Исследования длинных не-кодирующих РНК (lncRNAs), ранее не предполагавшегося как основного продукта геномов сложных организмов, с самого начала были сопряжены с неопределенностью и спорами. lncRNAs имеют досадную особенность называться не тем, чем они являются. Такое вольное описание берет свое начало в убеждении, что основная роль РНК заключается в том, что она является посредником между геном и белком, а другие "хозяйственные" не-кодирующие РНК, такие как рибосомные РНК (рРНК), transfer RNAs (tRNAs), small nucleolar RNAs (snoRNAs), сплайсосомные РНК и другие малые ядерные РНК (snRNAs), являются вспомогательными для этой функции.

Широкое признание РНК в качестве регуляторной молекулы произошло в первые годы первого десятилетия XXI века с неожиданного открытия большого количества малых интерферирующих РНК (siRNAs), микроРНК (miRNAs) и малых PIWI-взаимодействующих РНК (piRNA), регулирующих - через белки семейство Argonaute - экспрессию генов на транскрипционном, пост-транскрипционном и трансляционном уровнях у эукариот¹, хотя в литературе встречались примеры и других малых регуляторных РНК, особенно у бактерий². Несколько длинных регуляторных РНК, в частности meiRNA у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe, hsrω, РНК на Х1 (roX1) и roX2 у Drosophila melanogaster, а также H19 и Х-неактивный специфический транскрипт (XIST) у млекопитающих, также были зарегистрированы в предыдущие годы^3-7, но они рассматривались скорее как странности, чем как ранние примеры общего явления. Более того, малые регуляторные РНК не нарушали концептуальную схему, согласно которой большинство генов кодируют белки, а, скорее, удобно вписывались в нее. Однако позже выяснилось, что, хотя некоторые миРНК образуются из интронов пре-мРНК⁸, не-кодирующие первичные транскрипты миРНК и snoRNAs также могут иметь свои функции^9,10 и что рРНК, тРНК и snoRNAs обрабатываются для образования малых регуляторных РНК, включая миРНК^11-14, в некоторых случаях способствуя трансгенерационному эпигенетическому наследованию¹⁵.

Еще больший сюрприз и вызов господствующему пониманию генетической информации был сделан в начале и середине первого десятилетия XXI века, когда глобальный транскриптомный анализ, призванный лучше определить протеом, показал, что большая часть генома животных и растений динамически транскрибируется в более длинные РНК, которые имеют небольшой потенциал для кодирования белков^16-19 или не имеют его вовсе. Это удивление было усугублено сопутствующим открытием, что количество и, в значительной степени, репертуар генов, кодирующих белки, одинаковы у животных, сильно различающихся по уровню развития и когнитивной сложности - нематодный червь Caenorhabditis elegans (состоящий из ~1000 соматических клеток) и человек (~30 x 10¹² соматических клеток²⁰) имеют ~20 000 генов, кодирующих белки, что было названо "парадоксом g-значения "²¹. Напротив, объем не-кодирующей ДНК и, соответственно, транскрипция не-кодирующих РНК увеличивается с ростом сложности развития²².

Понятно, что общей первоначальной реакцией сообщества молекулярных биологов было подозрение, что эти необычные РНК являются транскрипционным шумом, поскольку они обычно имеют низкий уровень хранения последовательности, низкий уровень экспрессии и малозаметны в генетических скринингах. Однако с тех пор количество публикаций, сообщающих о динамической экспрессии и биологических функциях lncRNAs, резко возросло, чему способствовало развитие технологий, позволивших идентифицировать и охарактеризовать их, хотя лишь меньшинство lncRNAs имеют уверенные аннотации и очень немногие - механистическую информацию. Осознание того, что геномы растений и животных экспрессируют большое количество lncRNAs, требует создания основы для их классификации и понимания их функций и, что более важно, переоценки объема и типа информации, необходимой для программирования развития сложных организмов.

Здесь мы представляем современную и последовательную картину роли lncRNAs в биологии клетки и развития, определяем ключевые вопросы в понимании их функций и намечаем дальнейший путь. Мы рассматриваем определение lncRNA, номенклатуру, сохранение, экспрессию, фенотипическую видимость, функциональные анализы и молекулярные механизмы, охватывающие связи lncRNA с архитектурой хроматина, эпигенетическими процессами, функцией энхансеров и биомолекулярными конденсатами, а также роль lncRNA за пределами ядра. Мы утверждаем, что локусы, экспрессирующие lncRNAs, должны быть признаны настоящими генами, и обсуждаем взаимосвязь структуры и функции lncRNAs как средство для разбора механизмов и путей. Наконец, мы определили текущие проблемы и предложили рекомендации для понимания взаимосвязи lncRNAs с архитектурой генома, регуляцией генов и клеточной организацией.

