Клеточная компартментализация является фундаментальной особенностью эукариотических клеток, которая позволяет им организовывать биохимические реакции и создавать функциональные специализации⁴. Нейроны, в частности, сильно компартментизированы на отдельные аксональные и дендритные домены плазматической мембраны. Чтобы достичь такой компартментализации, нейроны должны сортировать и транспортировать тысячи белков в каждый домен и поддерживать их поляризованное распределение на протяжении всей жизни нейрона¹. Эта экстремальная поляризация лежит в основе функции нейронов, а потеря полярности нейронов связана с неврологической дисфункцией и нейродегенеративными заболеваниями^5-7.

Критической областью для полярности нейронов является AIS, специализированная пограничная зона, разделяющая аксональный и сомато-дендритный домены^2,8. Молекулярно AIS определяется ankyrinG, главным организатором AIS, и плотной субмембранной цитоскелетной сетью^9,10. Известные в настоящее время функции AIS в полярности нейронов делятся на две общие категории: (1) внутриклеточная сортировка, регулирующая транспорт везикул^3,11-18, и (2) диффузионный барьер для замедления движения аксональных и дендритных белков на плазматической мембране^19-21. Однако механизмы, с помощью которых AIS поддерживает строгую компартментализацию трансмембранных белков между смежными аксональной и дендритной плазматическими мембранами нейрона, остаются нерешенными. Здесь мы описываем отдельный и активный механизм, посредством которого поляризованные трансмембранные белки удаляются из плазматической мембраны AIS путем эндоцитоза и деградируют для поддержания их аксональной или дендритной компартментализации. Мы обнаружили, что эндоцитарный клиренс поляризованных рецепторов с мембраны AIS консервативен и используется различными поляризованными рецепторами.

Для изучения функции AIS в полярности нейронов мы выбрали сенсорный нейрон PVD C. elegans в качестве модели in vivo для изучения полярности нейронов с разрешением на уровне одиночной клетки у живых животных. Нейрон PVD исключительно поляризован и имеет сильно разветвленный дендрит и, в отличие от него, единственный неразветвленный аксон (рис. 1a,b). Мы использовали этот нейрон для выявления признаков AIS в нейронах C. elegans. Геном C. elegans кодирует консервативный ген ankyrin^22,23 (unc-44). Однако, существует ли AIS в нейронах C. elegans, остается неясным из-за трудностей в определении субклеточной локализации белка UNC-44. Чтобы преодолеть эти технические трудности, мы использовали стратегию клеточно-специфического мечения с помощью flippase (FLP) (Расширенные данные рис. 1a) для эндогенного мечения UNC-44 с GFP в нейроне PVD. Мы обнаружили, что как средняя, так и длинная изоформы UNC-44 обогащены на проксимальном конце аксона PVD (рис. 1c и расширенные данные рис. 1b,c). Кроме того, белок, связывающий минус-концы микротрубочек, patronin-1 (ортолог CAMSAP), в основном отсутствовал в обогащенной UNC-44 области нейрона PVD (рис. 1d,e), что согласуется с наблюдениями AIS в нейронах позвоночных²⁴. Таким образом, нейрон PVD имеет молекулярные признаки AIS позвоночных после последнего дендритного ответвления и до того, как аксон входит в вентральный нервный шнур (рис. 1f). Мы также обнаружили признаки AIS в других нейронах C. elegans, таких как биполярный моторный нейрон DA9, который имеет обогащение UNC-44 на проксимальном конце своего аксона (рис. 1a и расширенные данные рис. 1d,e).



