Чтобы понять механизмы, контролирующие поляризованный транспорт кинезина-1, мы искали изменения в цитоскелете микротрубочек, которые были связаны с изменениями в избирательном накоплении кинезина-1. Визуализация в живых клетках с микротрубочками ассоциированного белка TRIM46, раннего маркера аксона (17), показала, что он также циклически перемещается между нейритами в нейронах стадии 2, а его избирательная локализация у основания конкретных нейритов сильно коррелирует с транспортом кинезина-1 в этот нейрит (рис. 1, B - D; рис. S1; и фильм S2). Кроме того, более быстрая визуализация показала, что различные участки TRIM46, связанные с микротрубочками, испытывали коллективную антероградную или ретроградную подвижность со скоростью от 0,04 до 0,3 м/мин (рис. 1B и фильм S3). Примечательно, что антероградное или ретроградное движение TRIM46 соответствовало входу или выходу Kinesin-1 из нейритов, соответственно (рис. 1D; рис. S2, A - C; и фильм S4).

Синхронизированное движение TRIM46 внутри нейритов предполагает, что вся сеть микротрубочек может двигаться коллективно в нейритах нейронов стадии 2. Поэтому мы проследили за динамикой сети микротрубочек с помощью локальной фотоактивации тубулина (18). Это показало, что в нейритах нейронов 2 и 3 стадии сеть микротрубочек двигалась как единое целое, демонстрируя как ретроградную, так и антероградную подвижность (рис. 1, E и F). Во время последующего созревания нейрона общее движение сети микротрубочек и TRIM46 затухало (рис. 1, E - G; рис. S1; и фильмы S5 и S6) (19). В нейритах стадии 2 сеть микротрубочек в основном двигалась ретроградно, но иногда в некоторых нейритах наблюдалось обратное движение (рис. 1F). В нейронах третьей стадии поток микротрубочек в аксоне сильно затухал, тогда как в дендритах ретроградный поток сохранялся (рис. 1G), что позволяет предположить, что отсутствие ретроградного потока микротрубочек может быть необходимо для поляризации нейрона и спецификации аксона. Было показано, что поступление кинезина-1 коррелировало с ретроградным потоком микротрубочек, тогда как кинезин-1 сохранялся в нейритах без ретроградного потока микротрубочек (рис. S2A и фильм S7).

Эти результаты показывают, что ретроградный поток микротрубочек препятствует проникновению кинезина-1. Мы разработали анализ для глобального противодействия потоку микротрубочек в нейритах стадии 2 путем закрепления микротрубочек на плазматической мембране (рис. 2А). При этом подходе домен FKBP был направлен на плазматическую мембрану (FKBP-CAAX), а добавление мелких молекул rapalog запускало взаимодействие с его партнером по связыванию FRB, соединенным с интерактивным белком микротрубочек, который, как известно, тесно взаимодействует с микротрубочками (Kif5b-rigor) (20)... Мы подтвердили, что добавление рапалога к нейронам, экспрессирующим две конструкции для закрепления микротрубочек, привело к остановке потока TRIM46 в нейронах (рис. S3, C и D). Примечательно, что через 1 час после добавления рапалога кинезин-1 терял свое поляризованное распределение и вместо этого стал накапливаться в многочисленных нейритах (рис. 2, B и C, и фильм S10). Аналогичные результаты были получены при использовании другого якоря микротрубочек (APC2-C; рис. S3, E - G). Эти результаты показывают, что ретроградный поток микротрубочек противодействует проникновению кинезина-1 и что различия в потоке микротрубочек контролируют поляризованное распределение кинезина-1 в развивающихся нейронах.

Fig. 2. Local inhibition of retrograde microtubule flow is sufficient to instruct neuronal polarization.

Затем мы глобально закрепили микротрубочки на длительные периоды времени (24 и 48 часов) и определили количество аксонов на нейрон. Это показало, что при противодействии ретроградному потоку микротрубочек количество аксонов на нейрон значительно увеличилось (28% против 52% нейронов с более, чем одним аксоном в контроле по сравнению с условиями закрепления) (рис. 2, D - F). Таким образом, ингибирование ретроградного потока микротрубочек является достаточным для запуска формирования аксонов.

То, что глобальное ингибирование подвижности сети микротрубочек вызывает накопление кинезина-1 во всех нейритах, позволяет предположить, что локальный контроль над потоком микротрубочек может управлять поляризованным транспортом кинезина-1 в нейронах стадии 2... Через 30 мин после светом индуцированного локального закрепления сети микротрубочек транспорт кинезина-1 был уверенно направлен в выбранный нейрит стадии 2, наряду с обогащением раннего аксонального маркера TRIM46 (рис. 2, H - J; рис. S4; и фильм S11)... Эти результаты непосредственно демонстрируют, что локальное снижение ретроградного потока микротрубочек достаточно для контроля поляризованного транспорта кинезина-1, который необходим для спецификации аксона.