Авторы данного Консенсусного заявления были предложены по рекомендациям коллег. Консенсус был достигнут путем групповой переписки по электронной почте и обсуждения.

lncRNA были произвольно определены как не-кодирующие транскрипты длиной более 200 нуклеотидов (200 nt), что является удобной границей размера в биохимических и биофизических протоколах очистки РНК, которые истощают большинство инфраструктурных РНК, таких как 5S рРНК, тРНК, snRNAs и snoRNAs, а также миРНК, siRNAs и piRNAs²³. Это определение также исключает некоторые другие известные короткие РНК, такие как специфические для приматов snaRs (~80-120 nt), которые ассоциируются с ядерным фактором 90 (24); Y РНК (~100 nt), которые выступают в качестве каркасов для рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов²⁵; vault РНК (88-140 nt), которые участвуют в переводе внеклеточных стимулов во внутриклеточные сигналы²⁶; а также промотор-ассоциированные РНК и не-канонические малые РНК, образующиеся в результате пост-транскрипционной обработки^27,28,29. Другие не-кодирующие РНК находятся вблизи 200-nt границы, такие как 7SK (~330 nt у позвоночных), которая контролирует стабилизацию и прекращение транскрипции, в том числе на энхансерах^30,31, и 7SL (~300 нт), которая является неотъемлемым компонентом частицы распознавания сигналов, нацеливающей белки на клеточные мембраны³², и эволюционным предком широко распространенных у приматов Alu (~280 nt) и грызунов B1 (~135 nt) малых пересекающихся ядерных элементов^33-35. Учитывая эту серую зону размеров, мы поддерживаем предложение разделить не-кодирующие РНК на три категории³⁶: (1) малые РНК (менее 50 nt); (2) транскрипты РНК-полимеразы III (Pol III) (такие как тРНК, 5S рРНК, 7SK, 7SL и Alu, vault и Y РНК37), транскрипты Pol V у растений и малые транскрипты Pol II, такие как (большинство) snRNAs и интрон-производные snoRNAs^38,39 (~50-500 nt); и (3) lncRNAs (более 500 nt), которые в основном генерируются Pol II.

Многие lncRNAs подвергаются сплайсингу и полиаденилированию, что привело к их описанию как "мРНК-подобных". Однако другие lncRNAs не полиаденилированы или capped с помощью 7-метилгуанозина^19,40-42, экспрессируются с промоторов с помощью Pol I (5.8S, 28S и 18S рРНК) или Pol III, или возникают из предшественников, включая интроны и повторяющиеся элементы, что привело к более агностическому описанию "транскрипты неизвестной функции"⁴³. По отношению к белок-кодирующим генам, lncRNA могут быть "межгенными", анти-смысловыми или интронными. Они также происходят от "псевдогенов", которые часто встречаются в геномах метазоа⁴⁴, причем более 10 000 псевдогенов идентифицировано в геноме мыши⁴⁵ и почти 15 000 идентифицировано в геноме человека⁴⁶, некоторые из которых оказались функциональными^44,47. К lncRNAs также относятся кольцевые РНК, образующиеся в результате обратного сплайсинга кодирующих и не-кодирующих транскриптов, также с продемонстрированными функциями⁴⁸, и транс-действующие регуляторные РНК, образующиеся из последовательностей, которые обычно выступают в качестве 3' не-транслируемых областей мРНК⁴⁹.

Комитет по номенклатуре генов HUGO, консорциум GENCODE и другие организации предпринимали многочисленные попытки создания номенклатуры и классификации lncRNAs, преимущественно на основе их геномного положения и ориентации относительно белок-кодирующих генов^46,50-53. Связь с близлежащими генами была полезна, поскольку она обеспечивает контекст и иногда дает подсказки о функции lncRNA, например, в регуляции экспрессии этих генов, как это часто происходит с энхансерами (см. далее), хотя не следует полагать, что активность энхансеров направлена на самые близкие гены.