Fig. 1: An in vivo intact animal system to study AIS functionig1 in neuronal polarity.

a, Schematic of C. elegans PVD and DA9 neurons. 1°, primary; 4°, quaternary. b, Localization of the myristoylated GFP membrane marker in the wild-type PVD neuron. Scale bar, 50 µm. c, Cell-specific endogenous labelling of the long isoform of UNC-44 (UNC-44L-FLPon-GFP) using flippase-mediated recombination. Scale bar, 5 µm. d, Patronin-1-tdTomato localization in the PVD neuron. Scale bar, 10 µm. ^e, Quantification of UNC-44L and patronin-1 in PVD neuronal domains. AU, arbitrary units. f, Schematic of PVD neuronal domains. g, Rat NF-186 localization in the PVD neuron. Scale bar, 5 µm. h, Rat NF-186(FIGQD) localization in the PVD neuron. Scale bar, 5 µm. i, Average fluorescence of rat wild-type and mutant NF-186 proteins in PVD neuronal domains. j, Localization of a myristoylated GFP membrane marker of the PVD neuron in dma-1(lof) C. elegans animals. Scale bar, 50 µm. k,l, Cell-specific endogenous labelling (k) and polarity index (l) of DMA-1-FLPon-GFP in C. elegans animals. Scale bar, 10 µm. m,n, The axonal region of C. elegans animals expressing endogenous (m) or overexpressed (n) DMA-1-GFP. The same imaging conditions and formatting were used in both panels. Scale bars, 5 µm. Red arrows indicate aberrant axonal branches. o, Mean normalized GFP fluorescence in the axon of C. elegans animals described in m,n. p, Escape behaviour in C. elegans animals in response to a harsh touch stimulus. C. elegans animals carrying mutations in degt-1 and mec-3, which encode a DEG/ENaC channel and a homeobox transcription factor that controls the differentiation of touch receptor neurons, respectively, were included as control animals with known behavioural defects. Data are shown as mean ± s.e.m. n represents the number of individual animals. e,i One-way ANOVA with Dunnett's test. o, Two-tailed unpaired t-test with Welch's correction. p, Two-tailed unpaired t-test.

Чтобы проверить молекулярную консервацию архитектуры AIS C. elegans, мы экспрессировали крысиную изоформу нейрофасцина-186 (NF-186), белка-резидента AIS, который обогащается в AIS через FIGQY анкиринG-связывающий мотив^9,25,26. Мы обнаружили, что NF-186 крысы дикого типа обогащен в AIS нейрона PVD, тогда как мутантная версия NF-186, которая не связывает анкиринG²⁵ (NF-186(FIGQD)), не обогащена в AIS (рис. 1g-i). Мы также обнаружили функциональные доказательства того, что AIS является одновременно фильтром внутриклеточных везикул и диффузионным барьером, изучив везикулярный трафик и динамику мембранных белков, соответственно, в дендрите по сравнению с AIS (расширенные данные рис. 1f-i и дополнительные видео 1 и 2). На основании этих результатов мы считаем сегмент аксона, ограниченный последней дендритной ветвью и точкой входа в вентральный нервный шнур, является настоящим AIS с консервативными молекулярными компонентами и аналогичными функциями, как и в системах позвоночных (рис. 1f).

Установив, что нейроны C. elegans имеют AIS, мы изучили его роль в становлении и поддержании полярности нейронов. Сначала мы сосредоточились на компартментализации трансмембранного рецептора DMA-1, поскольку он играет ключевую роль в установлении морфологической полярности, опосредуя обширное дендритное ветвление нейрона PVD²⁷ (рис. 1j и расширенные данные рис. 1j). Для изучения компартментализации DMA-1 мы использовали одноклеточное эндогенное мечение DMA-1 в интактном животном C. elegans. В соответствии с функцией ветвления, эндогенный DMA-1 был сильно поляризован на дендрит и исключен из аксона (рис. 1k-m). Однако избыточная экспрессия DMA-1 увеличивала его флуоресценцию в дендрите, как и ожидалось, но также вызывала проникновение DMA-1 в аксон (рис. 1n). Неправильная локализация DMA-1 в аксоне вызвала аберрантное ветвление аксона, которое зависело от тех же лигандов, которые активируют DMA-1 в дендрите, демонстрируя, что потеря молекулярной полярности DMA-1 вызывает дефекты морфологической полярности в нейроне PVD (расширенные данные рис. 1j,k). Таким образом, механизмы, контролирующие компартментализацию DMA-1, легко преодолеваются его с избыточной экспрессией.

