Комплекс ULK, состоящий из каркасного белка FIP200 (также известного как RB1CC1), ATG13, ATG101 и серин/треониновых киназ ULK1 или ULK2, является центральным регулятором инициации макроавтофагии (табл. 1, рис. 1а). Его активность подавляется в основном mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1). При голодании mTORC1 инактивируется, что приводит к активации и сборке комплекса ULK вблизи мембраны ЭР, который рекрутирует нижележащие белки ATG для инициации формирования аутофагосом (рис. 1а, инициация). У дрожжей гомологичный комплекс Atg1 образует аналогичные собранные структуры, известные как pre-autophagosomal structures (PASs). PAS - это более высокий порядок сборки комплексов Atg1, в котором Atg13 связывает Atg1 (гомологичный ULK1/2) и подкомплекс Atg17-Atg29-Atg31 (Atg17 гомологичен части FIP200)^12,13. PAS представляет собой жидкоподобный конденсат, образующийся в результате разделения фаз жидкость-жидкость, которое обусловлено мультивалентными взаимодействиями между Atg1, Atg13 и Atg17 (см. 13), и обеспечивает среду, которая межмолекулярно аутоактивирует киназу Atg1¹⁴. Таким образом, сборка комплекса ULK/Atg1 является ключевым шагом в инициации макроавтофагии.

Table 1 The autophagy-related (ATG) proteins required for autophagosome formation

Помимо сборки, индуцированной голоданием, сборка комплекса ULK/Atg1 также управляется грузами (cargos) для аутофагии (рис. 1a, инициация). Растворимый адаптер для субстратов (грузов) аутофагии SQSTM1 (также называемый p62) образует жидкоподобные конденсаты с убиквитинированными белками и взаимодействует с FIP200 для рекрутирования комплекса ULK¹⁵. (В данном обзоре под "адаптером" понимается растворимый белок, опосредующий связывание груза с механизмом аутофагии, а под "рецептором" - белок, находящийся в грузе и связывающийся с механизмом аутофагии). Во время Parkin-зависимой митофагии (см. ниже) и селективной деградации у сальмонелл, NDP52 (также называемый CALCOCO2) - другой растворимый адаптер аутофагии - локализуется в убиквитинированных митохондриях и цитозоле бактерий и рекрутирует комплекс ULK через взаимодействие с FIP200 (ссылки 16,17). TAX1BP1 также рекрутирует FIP200 в конденсаты SQSTM1¹⁸. Убиквитин-независимая селективная макроавтофагия также включает в себя сборку комплекса ULK, управляемую грузом: рецептор ЭР-фагии CCPG1 взаимодействует с Claw-доменом FIP200 для рекрутирования комплекса ULK^19,20.

После сборки комплекс ULK рекрутирует везикулы ATG9 (рис. 1a, "Инициация"), которые, как считается, являются семенами для формирования аутофагосом²¹. Набор везикул ATG9 осуществляется посредством взаимодействия между доменами HORMA субкомплекса ATG13-ATG101 и самым С-концевым участком ATG9A²² (табл. 1). Во время Parkin-зависимой митофагии везикулы ATG9 также рекрутируются через связывание с адаптером аутофагии OPTN, который присутствует на убиквитинированных митохондриях²³. Аналогично, в дрожжах везикулы Atg9 рекрутируются по двум путям: один через взаимодействие с HORMA доменом Atg13 во время макроавтофагии, вызванной голоданием, а другой через грузовой адаптер Atg11 во время селективной макроавтофагии²⁴.

Комплекс ULK также рекрутирует фосфатидилинозитол 3-киназный комплекс I класса III (PI3KC3-C1), который производит PI(3)P в аутофагических мембранах (рис. 1а, "Удлинение мембраны"). PI3KC3-C1 состоит из пяти субъединиц: VPS34, VPS15, BECN1 (Vps30 в дрожжах), ATG14 и NRBF2 (Atg38 в дрожжах) (Таблица 1). PI3KC3-C1 связывается с мембранами через ATG14, BECN1 и VPS34, после чего VPS34 генерирует PI(3)P^25,26.

Эффекторы PI(3)P включают β-propellers, связывающие белки семейства полифосфоинозитидов (PROPPIN) (белки WIPI у млекопитающих и Atg18, Atg21 и Hsv2 у дрожжей), которые далее рекрутируют ATG2. ATG2 образует стержнеобразную структуру, которая прикрепляется к мембране ЭР своим N-концом и к аутофагической мембране своим C-концом^27,28 (рис. 1б). Исследования in vitro показали, что фосфолипиды переносятся через гидрофобную полость в ATG2, что позволяет предположить, что этот процесс происходит между ЭР и фагофором in vivo^29-31. Однако механизм, с помощью которого регулируется активность переноса, и то, что его стимулирует, еще предстоит выяснить.

У млекопитающих существует четыре белка семейства PROPPIN (WIPI1-4). ATG2 направляется на богатые PI(3)P аутофагические мембраны, вероятно, через взаимодействие с WIPI3 или WIPI4 (ссылки 27,32). Из четырех гомологов WIPI2 доминирует, так как истощение только WIPI2 значительно подавляет аутофагию³³, опережая WIPI3 и WIPI4 (см. 34). WIPI2 связывается с ATG16L1, компонентом комплекса ATG12-ATG5-ATG16L1 (табл. 1), который обладает E3-подобной активностью для продвижения липидирования белков ATG8 (LC3 и белки семейства GABARAP у млекопитающих, которые далее совместно называются ATG8). ATG8 может дополнительно привлекать ATG2, поскольку ATG2 имеет LC3-взаимодействующую область (LIR) (см. ниже)³⁵. Таким образом, WIPI2 также вносит косвенный вклад в рекрутирование ATG2.