Многие первые исследования были посвящены длинным межгенным не-кодирующим РНК (lincRNAs), последовательности которых не пересекаются с близлежащими локусами, кодирующими белки, из-за необходимости отличать их функции от функций белков. Однако многие другие lncRNAs перекрывают белок-кодирующие локусы или экспрессируются из закрытых интронов. Более того, традиционный взгляд на геномы как на линейные структуры дискретных белок-кодирующих генов не позволяет учесть открытие того, что эукариотическая транскрипция, наиболее характерная для человека и модельных организмов, представляет собой нечеткий континуум⁵⁴ , с "генами" внутри генов, генами, чередующимися с другими генами, и некодирующими транскриптами, перекрывающимися или возникающими внутри них^18,43,55 , что в совокупности представляет собой растущую проблему для аннотаций геномов.

Например, у человека и D. melanogaster многие гены, кодирующие белки, имеют 5 экзонов, которые включаются в мРНК в раннем эмбриогенезе и располагаются на сотни килобаз выше обычного первого экзона, минуя многие другие гены в промежуточном регионе⁵⁶. Действительно, любое основание может быть экзонным, интронным или "межгенным", в зависимости от транскрипционной активности клетки в любой момент ее траектории развития или физиологического состояния⁵⁵. По этой причине, если только lncRNA не является анти-смысловой по отношению к белок-кодирующему гену, мы рекомендуем называть lncRNAs по их собственному усмотрению с намеком на определенную характеристику или функцию (как это традиционно делается для белков), например, XIST, анти-смысловая не-кодирующая белок РНК IGF2R57 (AIRN), анти-смысловая межгенная РНК HOX58 (HOTAIR), Gomafu ("пятнистый узор" в японском языке; также известная как Miat)⁵⁹, COOLAIR (относящаяся к яровизации растений)⁶⁰ и регулируемая ауксином промоторная петля⁶¹ (APOLO), для облегчения запоминания, предпочтительно в сопровождении полных структур экзонов-интронов и геномных координат. Если биологический контекст отсутствует, мы рекомендуем называть lncRNAs в соответствии с системой GENCODE⁴⁶.

Широкий спектр функций "не-кодирующих" РНК не позволяет однозначно отнести их к определенным классам РНК: некоторые из них действуют локально, другие - на расстоянии, или и то, и другое⁶². В отсутствие более конкретной классификации мы рекомендуем сохранить общий дескриптор "lncRNA", отмечая, что большинство из них играют ту или иную регуляторную или архитектурную, часто связанную, роль в биологии клетки и развитии, а также потому, что существует множество исторических статей, в которых используется этот термин или его вариации. Некодирующие РНК бывают всех форм и размеров, и их территория огромна, она охватывает большую часть генома и множество функций. Некоторые РНК выполняют двойную функцию - кодирующую и регуляторную, а некоторые, возможно многие, цитозольные lncRNAs кодируют небольшие пептиды^63-66. Локусы, кодирующие белки, также экспрессируют lncRNAs посредством альтернативного сплайсинга^67-69, и, что удивительно, основной транскрипт, продуцируемый ~17% локусов, кодирующих белки человека, является не-кодирующим⁷⁰. Действительно, как гены lncRNA, так и гены мРНК могут производить транскрипты, которые функционируют после различных уровней обработки. Не-сплайсированные транскрипты, сплайсированные транскрипты, кольцевые РНК, интронные РНК и образующиеся из них стабильные малые РНК могут иметь определенную функцию^48,71,72. Любая РНК может быть регуляторной, и любой локус может кодировать как белок-кодирующие, так и регуляторные РНК.

Зарегистрировано более 100 000 человеческих lncRNA^52,73, многие из которых характерны для приматов⁷⁴. Этот список крайне неполный из-за ограниченного анализа различных клеток на разных стадиях развития (см. далее). В настоящее время существуют сотни тысяч каталогизированных lncRNAs и десятки баз данных (и баз данных о базах данных) с curated информацией^75-80. За последнее десятилетие появилось ~50 000 публикаций с ключевым термином "длинные не-кодирующие РНК" и более 2000 публикаций, в которых сообщается о подтвержденных функциях lncRNA⁸¹, хотя большинство из них еще не получили детального исследования.

Далее мы сосредоточимся на lncRNAs, полученных из первичных транскрипционных единиц Pol II (и используем этот термин в данном контексте), в отличие от других не-кодирующих РНК, которые экспрессируются с промоторов Pol I или Pol III, подвергаются процессингу из интронов (которые, следует отметить, составляют большую часть не-кодирующих РНК у млекопитающих и других организмов^41,82-84) или образуются путем обратного сплайсинга, хотя многие могут быть использованы из тех же соображений .