Далее мы исследовали роль известных белков в функционировании AIS. Мутация с потерей функции в UNC-44, большой каркасной молекуле AIS, необходимой для полярности нейронов²⁸ , привела к полной потере полярности DMA-1 в дендритах и вызвала образование аберрантных аксональных ветвей, которые зависели от DMA-1 (расширенные данные рис. 1l-o). Актин филамент и не-мышечный миозин Va в AIS важны для поддержания полярности нейронов^14,29,30. Соответственно, мутации с потерей функции в gex-3, в компоненте комплекса WAVE, который опосредует разветвленный филаментный актин³¹, и hum-2, ортологе миозина Va, который опосредует везикулярный трафик в AIS^14,29,30, привели к частичной потере полярности DMA-1 в дендритах (расширенные данные рис. 1p,q). Затем мы изучили поведенческие последствия потери полярности, используя поведенческий тест на избегание резкого прикосновения, который позволяет судить о функции нейронов PVD³². Мы обнаружили, что избыточная экспрессия DMA-1, вызывающая неправильную локализацию DMA-1 в аксоне и аберрантные аксональные ветви (рис. 1n,o), также связана с поведенческим дефицитом в ответ на резкое прикосновение, что свидетельствует о потере клеточной функции (рис. 1p). Таким образом, строгая дендритная поляризация DMA-1 является критической для правильного функционирования нейронов.

Эндогенный DMA-1 был сильно поляризован по отношению к дендриту и локализован в многочисленных местах в дендрите и AIS (рис. 1k, l и 2a). Это наблюдение побудило нас изучить механизмы компартментализации DMA-1. Сначала мы исследовали свойства пунктов DMA-1 с помощью восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Мы предположили, что DMA-1 во внутриклеточных везикулах будет иметь другие профили восстановления по сравнению с DMA-1 на плазматической мембране, который может восстанавливаться за счет латеральной диффузии на прилегающей плазматической мембране. Действительно, мы обнаружили доказательства существования двух пулов DMA-1 с различной динамикой: пул без пор (non-punctate) и пул с порами (punctate) с большей неподвижной фракцией по сравнению с пулом без пор (расширенные данные рис. 2a-c). Таким образом, punctate пул DMA-1, вероятно, представляет собой внутриклеточные везикулы, которые не способны восстанавливаться из-за того, что находятся преимущественно в изолированных везикулах.

Fig. 2: Endocytosis of dendritically polarized receptors in the AIS. ..

Затем мы попытались определить происхождение дендритных белок-содержащих везикул, которые присутствовали в AIS... Таким образом, в AIS содержался пул DMA-1, который в настоящее время или ранее находился на плазматической мембране до включения в эндолизосомную систему и не может быть объяснен только биосинтетическим путем.

Исходя из доминирующего пула точек, содержащих DMA-1 на клеточной поверхности в AIS, и наблюдения, что точки DMA-1 редко проходят через AIS (расширенные данные рис. 1f,g), мы рассмотрели вопрос о том, образуются ли дендритные белок-содержащие везикулы в самой AIS путем эндоцитоза. Мы провели серию экспериментов для изучения эндоцитоза DMA-1 в AIS. Сначала мы обнаружили, что легкая цепь клатрина (CLIC-1), белок оболочки ямок, покрытых клатрином, и адаптерный белок-2 (AP-2 (называемый APA-2 у C. elegans)), клатрин-ассоциированный эндоцитарный адаптерный белок³³ , оба образовывали дифракционно ограниченные точки в AIS (рис. 2e,f и расширенные данные рис. 2e). CLIC-1 также присутствовал на крупных структурах в теле клетки, которые перекрывались с маркером сети Гольджи AMAN-2, а AP-2 ко-локализовался с маркером синаптических везикул RAB-3 в аксоне, что соответствует их известным функциям в Гольджи и пре-синаптических окончаниях, соответственно^34,35 (расширенные данные рис. 2f-k). Мы также обнаружили точки CLIC-1 в AIS двигательного нейрона C. elegans DA9 (расширенные данные рис. 2l). В соответствии с нашими результатами световой микроскопии, ямки, покрытые клатрином, были обнаружены в электронно-микроскопических исследованиях AIS³⁶, а AP-2 был обнаружен в AIS с помощью масс-спектрометрии с бесконтактной меткой¹⁸.