После того как ATG2 переносит липиды на внешнюю створку аутофагической мембраны, ATG9 протискивает (scrambles) фосфолипиды в мембрану (рис. 1б). ATG9 образует тример и транслоцирует фосфолипиды между внешним и внутренним листками^36-38. Существуют также две фосфолипидные scramblases, необходимые для формирования аутофагосом в мембране ЭР: VMP1 и TMEM41B^38-40 (рис. 1б). Оба белка являются много раз пронизывающими мембранными белками с консервативным доменом DedA, имеющим две характерные re-entrant петли^41,42 (вставка 1). Поскольку ATG2A взаимодействует с ATG9, а также с VMP1 и TMEM41B38, то VMP1/TMEM41B-ATG2-ATG9 можно считать единицей переноса липидов. Эти скремблазы могут уравновешивать дисбаланс плотности фосфолипидов на каждом листстке, путем переносом липидов (рис. 1б). Однако, если локальный синтез липидов в наружном листке мембраны ЭР создает давление для направленного переноса липидов, то липидный скремблинг может ослабить эту активность. Более того, VMP1 и TMEM41B важны для формирования не только аутофагосом, но и липидных капель, липопротеинов и двухмембранных структур, необходимых для репликации некоторых РНК-вирусов (включая SARS-CoV-2)⁴³. Поэтому их проталкивающая активность может иметь решающее значение для фундаментальной функции ЭР, а не только для обеспечения липидами ATG2. У дрожжей есть TMEM41B-подобный белок, Tvp38, но он не требуется для образования аутофагосом⁴¹. Механизм, с помощью которого дрожжи могут формировать аутофагосомы без белков семейства DedA, еще предстоит выяснить.

Две убиквитин-подобные системы конъюгации, системы ATG8 и ATG12, также играют ключевую роль в формировании аутофагосом. Совместно с E1-подобным ферментом ATG7 и E2-подобными ферментами ATG3 и ATG10, ATG8 и ATG12 конъюгируют с фосфатидилэтаноламином (PE) и ATG5, соответственно. Комплекс ATG12-ATG5-ATG16(L1) обладает E3-подобной активностью для конъюгации ATG8-PE. Хотя системы конъюгации ATG необходимы для образования аутофагосом в дрожжах, в клетках млекопитающих, казалось бы, нормальные аутофагосомы могут образовываться даже при нарушении этих систем^44-46. По-видимому, они более важны для слияния с лизосомами или деградации внутренней мембраны аутофагосом^47,48 и, следовательно, все еще имеют решающее значение для аутофагического потока.

Поскольку аутофагосомы захватывают часть цитоплазмы (примерно 0,5-1 µм в диаметре), считается, что большинство растворимых грузов включается в них неселективно. Однако аутофагосомы могут также избирательно распознавать различные грузы (цели), включая поврежденные органеллы, внутриклеточные бактерии и некоторые белки⁴⁹. Помимо решающей роли в динамике мембраны, ATG8 выполняет центральную функцию в распознавании грузов при селективной макроаутофагии (рис. 1c). ATG8 напрямую взаимодействует с мотивами LIR (или Atg8-interacting motif у дрожжей) в грузах или адаптерах аутофагии, которые делятся на убиквитин-зависимые и -независимые типы (Таблица 2). Адаптеры растворимых грузов, распознающие убиквитин, включают SQSTM1, NBR1, NDP52, OPTN, TAX1BP1 и TOLLIP49. К категории убиквитин-независимых относятся связанные с органеллами рецепторы для ЭР-фагии (например, CCPG1, TEX264, FAM134B, SEC62, RTN3L и ATL3) и митофагии (например, BNIP3, BNIP3L/NIX, FUNDC1, FKBP8 и BCL2L13), а также LIR-содержащие растворимые белки, такие как CALCOCO1 (ссылка 49). Помимо распознавания грузов, LIR используются для набора некоторых основных факторов аутофагии, включая FIP200, ULK1 и ATG13 (ссылка 50), а также факторов привязки PLEKHM1 и EPG5 (ссылки 51,52). Как обсуждалось выше, определенные грузы могут также рекрутировать комплекс ULK, представляя собой еще один уровень распознавания груза (рис. 1а, "Инициация").



Таблица 2 Не-АТГ-молекулы в макроавтофагии и микроавтофагии

В дополнение к органеллам и отдельным белкам, жидкоподобные конденсаты, образующиеся при разделении фаз жидкость-жидкость, деградируют с помощью макроавтофагии полностью или по частям (так называемая флюидофагия)⁵³ (рис. 1d). Как показано при деградации конденсатов SQSTM1, прилипание жидкоподобных конденсатов к ATG8-положительным аутофагическим мембранам стимулируется эффектом смачивания мембраны⁵³.

