные каналы. Однако в конформации С спираль ТМ10 изогнута примерно на 9° по сравнению с конформацией Е, и в конформации Е имеется один дополнительный виток спирали ТМ10. При последовательном наложении субъединиц TMC-1 из комплексов C и E мы наблюдали, что в состоянии E каждая половина комплекса TMC-1, состоящего из субъединиц TMC-1, CALM-1 и TMIE, повернута примерно на 8° по сравнению с состоянием C, посредством оси вращения, которая расположена вблизи спиралей TMC-1 H7 и H8 и ориентирована примерно параллельно мембране. Движение каждой половины комплекса - если смотреть параллельно плоскости мембраны - таким образом, напоминает движение аккордеона, причем цитоплазматические области комплекса претерпевают относительно большие конформационные смещения по сравнению с областями на внеклеточной стороне мембраны. Действительно, при сравнении состояний С и Е амфипатические спирали TMC-1 H3 сдвигаются друг от друга примерно на 11 Å , что подчеркивает величину конформационных изменений. Как описано ниже, эти изменения сопровождаются значительными изменениями в структуре и механическом поведении мембраны, окружающей белок (расширенные данные рис. 9). Однако для определения их влияния на функцию комплекса МТ потребуются дальнейшие исследования. Тем не менее, эти результаты иллюстрируют конформационную пластичность комплекса TMC-1 и, соответственно, возможность того, что деформации мембраны могут вызывать конформационные изменения в комплексе TMC-1..

Чтобы понять, как комплекс TMC-1 взаимодействует с отдельными липидами, а также с липидным бислоем, мы провели полноатомное и крупнозернистое моделирование молекулярной динамики для комплексов E и C, встроенных в мембраны, состоящие из фосфолипидов и холестерина (расширенные данные рис. 10а). Полноатомный набор включал три независимых моделирования для каждого конформационного состояния белка, что дало время коллективной выборки 6 µs, в то время как крупнозернистые прогоны были выполнены на более крупных мембранных участках, каждый из которых включал четыре копии TMC-1 в E или C конформациях (расширенные данные рис. 10a), и каждый моделировался в течение 10 µs, что дало время коллективной выборки липид-белковых взаимодействий 80 µs. Изучение структуры равновесной мембраны вокруг комплекса TMC-1 указывает на глубокое проникновение и закрепление амфипатической, лопастной спирали H3 в цитозольном листке бислоя (рис. 5a,b). В согласии с картами плотности крио-ЭМ, моделирование показывает, что фосфолипиды и холестерин занимают полость между TMIE и TMC-1, а холестерин обогащен в щелях около связанных двукратной симметрией спиралей TM10 на интерфейсе субъединицы TMC-1, что подтверждает важность липидов в структуре и функции комплекса (расширенные данные рис. 10b,c). Комплекс TMC-1 также искажает мембранный бислой, способствуя как истончению, так и утолщению мембраны вблизи него, с особенно заметным истончением цитоплазматической створки в области вставки спирали H3 (рис. 5c и расширенные данные рис. 10d). Следует отметить, что конформации E и C генерируют различные модели деформации мембраны (рис. 5c и расширенные данные рис. 9b и 10d,e). В частности, конформация E вызывает более выраженное искажение мембраны (утолщение и истончение) вблизи белка, что приводит к распространению деформации мембраны на большие расстояния (около 50 Å от белка) (расширенные данные рис. 10d,e).



Fig. 5: Membrane integration and mechanism. a, Molecular dynamics simulation of the membrane-embedded TMC-1 complex (E conformation) shows penetration of the H3 helix into the lipid bilayer. b, Key residues that define the amphipathic nature of the H3 helix are shown as sticks. c, Thickness patterns for extracellular and cytosolic membrane leaflets averaged over the last 500 ns of three simulated replicas for the E conformation. The pattern for the C conformation is shown in Extended Data Fig. 8. The cross-section of the protein is shown in blue and the location of the cross-section is indicated above the plots using a surface representation of the TMC-1 complex. d, Schematic illustrating mechanisms by which direct or indirect forces might be transduced to ion channel gating. Grey arrows (right) show how membrane tension could directly gate the TMC-1 complex by exerting force on TMIE. Indirect force as a result of changes in membrane thickness could affect the position of the membrane-embedded helix H3, modulating ion channel gating.

Молекулярные структуры комплекса TMC-1 раскрывают идентичность, архитектуру и мембранную ассоциацию ключевых субъединиц, играющих центральную роль в механосенсорной трансдукции позвоночных и C. elegans. Двукратно симметричный комплекс в форме гармошки содержит субъединицы TMIE, расположенные как ручки перпендикулярно мембране, и амфипатические спирали TMC-1 H3, вставленные и параллельные плоскости мембраны, каждая из которых обеспечивает возможные механизмы прямой или косвенной передачи силы на передающую способность ионного канала, соответственно. Взаимодействие между TMIE и TMC-1 ограничено внеклеточной и внутриклеточной границами TMIE TM1, что приводит к образованию большой внутри-мембранной полости между двумя субъединицами, которая, как мы предполагаем, заполнена молекулами липидов в среде плазматической мембраны. TMIE располагается ближе к предполагаемым поро-образующим спиралям TM4-8 (рис. 2a), взаимодействуя непосредственно с TMC-1 TM6 и TM8 посредством водородных связей и через пальмитоильную группу, присоединенную к остатку C44 TMIE. Расположение субъединиц напоминает аккордеон, причем TMIE образует ручки инструмента. Мы предполагаем, что сила, приложенная к TMIE, либо через мембрану, либо путем прямого контакта со вспомогательной субъединицей, затем соединяется с образующими пору TMC-1 транс-мембранными спиралями, открывая пору для проникновения ионов.

У позвоночных протокадхерин-15 передает усилие на кончики стереоцилий, открывая канал МТ. Предыдущие исследования показали, что протокадхерин-15 образует стабильный димерный комплекс с LHFPL5, а также взаимодействует с субъединицами TMC-1 и TMIE^{9,15,17,48,49}, но как это взаимодействие может происходить, остается неизвестным. Одна из возможностей заключается в том, что димер протокадерина-15 располагается параллельно двукратной оси комплекса TMC-1, при этом трансмембранные спирали прокадерина-15 окружают спирали TM10 TMC-1. Этот закрытый симметричный димерный комплекс позволяет натяжению протокадхерина-15 непосредственно передаваться на комплекс TMC-1 через контакты протокадхерина-15 с ТМ10 спиралями. В качестве альтернативы, димеры протокадхерина-15 могут взаимодействовать с TMIE спиралями, при этом одна субъединица протокадхерина взаимодействует с одной субъединицей TMIE, образуя открытый комплекс, в котором непарная субъединица протокадхерина-15 может взаимодействовать с субъединицей TMIE из другого комплекса TMC-1 (рис. 5d). Эта модель обеспечивает прямой механизм передачи силы от протокадхерина-15 к TMIE и затем к поре ионного канала TMC-1, а также механизм кластеризации комплексов TMC-1⁵⁰. Помимо прямой передачи силы, мы также предполагаем, что H3 субъединицы TMC-1 действует как весло в мембране, которое перемещается вверх или вниз по мере истончения или утолщения мембраны, обеспечивая тем самым механизм связи силы с каналом через мембрану. Для более полного выяснения механизмов передачи силы потребуются дальнейшие исследования конформаций открытого канала комплекса TMC-1 C. elegans, в дополнение к структурам комплекса MT позвоночных. Тем не менее, эти комплексы TMC-1 обеспечивают основу для структурно обоснованных механизмов осязания у C. elegans, слуха и равновесия у позвоночных.