Несколько линий доказательств показывают, что точки CLIC-1 являются функциональными структурами эндоцитоза, покрытыми клатрином. Во-первых, они были мечены dynamin-1, ГТФазой, которая отщепляет эндоцитарные везикулы от плазматической мембраны (расширенные данные рис. 2m). Кроме того, интенсивность точек CLIC-1 оказывалась увеличена у температурно-чувствительных мутантов dynamin-1, это указывает на то, что их интернализация и исчезновение зависит от функции динамина-1 (расширенные данные рис. 2n,o). Более 80% точек CLIC-1 в AIS были неподвижны и, следовательно, не являлись мобильными транспортными везикулами, транзитно проходящими через AIS (Расширенные данные рис. 2p,q и Дополнительное видео 3). Мы также наблюдали постепенное образование и внезапное исчезновение AP-2-меченых точек, что соответствует динамике клатрин-опосредованного эндоцитоза³⁷ (расширенные данные рис. 2r,s и дополнительное видео 4).

Затем мы попытались определить, задействует ли DMA-1 клатрин-опосредованный эндоцитарный механизм в AIS. Во-первых, мы обнаружили, что точки DMA-1 быстро генерируются в AIS динамин-зависимым образом (рис. 2g,h). Затем мы обнаружили, что DMA-1 в AIS концентрируется в AP-2-меченых структурах, которые используются в качестве маркера клатрин-опосредованных эндоцитарных событий³⁸ (рис. 2i). В соответствии с этим, потеря функции apa-2, но не кавеолина-1 (cav-1) и кавеолина-2 (cav-2) (основных компонентов кавеолярного эндоцитоза), вызвала уменьшение количества GFP-позитивных точек в AIS и снижение общего сигнала GFP репортера клеточной поверхности DMA-1 (рис. 2j,k и расширенные данные рис. 2t). Это позволяет предположить, что сигнал GFP от репортера DMA-1 на поверхности клеток в значительной степени отражает интернализованные рецепторы. В совокупности эти результаты подтверждают, что DMA-1 подвергается клатрин-опосредованному эндоцитозу в AIS.

Чтобы непосредственно визуализировать эндоцитоз дендритных рецепторов в AIS и проверить, является ли эндоцитоз дендритных рецепторов в AIS консервативным, мы исследовали рецептор трансферрина (TfR) в культивируемых нейронах мыши и крысы. TfR является прототипическим дендрит-поляризованным рецептором, который был использован для раскрытия многих принципов функционирования AIS в поляризации нейронов^14,16,29,39. Мы обнаружили, что дендрит-поляризованный TfR также присутствует в AIS культивируемых нейронов мыши и перекрывается с AP-2 и легкой цепью клатрина, компонентами клатрин-опосредованного эндоцитарного механизма (расширенные данные рис. 3a-e). Затем мы использовали протокол импульсного pH для разрешения TfR-содержащих эндоцитарных событий в реальном времени⁴⁰... Мы визуализировали AIS в живых культивируемых нейронах крысы с помощью двух методов маркировки: (1) генетически кодированной конструкции, экспрессирующей внутриклеточный домен вольтаж-содержащего натриевого канала, слитый с mScarlet (mScarlet-NavII-III), который, как известно, локализуется в AIS, и (2) инкубации с антителом нейрофасцина, которое выявляет внеклеточный домен нейрофасцина⁴¹ (расширенные данные рис. 3f). Мы наблюдали эндоцитарные события TfR в сомато-дендритной области, как и ожидалось⁴² , однако мы также наблюдали сильный эндоцитоз TfR в AIS (рис. 2l,m и расширенные данные рис. 3g,h). Примечательно, что, несмотря на дендритную поляризацию, TfR подвергается эндоцитозу с той же частотой в AIS, что и в дендрите (рис. 2n и расширенные данные рис. 3i), тогда как в аксоне, дистальнее AIS, мы обнаружили мало эндоцитарных событий TfR (рис. 2m). Следует отметить, что эндоцитоз в AIS вряд ли обусловлен экзогенной экспрессией TfR-SEP, поскольку мы обнаружили сходные соотношения поверхностно связанного и интернализованного лиганда трансферрина в TfR-SEP-экспрессирующих и нетрансфицированных клетках (расширенные данные рис. 3j-l). Таким образом, трансгенный TfR-SEP вел себя аналогично эндогенному TfR. Прямая визуализация эндоцитоза TfR в AIS отличает эндоцитарное удаление TfR из плазматической мембраны от известных событий внутриклеточной сортировки TfR в AIS^14,16,29,39.