Закрытие аутофагосомы происходит путем расщепления мембраны фагофора на внешнюю и внутреннюю аутофагосомные мембраны (рис. 1а). Этот процесс топологически идентичен отщеплению мембраны при формировании внутриклеточных пузырьков в мультивезикулярных тельцах и при почковании вируса на плазматической мембране. Действительно, как и эти два процесса, комплекс эндосомной сортировки, необходимый для транспорта (ESCRT), играет ключевую роль в закрытии аутофагосомы^54-56 (табл. 2). Как комплекс ESCRT локализуется на открытом ободе фагофора у млекопитающих остается неизвестным. Однако у дрожжей Rab5-зависимые взаимодействия между Atg17 и Snf7, компонентом ESCRT-III, могут объяснять привлечение ESCRT к фагофорам⁵⁵.

После закрытия аутофагосомы сливаются с лизосомами, превращаясь в аутолизосомы. У млекопитающих слияние опосредуется soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) STX17 и YKT6, которые рекрутируются в аутофагосомы, когда они закрываются^57,58 (Таблица 2), предотвращая тем самым преждевременное слияние между незакрытыми аутофагосомами и лизосомами. STX17 и YKT6 образуют пучки SNARE с цитозольным SNAP29 и лизосомальными VAMP7/VAMP8 и STX7, соответственно (рис. 1а, "Слияние лизосом"). Связь и функциональные различия между этими двумя аутофагосомными SNAREs (STX17 и YKT6) не очень хорошо изучены до сих пор; они по-видимому, функционируют избыточно. Роль YKT6 в слиянии аутофагосом сохраняется у дрожжей^59,60, но STX17 в дрожжах отсутствует. Связывание между аутофагосомами и лизосомами опосредуется несколькими факторами связывания, включая HOPS, PLEKHM1 и EPG5 (ссылка 61). PLEKHM1 (ссылка 51) и EPG5 (ссылка 52), они имеют мотив LIR и поэтому взаимодействуют с аутофагосомным ATG8.

После слияния с лизосомами внутренняя мембрана аутофагосом деградирует. У дрожжей аутофагосомы сливаются с большой вакуолью, высвобождая аутофагические тела, окруженные внутренними мембранами аутофагосом. Вакуолярная фосфолипаза Atg15 отвечает за деградацию мембран аутофагических тел (полученных из внутренней мембраны аутофагосом)⁶². Большинство организмов, включая млекопитающих, не имеют гомологов Atg15, но вместо этого обладают несколькими лизосомальными фосфолипазами, которые могут быть избыточно вовлечены в деградацию внутренней мембраны. Один из основных остающихся вопросов - как деградация ограничивается только внутренней мембраной, когда и внешняя, и внутренняя мембраны, происходящие из одной и той же мембраны фагофора, подвергаются воздействию лизосомальных ферментов.

После длительного голодания аутолизосомы деформируются, образуя протолизосомы, которые затем созревают в функциональные лизосомы в процессе, называемом аутофагической реформацией лизосом (ALR)⁶³ (рис. 1а, "Рециклинг"). Этот процесс рецикликлинга белков лизосомной мембраны запускается реактивацией mTORC1 в ответ на повышение уровня аминокислот вследствие длительной макроавтофагии. При индукции ALR PI(4)P 5-киназа PIP5K1B производит PI(4,5)P2 на мембране аутолизосом, создавая богатые PI(4,5)P2 микродомены, которые далее организуются клатрином и адапторным белком 2 (AP2)64 (Таблица 2). Белки лизосомной мембраны захватываются в этих микродоменах, которые впоследствии подвергаются тубуляции под действием тяжелой цепи кинезина KIF5B65. Механизм, посредством которого протолизосомы созревают в лизосомы, еще предстоит выяснить.

Недавно было сообщено о дополнительном механизме рециркуляции аутолизосом, который называется рециркуляция аутофагосомных компонентов (ACR)⁶⁶. Этот механизм повторного использования полученных аутофагосомами мембранофиксирующих белков, таких как ATG9 и STX17, посредством отпочкования аутолизосомальных мембран, осуществляется с помощью зависящих от комплекса рециклеров SNX4-SNX5-SNX17 и комплекса динеин-динактин (табл. 2) (рис. 1а, "Рециркуляция"). Таким образом, аутофагосомные и лизосомные мембранные белки утилизируются ACR и ALR, соответственно. ACR происходит раньше, чем ALR.