Большинство lncRNAs менее консервативны среди видов, чем последовательности мРНК, кодирующие протеом. Первоначально считалось, что большая часть генома млекопитающих (включающая большинство локусов lncRNAs) эволюционирует нейтрально, используя показатель скорости расхождения общих "древних повторов" (происходящих от транспозонов) между геномами человека и мыши, исходя из предположения, что эти последовательности нефункциональны и важны для первоначального распределения в предке⁸⁵. Однако появляется все больше доказательств того, что транспозиционные элементы широко используются в качестве функциональных элементов экспрессии и структуры генов, формируя промоторы, регуляторные сети, экзоны и сплайс-переходы в белок-кодирующих генах и lncRNAs^86-89, и поэтому их нельзя использовать в качестве индексов нейтральной эволюции.

Известно, что регуляторные последовательности, включая промоторы и lncRNAs, быстро эволюционируют из-за более мягких структурно-функциональных ограничений, чем белок-кодирующие последовательности, и из-за положительного отбора в ходе адаптивного распространения (radiation)^85,90-92. Многие lncRNAs специфичны для клеточных линий. Действительно, учитывая их связь с энхансерами развития (см. далее), вариации в комплементе и последовательностях lncRNAs могут быть основным фактором видового разнообразия.

Локусы, экспрессирующие lncRNAs, обладают многими характеристиками белок-кодирующих генов, включая промоторы, множество экзонов, альтернативный сплайсинг, характерные хроматиновые сигнатуры, регуляцию морфогенами и обычными транскрипционными факторами, изменение экспрессии при раке и других заболеваниях^74,93-98, а также диапазон периодов полураспада, аналогичный мРНК⁹⁹.

Промоторы lncRNAs демонстрируют уровень сохранения, сравнимый с уровнем сохранения белок-кодирующих генов^18,74. lncRNAs также имеют консервативные структуры экзонов, сплайс-соединения и участки последовательности^18,74,93,97, и они сохраняют ортологичные функции, несмотря на быструю эволюцию последовательности^100-102. Действительно, низкая сохранность последовательности может вводить в заблуждение.

lncRNA из telomerase RNA template component (TERC), необходимого для поддержания теломер - жизненно важной клеточной функции - сильно различается по размеру и последовательности, но имеет консервативную структурную топологию от дрожжей до млекопитающих, хотя и с некоторыми вариациями, и консервативное каталитическое ядро^103-108 (см. также далее). Компенсация дозы Х-хромосомы у Drosophila spp. требует формирования ядерного домена путем разделения фаз с помощью lncRNAs roX1 и roX2, взаимодействующих с внутренне неупорядоченной областью (IDR) специфического белка-партнера, мужского полового летального белка 2 (MSL2). Замена IDR млекопитающего ортолога MSL2 на IDR белка D. melanogaster и экспрессия roX2 достаточны для возникновения эктопической компенсации дозы Х-хромосомы в клетках млекопитающих, показывая, что взаимодействие IDR roX-MSL2 является основным детерминантом компартментализации Х-хромосомы и что такие взаимодействия сохраняются на огромных эволюционных расстояниях¹⁰⁹. Аналогичные процессы вовлечены в регуляцию компенсации доз Х-хромосомы у плацентарных млекопитающих с помощью XIST, который выполняет несколько функций, включая отталкивание эухроматических факторов, образование новых гетерохроматических факторов и реорганизацию структуры хромосомы^110-113.