Мы также обнаружили доказательства эндоцитоза TfR в AIS индуцированных нейронов человека. Эти культуры нейронов были правильно поляризованы (на что указывает локализация TfR на дендрите и L1CAM на аксоне⁴³), имели одну AIS, меченную анкириномG, которая, как известно, демонстрирует пластичность AIS при совместном культивировании с глией⁴⁴, и имели клатрин-опосредованный эндоцитарный механизм в AIS (расширенные данные рис. 4a-e). Кроме того, TfR присутствовал в AIS и перекрывался с AP-2-меченными эндоцитарными структурами (расширенные данные рис. 4f,g). Все эти данные свидетельствуют о том, что эндоцитоз дендритных рецепторов в AIS консервативен у C. elegans и человека.

Поскольку эндоцитоз по своей природе удаляет трансмембранные рецепторы с плазматической мембраны, мы рассмотрели возможность того, что эндоцитоз в AIS функционирует для удаления поляризованных рецепторов с мембраны и таким образом участвует в поддержании их аксон-дендритной компартментализации. Поэтому мы сначала изучили последствия глобального ингибирования эндоцитоза путем нарушения функции динамина. Ингибирование эндоцитов с помощью термочувствительной мутации динамина-1 вызвало потерю дендритной полярности DMA-1 и дефекты морфологической полярности в нейронах PVD C. elegans (рис. 3a,b и расширенные данные рис. 4h). В культивируемых нейронах мыши и человека мы обнаружили, что эндоцитоз вносит вклад в дендритную компартментализацию TfR. Ингибирование эндоцитоза путем обработки препаратом Dyngo 4a вызывало увеличение TfR в аксоне, ослабляя тем самым его поляризованную дендритную локализацию, хотя TfR все еще был обогащен в дендрите, что указывает на то, что компонент его дендритной адресации не зависит от эндоцитоза (рис. 3c-e и расширенные данные рис. 4i-k). Эти результаты показывают, что эндоцитоз вносит свой вклад в поляризованное распределение дендритных рецепторов.

Fig. 3: Endocytosis maintains dendritic receptor compartmentalization and is critical for neuronal function.