Хотя белки ATG были первоначально идентифицированы в дрожжах как факторы, необходимые для аутофагии, сейчас очевидно, что большинство из них также участвуют в не-автофагических процессах⁶⁷ (Таблица 1). Из-за недостатка места мы обсуждаем здесь лишь некоторые из этих функций. Многие из не-автофагических функций белков ATG связаны с динамикой мембран. BECN1 является компонентом не только PI3KC3-C1, но и PI3KC3-C2 (содержащего UVRAG вместо ATG14), который участвует в эндоцитарном пути. Опухоль-подавляющая активность BECN1, по крайней мере, частично объясняется его неавтофагической функцией в PI3KC3-C2 (ссылка 68). Другим хорошо известным не-автофагическим процессом является конъюгация ATG8 с одномембранными компартментами в эндоцитарном пути, а не с двухмембранными аутофагосомами, что известно как конъюгация ATG8 с эндолизосомальными одиночными мембранами (CASM) или одномембранная конъюгация ATG8 (SMAC), включая LC3-ассоциированный фагоцитоз (LAP) и LC3-ассоциированный эндоцитоз (LANDO)^69-71. LAP является одним из фагоцитотических путей и разрушает содержимое путем слияния с лизосомами. LAP не требует комплекса ULK, но требует системы конъюгации ATG. Примечательно, что повторяющийся домен WD40 ATG16L1, который отсутствует в дрожжевом Atg16 (Таблица 1), необходим для LAP через связывание с V-АТФазой, но не для канонической аутофагии^72-76. Также необходимы компоненты PI3KC3-C2 UVRAG и RUBCN. В недавнем исследовании сообщалось, что во время LAP (или CASM) ATG8 конъюгирует не только с PE, но и с фосфатидилсерином (PS)⁷⁷. Неизвестно, имеет ли ATG8-PS уникальную функцию, отличную от функции ATG8-PE. Секреторная аутофагия (нетрадиционная секреция на основе аутофагии) - это еще один тип не-автофагического процесса. При секреторной аутофагии закрытые аутофагосомы не сливаются с лизосомами, а сливаются с плазматической мембраной, секретируя цитозольные белки, не имеющие обычных лидерных последовательностей. Для формирования аутофагосом на этом пути необходимы белки ATG, а ингибирование слияния аутофагосом с лизосомами приводит к повышению секреторной аутофагии⁷⁸. Кроме того, гены, связанные с аутофагией, участвуют в вирусной репликации и передаче вирусов. Многие вирусы используют аутофагосом-подобные везикулы для репликации и экзоцитоза⁷⁹. Геномный скрининг CRISPR выявил TMEM41B и VMP1 в качестве факторов хозяина флавивирусов и коронавирусов, включая SARS-CoV-2, где они, как считается, участвуют в формировании специализированных репликационных органелл⁴³. Другие примеры не-автофагических процессов, связанных с мембранами, для которых требуются гены ATG, включают в себя перемещение из ЭР в Гольджи (ULK1 и ULK2)⁸⁰, защиту от пермеабилизации плазматической мембраны (ATG9A)⁸¹ и активацию TFEB при повреждении лизосом или активации лизосомного переходного рецепторного потенциала муколипинового канала 1 (TRPML1) (системы конъюгации ATG)^82-84. У апикомплексных паразитов, таких как Plasmodium и Toxoplasma, ATG8 (и системы конъюгации ATG) необходимы для биогенеза апикопластов^85,86, не-фотосинтезирующих пластид, специфичных для этой линии, которые поддерживают ключевые метаболические функции.

Гены ATG также могут регулировать различные процессы, не связанные с мембраной, такие как прогрессия клеточного цикла и клеточная гибель. ATG7 напрямую взаимодействует с p53, и клетки с дефицитом ATG7 демонстрируют нарушение остановки клеточного цикла и усиление апоптоза (оба процесса опосредованы p53) при голодании⁸⁷. ATG12 способствует апоптозу митохондрий путем связывания с белками семейства Bcl-2 и их инактивации⁸⁸. GABARAPs необходимы для опосредованного интерфероном γ (IFNγ) антимикробного ответа через связывание с фактором ADP-рибозилирования 1 (ссылка 89).

Микроавтофагия была впервые описана в клетках млекопитающих как процесс, включающий инвагинацию лизосомальных мембран, которые включают цитозольный материал в лизосомы, после чего происходит отделение мембраны и деградация^90,91 (рис. 2а). Поскольку наблюдение микроавтофагии в маленьких лизосомах затруднено с помощью световой микроскопии, лежащие в ее основе молекулярные механизмы были изучены в основном на дрожжах и растениях, где вакуоль достаточно велика для оптического наблюдения. Как и макроавтофагия, микроавтофагия может быть как неизбирательной, так и избирательной. Этот процесс неизбирательно захватывает цитозольный материал, но также избирательно распознает органеллы, такие как пероксисомы (микропексофагия), митохондрии (микромитофагия), липидные капли (микролипофагия), субдомен ЭР (микроЭР-фагия), часть ядра (микронуклеофагия) и фотоповрежденные хлоропласты (микрохлорофагия)^2,92,93. Микроавтофагия требует участия механизма ESCRT на этапе деления мембраны². Однако ее зависимость от белков ATG сложна и может различаться в зависимости от типа груза и индуцирующих условий. Хотя белки ATG, по-видимому, не требуются для общей микроавтофагии и микроЭР-фагии, по крайней мере, некоторые из белков ATG необходимы для микролипофагии^94-96, микропексофагии^97,98, микромитофагии⁹⁹ и микронуклеофагии^100,101 у дрожжей, а также микрохлорофагии¹⁰² у растений (рис. 2б). У млекопитающих микромитофагия и микролипофагия, по-видимому, не зависят от белков ATG^103,104, тогда как микронуклеофагия, опосредованная cGAS, требует системы сопряжения ATG8 для распознавания груза¹⁰⁵. Таким образом, микроавтофагию можно условно разделить на два типа: ATG-независимую и ATG-зависимую (рис. 2в). При последнем типе белки ATG могут участвовать в формировании дополнительных мембранных структур, ремоделировании морфологии вакуоли и/или распознавании селективных грузов (см. ниже)^2,92,93.