Хотя существуют исключения (например, транскрипт 1 аденокарциномы легких, ассоциированный с метастазами (MALAT1; также известен как NEAT2), который является одним из наиболее распространенных транскриптов от Pol II в клетках позвоночных¹¹⁴, и транскрипт 1 сборки ядерного paraspeckle (NEAT1); см. далее), lncRNAs обычно демонстрируют более ограниченный характер экспрессии, чем мРНК^74,115, и часто являются высоко клеточно-специфичными¹¹⁶, что согласуется с их ролью в определении состояния клетки и траектории развития. Они также имеют специфическое субклеточное расположение, чаще всего ядерное, хотя значительная их часть находится в цитоплазме⁷⁵. Хотя иногда утверждается, что в человеке существует несколько сотен типов клеток, широкие классификации скрывают тот факт, что каждая клетка занимает определенное место в онтогенезе развития, экспресси это иллюстрируется дифференциальной экспрессией генов HOX в поверхностно похожих клетках кожи в разных регионах тела¹¹⁷, а также экспрессией lncRNAs в различных областях мозга^118-121 и на разных стадиях развития¹²². Кроме того, lncRNAs динамично экспрессируются во время дифференцировки стволовых, мышечных клетках, клетках молочных желез, иммунных и нейронных клетках млекопитающих, среди многих других^81,116, причем в процессе развития происходит переход от широко экспрессируемых и консервативных lncRNA к растущему числу линейно-специфических и орган-специфических lncRNA¹²³. Экспрессия lncRNA может также сильно зависеть от факторов окружающей среды, что особенно ярко выражено у растений^124-126, включая ряд стрессовых реакций у животных и лекарственную устойчивость при раке^127-133.

Ограниченная экспрессия lncRNAs в различных клетках на разных стадиях развития и их, как правило, низкое число копий (в силу их регуляторной природы) объясняет их редкую представленность в массивах данных секвенирования РНК¹³⁴ , в то время как многие lncRNAs относительно легко обнаружить в определенных клетках¹¹⁸. Недостаточная выборка lncRNAs в настоящее время исправляется целевым захватом^98,135, расширенной визуализацией^136-138, пространственной транскриптомикой¹³⁹ и, в некоторых случаях, секвенированием одной клетки^120,121,140, что делает очевидным, что, в то время как ~20 000 локусов lncRNAs человека были идентифицированы GENCODE⁴⁶ и ~30 000 консорциумом FANTOM¹⁴¹, их, вероятно, на порядок больше.

Из-за высокой сложности и различий в местах инициации и терминации транскрипции, уровнях экспрессии и сплайсинга комплексная характеристика транскриптомов является чрезвычайно сложной задачей. Недавнее исследование показало, что низкий уровень экспрессии lncRNAs может быть важным для ее функциональной роли, обеспечивая специфичность для регулируемых мишеней, что позволяет предположить, что низкий уровень присутствия может быть существенной особенностью работы lncRNAs¹⁴². Чтобы полностью каталогизировать все lncRNAs и должным образом зарегистрировать их экзон-интронную организацию и варианты сплайсинга, необходимо провести глубокое секвенирование клеток на всех стадиях дифференцировки и развития, при различных нейронных, иммунологических и других физиологических процессах, а также при различных состояниях болезни. Это огромная задача, но мы рекомендуем, чтобы будущее профилирование экспрессии генов включало полный анализ транскриптов не только мРНК, но и малых РНК и lncRNAs, которые являются межгенными, анти-смысловыми и интронными по отношению к аннотированным генам, а также их стехиометрию¹⁴³.

Как и миРНК, большинство lncRNAs не было идентифицировано в генетических скринингах. На это есть две причины. Во-первых, большинство генетических скринингов исторически сосредоточено на мутациях, кодирующих белок, которые часто имеют серьезные последствия, которые легко отследить; напротив, регуляторные мутации часто имеют тонкие последствия, влияющие на количественные признаки. Во-вторых, трудно выявить причинные мутации среди множества вариаций, происходящих в не-кодирующих последовательностях. Действительно, большинство вариаций, влияющих на количественные признаки человека и сложные расстройства, происходит в не-кодирующих областях, которые изобилуют генами, экспрессирующими lncRNAs^144,145 , которые транскрибируются в типах клеток, имеющих отношение к соответствующему признаку^141,146.

Существуют исключения среди lncRNAs, которые были идентифицированы генетически, в частности, РНК roX1 и roX2, участвующие в активации Х-хромосомы у самцов плодовых мушек⁵, РНК H19, Airn и Kcnq1ot1 у мышей^6,57,147,148 и другие, такие как Tug1 у мышей¹⁴⁹, MAENLI¹⁵⁰ и HELLP ("haemolysis, elevated liver enzyme levels and low platelet count"; также известна как HELLPAR)¹⁵¹, которые связаны с нарушениями и процессами развития. У Arabidopsis thaliana были обнаружены не-кодирующие интронные однонуклеотидные полиморфизмы, важные для адаптации к времени цветения, которые изменяют сплайсинг lncRNA COOLAIR¹⁵².

