У млекопитающих вомероназальное восприятие играет важную роль в межвидовых взаимодействиях, включая обнаружение хищников, размножение и избегание больных сородичей (1, 2). Таким образом, оно имеет решающее значение не только для выживания отдельных особей, но и для поддержания соответствующего вида.

Вомероназальный орган (VNO ), удлиненная обонятельная структура, расположенная в основании носовой полости большинства млекопитающих, содержит сенсорные нейроны, которые экспрессируют рецепторы, специализированные для обнаружения феромонов и кайромонов (3). Эти хеморецепторы представляют собой семь трансмембранных G-связанных рецепторов, семейства вомероназальных рецепторов типа 1 (V1r), типа 2 (V2r) или рецепторов формилпептида (Fpr) (4). Репертуары генов V1r являются одними из наиболее изменчивых по размеру среди семейств генов позвоночных. Например, геномы утконоса, мыши и слона содержат 302, 235 и 34 гена V1r, соответственно (5). Например, целые подсемейства V1r часто специфичны для данного вида, даже между близкородственными видами, такими как мыши и крысы. Такое разнообразие является результатом исключительно динамичной эволюционной истории, включавшей многочисленные и быстрые рождения и смерти генов.

Fprs, которые экспрессируются иммунными клетками млекопитающих, приобрели специфическую для обоняния экспрессию у грызунов (6, 7). Нейронная специфичность Fpr-rs3, rs6, rs7 и rs4 была приобретена после захвата промотора V1r (последовательность которого сохраняется и сегодня) дублированной кодирующей последовательностью (CDS) иммунного Fpr около 30 миллионов лет назад, после чего произошло размножение и дивергенция этого химерного гена (8). В результате эти четыре Fprs встроены в кластер генов вомероназальных рецепторов. Подобно V1rs (9, 10), они экспрессируются в апикальной части вомероназального эпителия точечно и моногенно (6, 7), и, как и V1rs, их соответствующие сенсорные нейроны проецируются в ростральную дополнительную обонятельную луковицу (AOB) (11). Учитывая их эволюционную историю, паттерны экспрессии и сохранение промотора, транскрипционная регуляция Fpr-rs3, rs6, rs7 и rs4 считается аналогичной регуляции V1rs (8).

Мы сообщаем, что в отличие от вомероназальных псевдогенов, которые разбросаны по всему геному, функциональные гены вомероназальных рецепторов имеют консервативную кластерную организацию. Используя комбинацию геномных, транскриптомных и трансгенных подходов, мы исследовали силы, которые могли действовать в поддержании и расширении кластеров генов вомероназальных рецепторов в ходе эволюции. Наши данные позволяют предположить, что не выбор генов вомероназальных рецепторов, а скорее продолжение транскрипции является основной селективной силой, поддерживающей кластеризацию функциональных генов вомероназальных рецепторов. РЕЗУЛЬТАТЫ Различная геномная организация псевдогенов V1r/Fpr и функциональных генов Среди млекопитающих разнообразие генов вомероназальных рецепторов отражает их быструю эволюцию. Чтобы расширить это наблюдение и представить эту быструю эволюцию в контексте, мы сравнили разнообразие вомероназальных рецепторов с разнообразием рецепторов запаха (Ors), другого быстро развивающегося и большого суперсемейства хеморецепторов. Мы извлекли полный репертуар генов V1r и Or из геномов 29 видов млекопитающих и обнаружили 1724 и 22 885 генов, соответственно. Чтобы охватить большинство основных линий, мы проанализировали геномы Glires, Primates, Laurasiatheria, Xenarthra, Marsupialia, Afrotheria и Monotremata. Чтобы изучить динамику эволюции репертуаров, мы построили филогению на основе последовательностей белков Or и V1r всех видов. Обнаруживаемый паттерн, подчеркивает замечательные пропорции V1r видо-специфичных паралогов (inparalogs, i.e., благодаря удвоениям, которые возникают после последнего события видообразования в нашем анализе), более выражена, чем Ors (Fig. 1A). Чтобы оценить значение этого происхождения, мя идентифицировали все V1r и Or группы inparalog у 29 видов, классифицируя их по размеру и сравнивая их вклад в слльв. Их репертуар. Было установлено, что V1r группы inparalog (которые соответствовали монофилетическим и видо-специфичным паралогам paralogs) содержат 4 или более генов, представляющих более крупную пропорцию в репертуаре каждого вида, чем группы Or inparalog того же самого размера (Fig. 1B). Эволюция видо-специфичных репертуаров V1r генов у млекопитающих засчет удвоений генов проходила быстрее, чем Or генов.