В клетках млекопитающих формирование мультивезикулярных тел эндосом считается одним из видов микроавтофагии, называемой эндосомальной микроавтофагией¹⁰⁶. Эндосомальная микроавтофагия происходит конститутивно, а также индуцируется в ранние периоды аминокислотного голодания, приводя к деградации цитозольных белков, особенно селективных адаптеров макроавтофагии, таких как SQSTM1, NDP52, NBR1, TAX1BP1 и NCOA4 (адаптер для ферритина)⁵ (рис. 2б). Известно, что путь мультивезикулярных тел у дрожжей также индуцируется голоданием и способствует раннему ремоделированию протеома во время голодания⁶. Индуцированная голоданием эндосомальная микроавтофагия у млекопитающих требует участия ESCRT-III (CHMP4B) и VPS4, но не ESCRT-0, -I или -II (ссылка 5). Необходимость белков ATG в этом пути также сложна. Система сопряжения ATG8 требуется для деградации SQSTM1 и NDP52, частично требуется для NBR1 и TAX1BP1, но не для NCOA4, тогда как FIP200 и VPS34 не требуются ни для одного из них⁵. Поэтому белки ATG в данном случае должны быть важны для распознавания груза, а не для динамики мембраны (рис. 2c).

Эндосомные везикулы внутри просвета, образованные микроавтофагией, направляются в лизосомы для деградации, но у млекопитающих они также секретируются во внеклеточное пространство. Несколько РНК-связывающих белков, включая HNRNPK и SAFB, включаются в эндосомальные интралюминальные везикулы посредством LC3-зависимого эндосомального микроавтофагического пути, называемого LC3-зависимой загрузкой и секрецией внеклеточных везикул (LDELS)¹⁰⁷. Этот процесс отличается от канонической эндосомальной микроавтофагии тем, что он не зависит от ESCRTs; однако он зависит от церамида, производимого нейтральной сфингомиелиназой 2 (nSMase2, также известной как SMPD3), которая является альтернативным путем инвагинации эндосомальной мембраны (Таблица 2).

Для распознавания груза ATG-зависимая микроавтофагия у дрожжей использует Atg8 и/или Atg11, которые взаимодействуют с селективными макроавтофагическими рецепторами, связанными с органеллами, включая Atg30 в микропексофагии¹⁰⁸ и Atg39 в микронуклеофагии¹⁰¹ (часть (1) рис. 2b,c). Кроме того, у млекопитающих ER-фагический рецептор SEC62 опосредует микроЭР-фагию в зависимости от связывания ATG8¹⁰⁹.

В отличие от этого, распознавание груза при ATG-независимой микроавтофагии не очень хорошо изучено. Возможно, важную роль играет формирование специфических субдоменов. Например, при микроЭР-фагии у дрожжей мембрана ЭР образует мультиламеллярные витки, состоящие из свободной от рибосом мембраны ЭР, которая подвергается микроавтофагии¹¹⁰. У Schizosaccharomyces pombe микроавтофагия используется для пути биосинтеза вакуолярных ферментов, названного Nbr1-опосредованным путем вакуолярного целенаправленного воздействия (NVT) (часть (2) рис. 2b,c), который функционально сходен с путем целенаправленного воздействия из цитоплазмы на вакуоль (Cvt) у S. cerevisiae, но использует другой маршрут^8,111. Этот путь не зависит от белков ATG, но требует Nbr1 для распознавания своих грузов, таких как аминопептидазы (Ape2, Ape4 и Lap2) и α-маннозидаза (Ams1). В NVT-пути привлечение Nbr1 к эндосомным мембранам опосредуется убиквитином⁸, что резко отличается от процесса макроавтофагии, при котором NBR1 млекопитающих (или его дрожжевой гомолог Atg19) привлекает ATG8.

В клетках млекопитающих жидкоподобные конденсаты ферритин-NCOA4 подвергаются макроавтофагии и эндосомальной микроавтофагии, обе из которых требуют TAX1BP1 для их включения^112,113. Поскольку TAX1BP1 взаимодействует с NCOA4, TAX1BP1 может связывать аутофагосомные конденсаты ATG8 и ферритин-NCOA4 в процессе макроаутофагии. Однако механизм, посредством которого TAX1BP1 опосредует включение конденсатов ферритина-NCOA4 в эндосомы, еще предстоит выяснить, поскольку он в значительной степени не зависит от ATG8 (ссылка 5).

В процессе эндосомальной микроавтофагии у млекопитающих распознавание грузов осуществляется, в частности, цитозольным шапероном HSC70/HSPA8 (часть (3) рис. 2б,в)¹⁰⁶. HSC70 распознает KFERQ-подобный мотив, содержащийся в селективных грузах, и включает их в эндосомы (KFERQ-подобный мотив был первоначально идентифицирован как сигнал для шаперон-опосредованной аутофагии¹¹) (рис. 2б). В этом процессе HSC70 связывается с PS на эндосомной мембране через свой катионный домен и вызывает внутреннюю деформацию мембраны^106,114. Эта KFERQ-зависимая эндосоманая микроавтофагия также сохранилась у дрозофилы, несмотря на отсутствие у нее шаперон-опосредованной аутофагии¹¹⁵. Примечательно, что этот путь требует Atg1 и Atg13, но не Atg5, Atg7 или Atg12.