Многие lncRNAs были связаны с причиной и прогрессированием рака посредством изменения экспрессии и/или мутаций (включая точки разрывов при транслокациях) в lncRNA, которые действуют как онкогены или опухолевые супрессоры^153-155. Другие lncRNAs вовлечены в генетические заболевания человека^81,156,157, включая синдром DiGeorge и другие дефекты нейрального развития и черепно-лицевые дефекты^158-160. Фенилкетонурия, одно из первых зарегистрированных генетических заболеваний человека, вызванное в основном мутациями в ферменте фенилаланин гидроксилазе, также вызыавется мутациями в lncRNAs, которые можно лечить с помощью модифицированных РНК-имитаторов (mimics)¹⁶¹.

Путь к анализу биологической функции lncRNAs состоит в том, чтобы подавлять или удалять, или (реже) эктопически экспрессировать lncRNAs, которые были идентифицированы в наборах данных секвенирования РНК, обычно как дифференциально экспрессированные. Однако существуют проблемы с интерпретацией таких экспериментов, в частности, сложность разделения потери экспрессии lncRNAs и потери регуляторных элементов ДНК^162,163 , что было решено с помощью таких стратегий, как вставка сайтов полиаденилирования для раннего прекращения транскрипции или репрессии транскрипции с помощью CRISPR-интерференции (CRISPRi), замена lncRNAs репортерным геном, оставляющим промотор нетронутым, или удаление экзонов lncRNAs (хотя нельзя исключить потерю регуляторных элементов, расположенных ниже по течению), анти-смысловая блокада сайтов сплайсинга lncRNAs, нацеливание CRISPR-Cas13 на lncRNAs (а не на последовательность ее ДНК) и спасение трансгенов^163,164. В настоящее время существует множество исследований, продемонстрировавших биологическую роль lncRNAs¹⁶³, а высокопроизводительные обратные генетические скрининги с потерей функции увеличивают скорость поиска, выявляя, например, lncRNAs, необходимые для роста и миграции клеток млекопитающих, развития мозга, скелета, легких, мышц и сердца, иммунной функции, гомеостаза эпидермиса и реакции на лекарства против рака, или lncRNAs, оказывающие фитнес-эффект^81,165,-170 (рис. 1). CRISPRi-опосредованная транскрипционная репрессия более 16 000 lncRNAs в семи клеточных линиях человека выявила почти 500 lncRNAs, необходимых для нормальной клеточной пролиферации, 89% из которых экспрессировались только в одном типе клеток¹⁶⁷.



Fig. 1: Visible phenotypes of mutations in long non-coding RNA genes in mice¹⁶³.

The following long non-coding RNAs (lncRNAs) are listed in the figure underneath their associated phenotypes: Airn, antisense of IGF2R non-protein-coding RNA^147,435; Charme, chromatin architect of muscle expression436; Chaserr, CHD2 adjacent, suppressive regulatory RNA437; Fendrr, FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA^165,438; Firre, functional intergenic repeating RNA element316; Gaplinc, gastric adenocarcinoma predictive long intergenic non-coding RNA200; H19, clone pH19 (ref. 439); Handsdown, downstream of the protein-coding gene Hand2 (ref. 440) Kcnq1ot1, Kcnq1 overlapping antisense transcript 1 (ref. 441); linc-Brn1b, long intergenic non-coding RNA (lincRNA) downstream of the Brn1 protein-coding gene¹⁶⁵; linc-Epav, endogenous retrovirus-derived lncRNA positively regulates antiviral responses⁴⁴²; lincRNA-Cox2, lincRNA downstream of the inflammation response gene Cox2 (ref. 443); lincRNA-Eps, lincRNA involved in erythroid prosurvival²⁰¹; lnc-Lsm3b, interferon-inducible non-coding splice variant of the U6 small nuclear RNA-associated Sm-like protein lsm3 gene⁴⁴⁴; Maenli, master activator of engrailed1 in the limb165; Mdgt, midget¹⁶⁵; Meg3, maternally expressed gene 3 (also known as Gtl2)^445,446; Norad, non-coding RNA activated by DNA damage⁴⁴⁷; Peril, perinatal lethal long non-coding RNA¹⁶⁵; Pnky, pinky (also known as lnc-Pou3f2)⁴⁴⁸; Tug1, taurine upregulated gene 1 (refs. 165,166,449) Upperhand, lncRNA upstream of the Hand2 cardiomyocyte transcription factor locus³¹⁸; Xist, X-inactive-specific transcript⁴⁵⁰. Figure courtesy of Daniel Andergassen and John Rinn.