Далее мы искали регуляторы, которые могли бы контролировать пространственные различия в потоке микротрубочек. Различные гуанозинтрифосфатазы (ГТФазы) семейства Rho, такие как Rac1 и Cdc42, были связаны с полярностью нейронов и формированием аксонов (22-24). Эти белки являются ключевыми регуляторами актинового цитоскелета, который имеет решающее значение во время развития нейронов и спецификации аксонов, и могут лежать в основе наблюдаемого нами потока микротрубочек (6, 25). Поэтому мы исследовали, влияет ли ингибирование аксон-специфической ГТФазы Rac1 на поток сети микротрубочек. Ингибирование Rac вызывало трехкратное снижение скорости потока микротрубочек в нейронах стадии 2 (рис. 3А). Соответственно, ингибирование Rac1 или Cdc42 вызывало поступление Kinesin-1 в многочисленные нейриты (рис. 3, B и C, и рис. S6). Более того, стабилизация актиновой сети с помощью jasplakinolide имитировала эффект ингибиторов Rho GTPase и также приводила к поступлению Kinesin-1 в множественные нейриты (рис. 3C), что свидетельствует о том, что подвижность сети микротрубочек зависит от динамики актинового цитоскелета.

Fig. 3. Rac1 and Cdc42 control microtubule network flow and neuronal polarization.

Локальной активации Rac1 с помощью фотоактивируемого Rac1 (PA-Rac1) было достаточно, чтобы направить Kinesin-1 в один нейрит (рис. 3, D - F, и фильм S12). Кроме того, мы наблюдали, что локальная активация Rac1 вызывала антероградный поток микротрубочек в выбранном нейрите и одновременно запускала ретроградный поток во всех остальных нейритах (рис. S7). Вместе эти результаты показывают, что Rho GTPases Rac1 и Cdc42 регулируют движение сети микротрубочек и тем самым контролируют поляризованное накопление Kinesin-1 и последующую спецификацию аксона.

В тканях внеклеточные сигналы часто направляют поляризацию нейронов вдоль заранее определенной оси (2). Для изучения важности потока микротрубочек при такой направленной извне поляризации мы задались целью создать надежную модельную систему для управляемой поляризации под действием внеклеточных факторов матрикса. Недавние работы показали, что механические свойства ткани мозга, например, градиенты жесткости, контролируют важные процессы развития мозга, включая миграцию нервного гребня и рост аксонов (26, 27). Кроме того, известно, что механические свойства внеклеточного матрикса контролируют внутриклеточную сигнализацию Rho GTPase и динамику актинового цитоскелета (28), это заставило нас предположить, что движение сети микротрубочек и последующая спецификация аксона могут контролироваться механическими свойствами внеклеточного матрикса. Поэтому мы наблюдали за поляризованным транспортом кинезина-1 и спецификацией аксонов в нейронах, выращенных на покрытых ламинином гелях с градиентом жесткости от 0,4 до 7 kPa (рис. 4, А и Б). Мы использовали недавно представленный метод создания градиентных гелей, в которых плотность встроенных флуоресцентных шариков сообщает о локальной жесткости и может быть использована для картирования ландшафта жесткости вокруг каждого нейрона (рис. S8) (29). Диссоциированные нейроны гиппокампа крысы были помещены на эти гели непосредственно после препарирования. Мы обнаружили, что Кинезин-1 был обогащен в нейритах, растущих в сторону более мягкой стороны матрикса у ~73% нейронов стадии 2, тогда как ~79% аксонов нейронов стадии 3 были направлены в сторону более мягкой стороны матрикса (рис. 4, C - E, и рис. S9 и S10). Эти результаты показывают, что поляризованный транспорт кинезина-1 и формирование аксонов могут направляться градиентами жесткости.



Fig. 4. Microtubule network mobility is necessary for neuronal polarization driven by extracellular cues.

(A) Preparation of stiffness gradient using premixes for stiff and soft gels. PLL, poly-L-lysine. (B) Bead density and laminin intensity on the stiffness gradient hydrogels (n = 11). Error bars: SEM. (C) Stage 2 and stage 3 neurons grown on stiffness gradients. Left: Stage 2 neuron expressing Kinesin-1. Right: Stage 3 neuron labeled for the axon marker Tau. Arrowheads mark neurite with Kinesin-1 accumulation or Tau-positive axon, both growing toward the softer matrix. Scale bars, 10 µm. (D) Orientation of traces of stage 2 neurites with Kinesin-1 and stage 3 axons on stiffness gradients. Black circles represent position of cell bodies. Colors represent traces from independent experiments. Scale bars, 20 µm (x and y). (E) Percentage of stage 2 neurites with and without Kinesin-1 accumulation (n = 22 and 62 neurites) and stage 3 axons and dendrites (n = 22 and 46) directed toward the soft matrix on stiffness gradients. **P ≤0.01 (chi-square test). (F) Rapalog-induced global microtubule anchoring assay on stiffness gradient. (G) Kinesin-1 accumulation with or without global microtubule anchoring. Scale bar, 10 µm. (H) Kinesin-1 accumulation after global microtubule anchoring. With FRB module: n = 80 neurons without rapalog and n = 104 neurons with rapalog from three independent experiments. Without the FRB module: n = 97 neurons without rapalog and n = 134 neurons with rapalog from four independent experiments. Error bars represent SD. ***P ≤ 0.001 and ns, P > 0.05 (chi-square test). (I) Stage 2 neuron expressing Kinesin-1 (gray), grown on a stiffness gradient matrix and treated with a Rac inhibitor. Scale bar, 20 µm. (J) Kinesin-1 accumulation in different conditions. Control (n = 112), Rac inhibitor (n = 128), and Cdc42 inhibitor (n = 47) from three independent experiments. Error bars: SD. ***P ≤ 0.001 (chi-square test). (K) Summary of the interplay between substrate elasticity, microtubule network mobility, and Kinesin-1 accumulation for axon specification and neuron polarization during development.