Чтобы исследовать вклад эндоцитоза AIS в поддержание компартментализации поляризованных рецепторов, мы использовали два подхода к нарушению эндоцитоза в AIS. Оба подхода позволили получить доказательства того, что эндоцитоз AIS вносит вклад в полярность нейронов. .. Мы генетически изменили эндогенный локус DMA-1, заменив его цитоплазматический хвост на цитоплазматический хвост NF-186. Этот химерный рецептор DMA-1-NF-186 был обогащен в AIS, что соответствует ингибированному эндоцитозу (рис. 4a,b). Это изменение в локализации рецептора зависело от взаимодействия с ankyrinG. Введение подтвержденной точечной мутации, нарушающей связывание ankyrinG (FIGQD), изменило поведение химерного рецептора: он стал точечным в AIS и не был там сконцентрирован (рис. 4a,b). Затем мы использовали эту стратегию с химерным рецептором для изучения дефектов полярности. Мы обнаружили, что химеры DMA-1-NF-186 проникают в аксон, вызывают аберрантное ветвление аксона и вызывают поведенческий дефицит в поведенческом тесте на избегание жесткого прикосновения (рис. 4c-f). Восстановление эндоцитоза DMA-1-NF-186 в AIS путем внесения одноточечной мутации в мотив связывания NF-186 с ankyrinG9,25 устранило эти локализационные, морфологические и функциональные дефекты (рис. 4c-f). Затем мы провели параллельные эксперименты в индуцированных нейронах человека, создав химерные белки⁴⁵. DNER-NF-186 также демонстрировал повышенную флуоресценцию в AIS, которая зависит от взаимодействия с ankyrinG (расширенные данные рис. 6x,y). Затем мы исследовали дефекты полярности и обнаружили, что флуоресценция DNER-NF-186 была увеличена в аксоне по сравнению с DNER-NF-186 (FIGQD) (расширенные данные рис. 6x-z), что согласуется с ролью эндоцитоза AIS в компартментализации рецептора.



Fig. 4: Antagonizing DMA-1 AIS endocytosis and identifying dendritic receptor post-endocytic targeting to RAB-7 positive late endosomes.

... n, A model depicting the steps of polarized receptor endocytic clearance from the AIS. Axonal (red) and dendritic (blue) transmembrane proteins: (1) diffuse laterally into the AIS; (2) are trapped in the AIS by a diffusion barrier; (3) are captured for endocytosis by binding the clathrin-mediated endocytic machinery; (4) are targeted to RAB-7-positive late endosomes; and (5) are degraded through lysosomal pathways. Model created with BioRender.com. Data are mean ± s.e.m. n represents the number of individual C. elegans animals for each condition.

Эти данные позволяют предположить, что когда дендрит-поляризованные рецепторы не удаляются из плазматической мембраны AIS посредством эндоцитоза, они попадают в аксон, что уменьшает их дендритную полярность. Чтобы понять, как дендритные рецепторы попадают в аксон при ингибировании эндоцитоза, мы использовали временную визуализацию DMA-1 для наблюдения за входом везикул в аксон нейрона PVD C. elegans. Когда эндоцитоз был подавлен у C. elegans посредством мутации apa-2 с потерей функции, мы не наблюдали надежного везикулярного движения DMA-1 в аксоне (расширенные данные рис. 7a и дополнительные видео 5 и 6), несмотря на то, что наблюдали движение везикул аксонально поляризованного GFP-FLPon-RAB-3 в аксоне C. elegans дикого типа при тех же условиях визуализации (расширенные данные рис. 7b,c). Кроме того, мутация apa-2 с потерей функции не повлияла на известные функции фильтра внутриклеточных везикул или мембранного диффузионного барьера AIS (расширенные данные рис. 7d-g). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что DMA-1 неправильно локализуется в аксоне при ингибировании эндоцитоза посредством латеральной диффузии в мембране, а не через пути внутриклеточной везикулярной транспортировки.

Затем мы изучили, является ли эндоцитарный клиренс DMA-1 из AIS отдельным механизмом, который работает в сочетании с известными механизмами полярности AIS. В принципе, внутриклеточная сортировка везикул и эндоцитарный клиренс плазматической мембраны могут способствовать полярности нейронов, поскольку они направляют разные популяции белков. Чтобы проверить это, мы сосредоточились на миозине Va (также известном как HUM-2 у C. elegans), который опосредует внутриклеточный везикулярный трафик дендритных белков в AIS^14,29,30, и LRP-2, который способствует эндоцитозу DMA-1 в AIS (Дополнительное примечание 1). Используя анализ двойных мутаций, мы обнаружили, что у C. elegans с двойными мутациями lrp-2 и hum-2 наблюдается дальнейшая потеря дендритной полярности DMA-1 по сравнению с одиночными мутантами, что позволяет предположить, что эти белки функционируют в отдельных путях (расширенные данные рис. 7h,i). Эти результаты позволяют предположить, что эндоцитоз AIS работает в сочетании с функцией фильтрации везикул в AIS для параллельной сортировки плазматической мембраны и внутриклеточных рецепторов для поддержания полярности нейронов.