Фенотипические последствия мутаций в регуляторных РНК, как и некоторых мутаций, кодирующих белки, могут зависеть от контекста и не проявляться в лабораторных условиях, а также могут быть затушеваны устойчивостью биологических систем¹⁷¹. Потеря Malat1, которая локализуется в ядерных пятнах (speckles) и ассоциируется с факторами сплайсинга, не имеет серьезных фенотипов у мышей^114,172-174; однако она влияет на прогрессирование рака и формирование синапсов, среди прочих физиологических и патофизиологических процессов^175,176. Ген Neat1, который необходим для сборки и функционирования загадочных, специфических для млекопитающих ядерных органелл, называемых 'paraspeckles'^177-179, не требуется для нормального развития у мышей, но важен для дифференциации связанных с репродукцией женских тканей, таких как corpus luteum и молочная железа¹⁸⁰. Удаление brain cytoplasmic RNA 1 (BC1), высоко экспрессируемой мозговой lncRNA, кажется безвредным у мышей, но приводит к поведенческим изменениям, которые в дикой природе были бы летальными¹⁸¹. Поэтому важно проводить обширное фенотипирование, особенно в отношении когнитивных функций. Органоидные модели могут помочь в определении фенотипов in vitro^182,183.

Функциональное описание (аннотация) lncRNAs также может быть проведена с помощью молекулярного фенотипирования¹⁸⁴. Анализ экспрессии, взаимодействия lncRNA с хроматином и других молекулярных показателей после CRISPR-Cas13-опосредованного истощения более 400 lncRNAs в культуре показал, что lncRNAs регулируют многие гены, вовлеченные в развитие, клеточный цикл и клеточную адгезию, среди прочих процессов¹⁸⁵.

Описанные примеры показывают, что РНК участвуют практически во всех уровнях организации генома, структуры клетки и экспрессии генов посредством РНК-РНК, РНК-ДНК и РНК-белковых взаимодействий, часто с участием повторяющихся элементов^88,186,187, включая малые вкрапления (interspersed) ядерных элементов в 3' не-транслируемых областях¹⁸⁸. Эти взаимодействия участвуют в регуляции архитектуры хроматина и транскрипции (см. далее), сплайсинга (особенно с помощью анти-смысловых lncRNAs)^189-191, трансляции и локализации белков^188,192,193, и других форм обработки, редактирования, локализации и стабильности РНК^194,195.

Многие lncRNA участвуют в регуляции клеточной дифференциации и развития у животных и растений^{23,81,116,124,196}. Они также играют роль в физиологических процессах, таких как (у млекопитающих) p53-опосредованный ответ на повреждение ДНК¹⁹⁷, рекомбинация V(D)J и рекомбинация переключателей классов в иммунных клетках¹⁹⁸, экспрессия цитокинов¹⁹⁹, эндотоксический шок²⁰⁰, воспаление и нейропатическая боль^201-203, биосинтеза холестерина и гомеостаза^204,205, выработки гормона роста и пролактина²⁰⁶, метаболизма глюкозы^207,208, клеточной передачи сигналов и транспортных путей^209-212, функции синапсов^213,214 и обучения²¹⁵, а также играют роль в ответе на различные биотические и абиотические стрессы у растений^124,125. Существует также новая ассоциация lncRNAs с клеточной мембраной²¹⁶ и рибозимами²¹⁷.

В настоящее время все большее число lncRNA имеют свои собственные истории, и литература становится все более изобилующей ими. Однако появляются несколько сходящихся тем, которые объясняют вездесущность и важность lncRNAs в дифференциации и развитии: ассоциация lncRNAs с белками, модифицирующими хроматин; экспрессия lncRNAs из "энхансеров" развития; образование коацерватов РНК-ядер, разделенных фазой.

Эпигенетические модификации хроматина контролируют дифференциацию и развитие в сложных организмах²¹⁸. Известно, что метилирование ДНК направляется малыми не-кодирующими РНК у растений²¹⁹, а путь RNAi необходим для формирования гетерохроматина и эпигенетического глушения генов у грибов и животных²²⁰. Млекопитающие de novo ДНК (цитозин 5)-метилтрансферазы 3A (DNMT3A) и DNMT3B, но не поддерживающая ДНК-метилаза DNMT1, связывают siRNA с высоким сродством²²¹. В свою очередь, DNMT1 (которая восстанавливает метилирование на гемиметилированных динуклеотидах CpG после репликации ДНК) связывает lncRNAs для изменения структуры метилирования ДНК в их когнитивных локусах^222-224, но это все еще остается практически неизученной территорией.