Чтобы проверить, контролируется ли поляризованный транспорт кинезина-1 во время поляризации, направляемой извне, потоком микротрубочек, мы использовали глобальный анализ закрепления микротрубочек. При рапалог-индуцированном закреплении микротрубочек избирательное накопление кинезина-1 в нейритах, растущих к более мягкому матриксу, пропадало, и вместо этого кинезин-1 обогащался во множестве нейритов (рис. 4, F - H). В контрольных экспериментах, в которых использовался якорь микротрубочек, лишенный домена гетеродимеризации, распределение кинезина-1 оставалось поляризованным (рис. 4H). Более того, глобальное ингибирование активности Rac1 или Cdc42 также нарушало селективное поступление кинезина-1 в нейроны на градиентах жесткости (рис. 4, I и J). Эти результаты показывают, что внеклеточные сигналы контролируют поляризацию нейронов путем управления потоком сети микротрубочек, влияя тем самым на поляризованный транспорт.

В этой работе мы раскрыли новый цитоскелетный механизм, лежащий в основе поляризации нейронов и спецификации аксонов (рис. 4K). Мы обнаружили, что в развивающихся нейронах большинство нейритов имеют сеть микротрубочек, которая подвергается ретроградному движению, что препятствует проникновению кинезина-1, необходимого для спецификации аксона. Кинезин-1 попадает в нейриты только без ретроградного потока, а локальное закрепление сети микротрубочек может использоваться для контроля поляризации путем направления кинезина-1 в определенные нейриты. Когда ретроградному потоку противостоит глобальное закрепление сети микротрубочек, кинезин-1 накапливается во всех нейритах, и нейроны не поляризуются, даже в присутствии внеклеточных направляющих сигналов. Таким образом, правильная поляризация зависит от различий в подвижности сети микротрубочек между разными нейритами (30). Наблюдаемые изменения в подвижности сети микротрубочек (~0,1 µм/мин) слишком тонки, чтобы напрямую объяснить полную потерю Кинезина-1 из нейрита, поскольку сам Кинезин-1 (~1 µм/с) движется гораздо быстрее и в принципе должен быть способен обогнать ретроградное движение микротрубочек. Мы предполагаем, что активность самого Kinesin-1 может регулироваться Rho GTPases, которые также контролируют подвижность сети микротрубочек во время поляризации нейрона (рис. 4K). Недавнее исследование нематоды Caenorhabditis elegans показало важность комплекса Ankyrin/UNC119/CRMP в контроле скольжения микротрубочек во время поляризации (31), что позволяет предположить динамическое взаимодействие между уменьшением потока микротрубочек и формированием начального сегмента аксона.

Наши результаты показывают, что ретроградный поток микротрубочек контролируется Rho GTPases, которые управляют динамикой цитоскелета, и что ингибирование Rho GTPases Rac1 и Cdc42 или стабилизация актина приводит к накоплению Kinesin-1 во всех нейритах. Эти результаты позволяют предположить, что актиновый цитоскелет вносит свой вклад в подвижность сети микротрубочек, например, через связь микротрубочек с ретроградным потоком актина, который, скорее всего, усиливается силами (кортикально закрепленных) моторов на основе микротрубочек и силами, возникающими в результате полимеризации микротрубочек на кончиках нейритов (32). Более ранние работы показали, что увеличение жесткости внеклеточного матрикса стимулирует активность миозина II, движущей силы ретроградного потока актина (33, 34), что может дать механистическое объяснение нашему наблюдению, что полярность нейронов может направляться градиентами жесткости. В частности, более жесткий матрикс увеличивает ретроградный поток актина и приводит к ретроградному потоку микротрубочек, который препятствует входу кинезина-1, тем самым направляя поступление кинезина-1 в сторону нейритов, растущих на более мягком матриксе.

В целом, наша работа показывает клеточный каскад, посредством которого внеклеточные (механические) сигналы могут определять ось полярности нейронов.