Fig. 1. Different genomic organization of V1r/Fpr pseudo- and functional genes. (

(A) Phylogeny of 29 mammals with major clades labeled: Eu-archontoglires, La-urasiatheria, Xe-narthra, Af-rotheria, Ma-rsupialia, and M-onotremata. Dots indicate the species analyzed in (C) to (F). Or and V1r genes as tiled colored by species and ordered as they appear on their respective phylogenies are shown below. (B) Gene duplication rate within Or (green) and V1r (blue) repertoires, evaluated through the size of species-specific paralog (inparalog) groups (x axis labels represent size bins such as i <= inparalog number < j). Left to right: *P = 0.032, **P = 0.0029, ***P = 1.3 ? 10?7, ***P = 5.7 ? 10?5, and ***P = 2.2 ? 10?5, Wilcoxon. Density estimates are drawn in the background. (C) Distances between V1r genes. Left: Species phylogeny. Dot plots: Distance between adjacent intact V1r CDSs (dark blue) or V1r pseudogenes (?, light blue). Density estimates are drawn in the background. Gray vertical bars: clustering thresholds. (D) V1r gene and cluster numbers. Colored circle segments show the relative size of the different gene clusters. Gray segment represents the proportion of singletons. Outer edge segments delimit chromosomes or assembly scaffolds. Total numbers of intact V1r genes (dark blue) and pseudogenes (light blue) are displayed. (E) Genomic distribution of singleton V1r genes within the genome of species featured in (C) and (D). For each species, chromosomes or scaffolds that contain at least one V1r sequence are shown as horizontal gray bars of proportional lengths. (F) Clustered versus singleton V1r pseudogene (?) rates. *P = 0.016, Wilcoxon.

...

Fig. 6. Transgenic Fpr-rs3 expression is punctate, restricted to G?i2-expressing neurons, and exclusively present in neurons targeting the rostral AOB.

(A) Schematic of a representative VNO coronal section with the neuroepithelium highlighted in light blue and two apical VSNs in red. (B) In situ hybridization with a probe against Gαi2 (green) and counterstained with DAPI (blue), on a VNO coronal section of aFpr-rs3^cre/+; RosastopRFP/⁺ mouse. The white square shows the magnification displayed in (C) and (D). Scale bars, 100 µm. (C) Magnification of (B) with immunolabeling of RFP (red). White arrowheads point at RFP+ VSNs. (D) Same image as (C) showing Gαi2 RNA localization in overlay. ^(E) Numbers of cells that are either negative for Gαi2 and positive for RFP (Gαi2?/RFP+; red) or double positive (Gαi2+/RFP+; yellow) in VNO sections of Fpr-rs3cre/+; Rosa^stopRFP/+ mice (n = 10 sections) or Tg(Fpr-rs3-cre)5; Rosa^stopRFP/+ (Tg #5, n = 10 sections) mice. (F and G) In situ hybridization with a probe against Gαo (green) and immunolabeling of RFP (red) on a VNO coronal section of a Fpr-rs3cre/+; RosastopRFP/+ mouse. Dashed line delimits the region where cell bodies are Gαo+. White arrowheads point at RFP+ VSNs. Scale bar, 50 µm. (H) Numbers of cells that are either negative for Gαo and positive for RFP (Gαo/RFP+; red) or double positive (Gαo+/RFP+; yellow) in VNO sections of KI (n = 15 sections) or Tg #5 (G?o, n = 26 sections) mice. (I and J) Schematic of the AOB on a dorsal view of a mouse brain (I) and location of the AOB on a lateral view of a mouse head hemisection (J). Dashed boxes indicate areas displayed in (K) to (P). (K to P) Endogenous protein fluorescence (RFP, red; Venus/GFP, green) in a Fpr-rs3cre/+; Rosa^stopRFP/+ mouse (K and L), a Tg(BAC-Fpr-rs3-cre)4; RosastopRFP/+ mouse (M and N), and (O and P) a Tg(BAC-Fpr-rs3-cre)5; Rosa^stopRFP/+ mouse. Scale bars, 200 µm. In addition, see fig. S1 (A to D).