В LDELS ATG8 необходим для распознавания LIR-последовательности РНК-связывающих белков, таких как HNRNPK и SAFB107. Инвагинация мембраны происходит даже без липидирования ATG8, но образующиеся в результате везикулы внутри просвета не содержат селективных грузов. Как ATG8 транслоцируется в эндосомы, неизвестно. Возможно, используется механизм, подобный LAP. Другой вопрос, требующий изучения, заключается в том, почему только подмножество грузов для микроавтофагии зависит от ATG8 для распознавания как в ESCRT-зависимой эндосомной микроавтофагии, так и в LDELS.

Учитывая важнейшую роль аутофагии в различных физиологических процессах, включая стрессовые реакции и внутриклеточная очистка, было высказано предположение, что аутофагия вовлечена в патогенез заболеваний человека. Однако определить, какие заболевания связаны с изменениями в аутофагии, сложно из-за отсутствия методов измерения аутофагической активности у человека. Тем не менее, недавние генетические исследования выявили ряд мутаций в генах, связанных с аутофагией, ассоциированных с заболеваниями человека, что позволяет предположить, что изменение аутофагии способствует развитию этих заболеваний. Более того, исследования с использованием мышей с острым системным нокаутом Atg7 и нокаутом Fip200^116,117 и мышей с системным нокаутом Atg5 с сохранением мозга¹¹⁸ показывают, что к органам, наиболее восприимчивым к дефициту аутофагии, относятся нервная система, иммунная система, печень и кишечник. В соответствии с этими выводами, эти ткани часто поражаются при заболеваниях, связанных с генами аутофагии (табл. 3,4). В этом разделе обсуждаются мутации и полиморфизмы генов, вовлеченных в общую и селективную аутофагию. Однако важно учитывать, что, как подчеркивалось выше, большинство этих генов аутофагии также имеют неавтофагические функции (табл. 1). Поэтому выявление мутаций в генах аутофагии не указывает непосредственно на дефект канонической аутофагии в фенотипе заболевания. Вовлечение не-автофагической функции всегда должно учитываться при интерпретации этих мутаций.

Таблица 3 Менделевские заболевания, ассоциированные с мутациями генов, связанных с аутофагией



Таблица 4 Связанные с аутофагией гены факторов риска при заболеваниях человека

Заболевания, связанные с аутофагией, включают менделевские нарушения, вызванные мутациями в генах аутофагии (Таблица 3). Наиболее часто поражаемой тканью, по-видимому, является нервная система. Было установлено, что гомозиготные мутации в ATG5 и ATG7 связаны с неврологическими заболеваниями человека^119,120. При этих заболеваниях аутофагия подавляется, но только частично, поскольку можно обнаружить небольшое количество либо конъюгата ATG12-ATG5, либо LC3-II (липидированная форма). У пациентов с этими заболеваниями, возникшими в результате мутаций в ATG5 и ATG7, наблюдаются некоторые совпадающие фенотипы, включая атаксию и задержку развития. У пациентов с мутациями ATG7 также наблюдается аномальное строение мозжечка и мозолистого тела и лицевой дисморфизм (неизвестно, есть ли эти аномалии у пациентов с мутациями ATG5). SQSTM1 накапливается в клетках, полученных в стационаре, что подтверждает снижение аутофагического потока^119,120.

Мутации в семействе белков PROPPIN также вызывают нейродегенеративные заболевания, но их фенотипы несколько отличаются. Гомозиготная мутация в WIPI2 была обнаружена у пациентов со сложным нарушением развития, известным как интеллектуальное нарушение развития с коротким ростом и вариабельными скелетными аномалиями (IDDSSA)^121-124. Обнаруженная мутация Val249Met снижает связывание WIPI2-ATG16L1 и аутофагический поток¹²³. Гомозиготные нонсенс-мутации в WDR45B/WIPI3 вызывают расстройство нейрального развития со спастической квадриплегией и аномалиями мозга с судорогами или без них (также называемое синдромом El-Hattab-Alkuraya )^125-128. Ген WDR45/WIPI4 находится на Х-хромосоме, и его гетерозиготные мутации у женщин и гемизиготные мутации у мужчин вызывают β-propeller белок-ассоциированную нейродегенерацию (BPAN; первоначально называлаль статической энцефалопатией детства с нейродегенерацией во взрослом возрасте)^129-131. Это двухфазное заболевание, которое проявляется в младенческом возрасте непрогрессирующей психомоторной задержкой, эпилепсией и аутизмом, а также в подростковом возрасте дистонией, паркинсонизмом и деменцией. Накопление железа в globus pallidus и substantia nigra является одним из отличительных признаков этого заболевания, но его связь с ферритинофагией неясна, поскольку накопление железа не было зарегистрировано при других заболеваниях, связанных с мутациями генов аутофагии. Учитывая, что делеция WIPI3 или WIPI4 подавляет аутофагию лишь незначительно по сравнению с делецией WIPI2, ATG5 или ATG7 (N.M., неопубликованные результаты), можно предположить, что дефекты еще неизвестных неаутофагических функций WIPI3 и WIPI4 могут объяснять тяжелый фенотип, наблюдаемый при этих заболеваниях.