Чтобы эндоцитоз в AIS предотвратил попадание дендритных белков в аксон, эндоцитированные белки должны быть либо деградированы, либо возвращены обратно в дендрит. В пользу деградации говорит несколько доказательств. В AIS флуоресценция DMA-1 перекрывалась с внутренними RAB-7-позитивными поздними эндосомами, но не с RAB-10- и RAB-11-позитивными рециркулирующими эндосомами (рис. 4g,h и расширенные данные рис. 8a-d). RAB-7-позитивные поздние эндосомы представляли собой отдельную популяцию от AP-2-позитивных эндоцитарных структур и были преимущественно обогащены в AIS по сравнению с RAB-10- и RAB-11-позитивными рециркулирующими эндосомами (расширенные данные рис. 8e-g). Мы не наблюдали пула антероградных RAB-7-позитивных поздних эндосом в AIS (расширенные данные рис. 8h), это позволяет предположить, что DMA-1 сортируется в RAB-7-позитивные поздние эндосомы для деградации после его эндоцитоза в AIS. В соответствии с ролью RAB-7, мы обнаружили, что мутация rab-7, но не двойная мутация rab-10 rab-11, вызывает аберрантное ветвление аксонов, которое совпадает с потерей дендритной полярности DMA-1 (расширенные данные рис. 8i,j). И наоборот, двойная мутация rab-10 rab-11, но не мутация rab-7, приводила к значительному снижению дендритного ветвления (расширенные данные рис. 8k,l). Эти результаты демонстрируют различную роль Rab-опосредованных путей в морфологии нейронов PVD и предполагают, что пост-эндоцитарный трафик DMA-1 различается между AIS и дендритом. Роль RAB-7 подразумевает деградацию через лизосомные пути, что часто включает убиквитин-зависимую сортировку трансмембранных белков для деградации. Далее мы проверили, требуется ли убиквитинирование DMA-1, эндогенно мутировав три остатка лизина в цитоплазматическом хвосте DMA-1. Действительно, мутация лизина в аргинин (DMA-1(KtoR)) вызвала значительное накопление DMA-1 в более крупных точках в AIS, которые ко-локализовались с RAB-7-позитивными везикулами (расширенные данные рис. 8m,p). Мы также обнаружили, что дендритно поляризованный TfR частично ко-локализовался с Rab7-положительными поздними эндосомами в AIS культивируемых нейронов мыши и человека (расширенные данные рис. 8q-t). Требование Rab7 и локализация в AIS делают этот механизм эндоцитарного клиренса молекулярно и функционально отличным от известных способов транспортировки, таких как трансцитоз, которые функционируют в полярности⁴⁶.