Первоначально применяя глобальный геномный подход с использованием множества геномов млекопитающих (вплоть до грызунов), мы сообщаем, что геномная организация псевдогенов и функциональных генов V1r/Fpr различна. Мы обнаружили, что функциональные гены V1r/Fpr организованы в кластеры, несмотря на очень высокий уровень дупликации генов V1r/Fpr, эволюционная динамика которых ближе к динамике элементов LINE, чем к другим кластерным генам, таким как гены Hox или опсинов. Эта кластерная организация контрастирует с организацией псевдогенов, которые часто встречаются в виде одиночных генов. Мы также заметили, что уровни транскрипции V1r различаются среди кластеров генов V1r и что присутствие псевдогенов внутри кластеров генов V1r положительно связано с их транскрипционной активностью. Эти данные свидетельствуют о существовании регуляторных последовательностей в кластерах генов V1r/Fpr, необходимых для адекватной экспрессии вомероназальных рецепторов. Эти регуляторные последовательности, действующие на расстоянии и, возможно, разделяемые несколькими вомероназальными генами, будут утрачены, когда кластеризованный ген V1r дублируется и выходит за пределы кластера генов V1r, что в конечном итоге приведет к псевдогенизации теперь уже одиночного V1r. Редкие исключения из этой модели отражают события дупликации, которые включают минимальные регуляторные последовательности, необходимые для функциональной транскрипции V1r/Fpr. Наша гипотеза - неспособность нелокальных дупликаций одного гена воспроизвести нормальную транскрипцию - таким образом объясняет эволюционно консервативную кластерную организацию функциональных вомероназальных генов.

Мы проверили нашу гипотезу, проведя эксперимент по пересадке генов. Наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что трансген V1r/Fpr, расположенный вне своего родного кластера V1r/Fpr, может быть выбран для экспрессии, но не может поддерживать транскрипционную активность. Альтернативным объяснением наших данных может быть то, что трансгены подвержены неспецифической (негерметичной) экспрессии. Несколько наблюдений свидетельствуют против этого объяснения. Во-первых, мы наблюдали временную специфическую экспрессию. Транскрипция трансгена ограничена молодыми нейронами, то есть тем периодом времени, когда происходит выбор гена хеморецептора. Во-вторых, мы наблюдали экспрессию, специфичную для типа клеток. Трансгены избирательно экспрессируются в апикальных (Gαi2-экспрессирующих) VSN, которые проецируются в ростральную часть вспомогательной обонятельной луковицы. В-третьих, мы наблюдали высокие уровни экспрессии трансгенов, не уступающие эндогенно экспрессированным вомероназальным генам, чего нельзя ожидать от негерметичной экспрессии. Наконец, мы не наблюдали гибели нейронов после начала транскрипции трансгена. Таким образом, наши данные указывают на активацию трансгена, которая является точечной, сильной, преходящей и специфичной для фазы развития и определенной идентичности вомероназальных нейронов. Они подтверждают два новых и неожиданных вывода: (i) что гены V1r/Fpr привязаны к своим кластерам, поскольку их адекватная экспрессия зависит от этой близости, и (ii) что кластерная организация поддерживает транскрипционную стабилизацию, а не первоначальный выбор гена.