Мутации в генах, связанных с селективной аутофагией, также вызывают заболевания (табл. 3). Гены PARK2/PRKN (кодирующий Parkin) и PARK6/PINK1, связанные с митофагией, мутируют при семейной болезни Паркинсона с ювенильной формой¹³². Parkin, убиквитин-лигаза, убиквитинирует различные белки в деполяризованных митохондриях PINK1-зависимым образом, рекрутируя адаптеры аутофагии, такие как NDP52 (ссылка 16) и OPTN (рис. 1а, "инициация")²³. Хотя Parkin- и PINK1-зависимая митофагия четко наблюдается в культуре клеток, ее физиологическая значимость изначально была неясна, поскольку мыши с нокаутом Prkn или Pink1 демонстрируют почти нормальный базальный уровень митофагии без явного фенотипа в обычных условиях^133,134. Однако недавние исследования показали, что у пожилых мышей с нокаутом Prkn развиваются локомоторные нарушения, связанные с потерей дофаминергических нейронов¹³⁵. Кишечная инфекция также может способствовать нейродегенерации у мышей с нокаутом Prkn¹³⁶. Более того, Parkin- и PINK1-зависимая митофагия физиологически важна для подавления выброса митохондриальной ДНК в цитозоль и последующего воспаления в условиях стресса in vivo^137,138. Напротив, согласно другому сообщению, PINK1-зависимая митофагия в эндотелиальных клетках может быть провоспалительной через высвобождение митохондриальных формиловых пептидов¹³⁹. Таким образом, патофизиологическая роль Parkin- и PINK1-зависимой митофагии может зависеть от типа клеток или контекста. Мутации в адаптерах аутофагии, таких как SQSTM1 (ссылка 140) и рецептор ЭР-фагии FAM134B¹⁴¹, также встречаются при нейродегенерации, развивающейся в детском возрасте, и наследственной сенсорной и вегетативной нейропатии II типа, соответственно, предполагая, что дефекты селективной аутофагии могут быть причиной этих заболеваний (Таблица 3).

Хотя перечисленные выше заболевания являются рецессивными, некоторые из них наследуются доминантно, к ним относятся amyotrophic lateral sclerosis (ALS), frontotemporal dementia (FTD) (эти два заболевания часто ассоциированы) и костная болезнь Paget. Аутосомно-доминантные мутации в селективных генах, связанных с аутофагией, SQSTM1, OPTN и TBK1, обнаруживаются в ассоциации с этими заболеваниями (Таблица 4). TBK1 фосфорилирует и регулирует OPTN, но в дополнение к этой канонической роли TBK1 также может напрямую привлекать комплекс PI3KC3-C1 в OPTN-зависимую митофагию¹⁴². В целом, многие генные мутации, связанные с ALS/FTD, например, мутации в SOD1 и TARDBP (кодирующей TDP-43), считаются мутациями усиления функции и наследуются доминантно^143,144. Однако связанные с ALS/FTD мутации OPTN и TBK1, вероятно, являются мутациями с потерей функции¹⁴⁴. При ALS с мутациями OPTN были зарегистрированы как аутосомно-рецессивный, так и доминантный типы наследования¹⁴⁵. Таким образом, гаплонедостаточность OPTN и TBK1 может вносить свой вклад в спектр ALS/FTD. Хотя некоторые мутации, связанные с ALS/FTD, влияют на адапторную функцию SQSTM1, OPTN и TBK1 (ссылки 146,147), остается неизвестным, является ли это общим механизмом. Патогенные эффекты этих мутаций могут быть опосредованы их не-автофагическими функциями; например, ось TBK1-OPTN также важна для врожденного иммунитета и RIPK1-зависимых путей клеточной гибели¹⁴⁴. Однако нельзя полностью исключить гипотезу усиления функции. Особый интерес представляет тот факт, что, как и другие связанные с ALS белки¹⁴⁸ , адаптеры аутофагии, такие как SQSTM1 (ссылки 149-151) и OPTN¹⁵² , образуют жидкоподобные биомолекулярные конденсаты. Мутации этих генов могут проявлять некоторое усиление токсичности.

Хотя большинство менделевских расстройств, связанных с мутациями генов аутофагии, относятся к нервной системе, существуют некоторые заболевания, затрагивающие другие ткани и органы (табл. 3). Примером является костная болезнь Paget, которая характеризуется одним или несколькими очагами с повышенным ремоделированием кости. Среди генов, вызывающих это заболевание, основным является SQSTM1, однако остается неясным, участвует ли его функция адаптера аутофагии в патогенезе этого заболевания^153,154.

Вторая категория включает заболевания, предрасположенность к которым связана с полиморфизмом генов, связанных с аутофагией (Таблица 4). Основным геном аутофагии, который, как было впервые показано в ходе исследования геномной ассоциации (GWAS), связан с заболеваниями человека, является ATG16L1; однонуклеотидный полиморфизм, приводящий к замене Thr300Ala (T300A), является фактором риска развития болезни Crohn's^155,156; Thr300 расположен непосредственно перед доменом повтора WD40 (Таблица 1). У мышей с нокаутом Atg16L1T300A наблюдаются аномалии клеток Панета в кишечнике¹⁵⁷ и микробиоты кишечника¹⁵⁸. Повторяющийся домен WD40 в ATG16L1 необходим для LAP, но не для канонической аутофагии⁷²; однако влияние замены T300A на аутофагию и LAP относительно невелико или не обнаруживается^157,159,160. Тем не менее, возможно, что аутофагия связана с болезнью Крона, поскольку это заболевание также было связано с другими генами аутофагии (ULK1, ATG9A, NDP52 и ATG4C)^161-164. Однако тот факт, что ATG16L2, который считается ненужным для аутофагии^165,166, также связан с болезнью Крона¹⁶⁷ , это позволяет предположить, что здесь может быть задействована еще неизвестная не-автофагическая функция, общая для ATG16L1 и ATG16L2.