Наконец, мы проверили, широко ли используется эндоцитарный клиренс поляризованных рецепторов из AIS. Мы сосредоточились на аксонально поляризованном рецепторе и разнообразных дендритных рецепторах в нейронах разных типов и видов. Мы обнаружили, что SER-1, рецептор серотонина, связанный с белком G, был аксонально поляризован в нейроне PVD и обогащен AP-2-меченными клатрин-покрытыми структурами и RAB-7-позитивными везикулами в AIS C. elegans (рис. 4i-k). Эти данные подтверждают представление о том, что аксонально поляризованные рецепторы удаляются с мембраны AIS посредством эндоцитоза после первоначального перемещения внутриклеточных везикул в аксон дистальнее AIS. Ингибирование эндоцитоза SER-1 посредством мутации apa-2 привело к потере аксональной полярности и неправильной локализации в дендрите (рис. 4l,m). Мы обнаружили, что дендритно поляризованный клаудин-подобный трансмембранный белок HPO-30 локализуется в клатрин-покрытых структурах и RAB-7-положительных везикулах в AIS, а ингибирование эндоцитоза вызывает потерю его дендритной полярности в нейроне PVD C. elegans (расширенные данные рис. 9a-f). В нейроне C. elegans DA9 дендритно-поляризованный тирозинкиназный рецептор ROR1/2, CAM-1, локализовался в клатрин-покрытых структурах и RAB-7-положительных везикулах в AIS, а ингибирование эндоцитов уменьшило его дендритную полярность (расширенный рис. 9g-n). В культивированных нейронах мыши и индуцированных нейронах человека мы обнаружили, что дендритно поляризованный глутаматный рецептор⁴⁷, GluA1, частично локализуется как в AP-2-меченых эндоцитарных структурах, так и в Rab7-позитивных везикулах в AIS, а ингибирование эндоцитов уменьшает его дендритную компартментализацию (расширенные данные рис. 10a-n). Таким образом, мы обнаружили, что различные поляризованные рецепторы в нейронах разных типов и видов эндоцитируются в AIS для удаления с плазматической мембраны AIS.

Мы предлагаем механизм, при котором аксон и дендрит поляризованные трансмембранные белки попадают в AIS путем латеральной диффузии, захватываются для эндоцитоза, интернализуются из плазматической мембраны и направляются на деградацию (рис. 4n). Многочисленные поляризованные рецепторы частично локализуются в клатрин-покрытых структурах и Rab7-положительных поздних эндосомах в AIS у многих типов и видов нейронов. Хотя мы обнаружили, что эндоцитоз в AIS связан с деградацией, и DMA-1, и TfR требуют рециркуляции в дендрите^48,49. Это позволяет предположить, что пост-эндоцитарная судьба рецепторов различается в AIS и дендрите. Эндоцитоз и последующая деградация поляризованных рецепторов по своей сути функционирует как механизм клиренса, и поэтому может быть критически важным для укрепления границ компартментов в AIS и поддержания полярности нейронов. С помощью молекулярных манипуляций с DMA-1 мы обнаружили, что преимущественное нарушение эндоцитоза AIS приводит к потере его дендритной компартментализации. Наш анализ с рецептором DNER предполагает, что это может представлять собой общий механизм, используемый для поддержания аксон-дендритной компартментализации.

Эндоцитарный клиренс поляризованных рецепторов с мембраны AIS, вероятно, работает в согласии с известными механизмами полярности. Мы обнаружили, что эндоцитоз в AIS функционирует параллельно с внутриклеточным движением везикул, опосредованным миозином Va. Было показано, что диффузионный барьер AIS удерживает белки в AIS между периодическими кольцеобразными структурами с расстоянием 190 нм, которые составляют субмембранный цитоскелет на основе актина-спектрина^10,21. Мы предполагаем, что в области мембраны между этими структурами могут формироваться эндоцитарные везикулы и что эндоцитоз удаляет трансмембранные белки, попавшие в ловушку диффузионного барьера. Сочетание поляризованного везикулярного транспорта, диффузионного барьера и эндоцитарного клиренса в AIS может позволить нейрону сохранять полярность на протяжении всей жизни.

Наши результаты проясняют функцию эндоцитарного клиренса AIS в полярности нейронов. Благодаря изучению одного из наиболее поляризованных типов клеток, настоящие результаты раскрывают механизм, с помощью которого нейроны могут достигать строгой компартментализации даже вдоль смежной мембраны. Используют ли другие поляризованные типы клеток или клетки со специализированными функциональными мембранными доменами подобный механизм для укрепления границ компартментов на мембране, является предметом будущих исследований. Эндоцитоз AIS, критически важный для полярности и функционирования нейронов, вероятно, имеет широкое физиологическое значение.