Почему о критической роли кластеризации вомероназальных генов на транскрипционную стабильность не было сообщено давно ? Первый ответ, несомненно, кроется в том, что большинство трансгенных подходов, которые не повторяют эндогенную экспрессию, обычно никогда не публикуются. Именно с такой ситуацией мы столкнулись несколько лет назад, когда пытались запустить экспрессию флуорофора под контролем промотора вомероназального рецептора (V1rb2). Мы наблюдали очень редкие нейроны, экспрессирующие трансген в VNO, экспрессия которых исчезала с возрастом. Этот результат, который в то время был проигнорирован, поскольку не соответствовал нашим ожиданиям, он параллелен экспериментам, о которых сообщается здесь. Однако есть один отчет, основанный на трансгенном подходе к экспрессии флуорофоров под контролем генов вомероназальных рецепторов (12). В этой работе наблюдаемый паттерн экспрессии повторял эндогенный паттерн соответствующих генов рецепторов. Легкое объяснение этой очевидной неожиданной способности заключается в размере и содержании трансгена, использованного в исследовании: очень большой ВАС, содержащий шесть полных генов V1r; другими словами, небольшой кластер генов V1r.

Наши данные напоминают и согласуются с предыдущей работой, в которой мы выявили особый механизм, влияющий на гены V1r, который мы назвали "блокировкой кластера генов" (13). Когда для экспрессии выбирается нефункциональный аллель V1r, VSN переходит к ко-экспрессии другого случайного аллеля V1r (ситуация, вероятно, аналогичная переключению рецептора после глушения трансгена, с которым мы столкнулись в настоящем исследовании). Этот второй выбор V1r, по-видимому, включает любой ген V1r, но не гены из первоначально выбранного кластерного аллеля. Эта "блокировка кластера" естественным образом наводит на мысль о регуляторных элементах, которые могут действовать на несколько рецепторных генов, но по одному гену в данном кластере. Природа этих регуляторных элементов еще не определена и может, например, включать ограниченное число последовательностей, присутствующих в кластерах вомероназальных генов, действующих в cis-положении на вомероназальные гены. Необычно высокая гомология между промоторами V1r, относящимися к определенному подсемейству, может отражать то, что последние являются мишенью для этих модулирующих элементов.

Подобно V1rs и Fprs, Ors, экспрессируемые в главном обонятельном эпителии, также подвержены случайному моногенному выбору генов (14). В различных отчетах показана роль цис-регуляторных элементов, присутствующих в кластерах обонятельных генов, элементов, которые являются критическими для экспрессии обонятельных генов. Эти цис-регуляторные последовательности в настоящее время рассматриваются как элементы выбора. Естественно, заманчиво провести механистические параллели между этими данными и нашими нынешними результатами, но следует сохранять осторожность, поскольку между одорантными и вомероназальными рецепторами существуют большие различия. Во-первых, Ors и Vrs/Fprs не имеют общих гомологий последовательностей, как на уровне соответствующих генов, так и белков. Возможно, что более важно для регуляции их экспрессии, гены V1r и Fpr имеют высококонсервативные промоторы (15, 16), по крайней мере, в пределах каждого подсемейства, что полностью отсутствует у генов Or. Наконец, как показано в данной работе, Vrs в значительной степени более разнообразны, чем Or между видами, в результате высокой скорости рождения и смерти генов.

Несмотря на большое количество генов вомероназальных рецепторов в геномах млекопитающих и критическую роль их продуктов в выживании вида, регуляция генов вомероназальных рецепторов не изучена. В дополнение к идентификации селектиного давления, которое поддерживало кластеризацию вомероназальных генов в ходе эволюции, мы предлагаем идею о том, что элементы, потерянные во время нелокальных дупликаций одиночных вомероназальных генов, регулируют транскрипцию, а точнее стабилизацию выбора генов, а не частоту самого выбора. Эта последняя идея представляет собой новое направление исследований в данной области.