Гены аутофагии, такие как ATG5, ATG7 и MAP1LC3B, также были идентифицированы как гены предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям, включая systemic lupus erythematosus (SLE)¹⁶⁸ (Таблица 4). Это может отражать роль аутофагии в контроле качества митохондрий для подавления высвобождения из митохондрий ассоциированных с повреждениями молекулярных паттернов, вызванных SLE^169,170. В дополнение к канонической аутофагии, эти гены также необходимы для LAP. Поскольку LAP важна для выработки интерферона в ответ на включение ДНК-содержащих иммунных комплексов¹⁷¹ , роль генов аутофагии в LAP может быть связана с их генетической ассоциацией с аутоиммунными заболеваниями. Также была выявлена ассоциация ATG16L2 с SLE, но роль ATG16L2 в LAP остается неясной.

Секвенирование целых экзомов и последующий поиск миссенс-вариантов у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени выявили обогащение вариантов Phe426Leu и Val471Ala ATG7 (ссылка 172); оба варианта являются мутациями с потерей функции. Однако эти данные не согласуются с результатами, полученными на мышах, показывающими, что потеря аутофагии вместо этого подавляет стеатоз печени¹⁷³. Таким образом, частично сниженная аутофагическая активность у людей может оказывать воздействие на печень, отличное от того, которое вызывает полная потеря аутофагии, наблюдаемая у мышей с нокаутом гена аутофагии.

Взаимосвязь между аутофагией и раком привлекает большое внимание. Однако, несмотря на многочисленные сообщения о связи конкретных опухолей с однонуклеотидными полиморфизмами генов аутофагии, рецидивирующие или драйверные мутации основных генов аутофагии в раковых опухолях человека встречаются довольно редко¹⁷⁴. Таким образом, аутофагия может оставаться функциональной в большинстве видов рака и даже играть важную роль. В самом деле, исследования на мышах показали, что, хотя делеция генов аутофагии может способствовать опухолеобразованию, она также влияет на рост опухоли либо через клеточно-автономные, либо через неавтономные механизмы¹⁷⁵. Тем не менее, мутации в основных генах ATG могут быть связаны с семейными раковыми заболеваниями. Например, исследование связи выявило ассоциацию зародышевой нонсенс-мутации ATG7 (c.2000C>T p.Arg659*) с семейной холангиокарциномой¹⁷⁶. В раковых клетках соматическая делеция ATG7 происходит в комплементарном аллеле, что приводит к полному ингибированию аутофагии. Этот случай позволяет предположить, что подавление аутофагии может быть опухолегенным и у человека.

Четверть века прошло с тех пор, как в 1997 году в дрожжах был клонирован первый ген аутофагии ATG1, названный вначале APG1 (ссылка 177). За это время наше понимание молекулярной биологии, лежащей в основе аутофагии, росло экспоненциально. В частности, последние структурно-биологические подходы предоставили решающие доказательства для объяснения уникальной мембранной динамики аутофагии на молекулярном уровне. Однако, несмотря на все большую ясность функций отдельных генных продуктов аутофагии, несколько ключевых вопросов клеточной биологии остаются без ответа. Например, каков механизм однонаправленного транспорта липидов из ЭР в аутофагосомы? Как регулируется размер аутофагосом? Как регулируется время слияния аутофагосомы с лизосомой? Для решения этих вопросов будут полезны новые подходы, включая биофизику, теоретическое моделирование и моделирование молекулярной динамики.

Хотя мы стремились обобщить последние знания о микроавтофагии, наши усилия могут показаться неполными, поскольку ее механизмы все еще менее понятны, чем механизмы макроавтофагии. Интригует тот факт, что некоторые белки ATG (например, ATG8) и селективные адаптеры аутофагии (например, NBR1) используются как макроавтофагией, так и микроавтофагией. Выполняют ли эти молекулы сходные функции в обоих путях, предстоит выяснить в ходе будущих исследований. Кроме того, некоторые грузы (например, ферритин) избирательно деградируют по обоим путям, но механизмы регуляции сортировки остаются неизвестными. Дальнейшие исследования позволят получить более полную картину аутофагии.

Как мы уже упоминали выше, одним из очевидных узких мест в исследованиях аутофагии является отсутствие методов мониторинга аутофагии у человека. Было бы идеально, если бы мы могли оценить аутофагическую активность путем измерения некоторых метаболитов (то есть биомаркеров) в крови или моче, которые выделяются через пути, зависящие от аутофагии. Альтернативными методами могут быть неинвазивные методы визуализации, такие как флуоресцентная молекулярная томография¹⁷⁸ и позитронно-эмиссионная томография¹⁷⁹.

Наконец, хотя было установлено, что многие заболевания связаны с мутациями генов аутофагии или ассоциированы с полиморфизмами генов аутофагии, фенотипы этих заболеваний разнообразны. Таким образом, до сих пор трудно предложить единое объяснение их патогенеза. Это может быть связано с комплементацией гомологов, различиями в тканевой экспрессии и вовлечением не-автофагических функций. Для выявления точных механизмов, с помощью которых дефекты генов аутофагии вызывают широкий спектр заболеваний человека, потребуются дополнительные исследования.