Существует более 100 различных модификаций гистонов, которые дифференцированно устанавливаются ферментами в огромном количестве различных позиций в геномах растений и животных для контроля экспрессии генов во время развития. Наиболее изученными являются Polycomb repressive complex 1 (PRC1) и PRC2, которые катализируют монобициклирование гистона H2A Lys119 (ссылка 225) и диметилирование и триметилирование гистона H3 Lys27 (H3K27), соответственно, но у млекопитающих ни один из этих комплексов не содержит специфических для последовательности ДНК-связывающих белков²¹⁸. Ранние исследования показали, что PRC2 и/или связанная с ним H3K9 метилтрансфераза G9a рекрутируются во время инактивации Х-хромосомы мыши Xist¹⁸⁶ и контроля родительского импринтинга у мышей Airn²²⁶ и Kcnq1ot1 (ссылка 227), хотя эти ассоциации сопряжены со сложностями и неопределенностями^228,229.

Последующее исследование более чем 3300 lncRNAs в клетках человека показало, что ~20% (но только ~2% мРНК) взаимодействуют с PRC2, а другие lncRNAs связаны с другими хроматин-модифицирующими комплексами²³⁰. Более того, истощение некоторых из этих РНК вызывало дерепрессию генов, обычно заглушаемых PRC2 (ссылка 230). PRC2 связывается со многими РНК^228,231,232, более чем с 9000 в эмбриональных стволовых клетках²³³. Имеются противоречивые сведения о том, являются ли эти ассоциации неспецифическими ("promiscuous")^228,234 или специфическими высокоаффинными взаимодействиями с различными РНК^232,235, хотя эти альтернативы не исключают друг друга²²⁹. Некоторые недавние исследования показали, что РНК необходима для заселения хроматина PRC2, функции PRC2 и определения состояния клетки²³⁶, и что взаимодействие PRC2 с РНК может регулировать элонгацию при транскрипции²³². Функция PRC1 также, по-видимому, контролируется РНК^237,238. Однако деконволюция РНК-белковых взаимодействий осложняется низкой аффинностью многих антител, используемых в анализах pulldown, и тем фактом, что PRC2, например, имеет как минимум две субъединицы, связывающие РНК²²⁸. Недавнее развитие денатурирующей сшитой иммунопреципитации (dCLIP), которая основана на высокоаффинных биотин-стрептавидиновых pulldown анализах, показало, что PRC2 взаимодействует с G-богатыми мотивами РНК, включая G-квадруплексы РНК, для достижения специфичности РНК-опосредованного рекрутирования^232,239,240.

Другие lncRNAs связываются с ген-активирующими комплексами Trithorax (которые метили H3K4), включая энхансерные РНК, участвующие в поддержании судьбы стволовых клеток и спецификации линий^241-245. Диметилирование H3K9 регулируется lncRNAs во время формирования долговременной памяти у мышей²⁴⁶. lncRNAs также контролируют метилирование ряда негистоновых белков, участвующих в передаче сигналов животных клеток, экспрессии генов и процессинге РНК²⁴⁷.

Многие другие белки, участвующие в модуляции архитектуры хроматина, включая белки HOX, пионерные транскрипционные факторы, такие как NANOG, OCT4 (также известный как POU5F1), SOX2 и другие белки группы высокой подвижности (HMG), а также белки комплексов ремоделирования хроматина SWI/SNF, обладают лишь нечеткой или беспорядочной специфичностью последовательности ДНК^248-251, что указывает на участие других факторов в определении их мишеней на разных стадиях дифференцировки и развития клеток. Более того, было показано, что выбор места связывания с помощью транскрипционного фактора CTCF цинковыми пальчиками, который вместе с когезиновыми комплексами закрепляет хромосомные петли²⁵² , контролируется lncRNA just proximal to Xist (Jpx) во время ранней клеточной дифференциации, тем самым регулируя топологию хроматина в масштабах всего генома²⁵³. CTCF связывает тысячи РНК, включая Xist, Jpx и lncRNA Xist antisense RNA (Tsix), которая нацеливает CTCF на центр инактивации X254.

Существует множество доказательств того, что РНК может направлять комплексы ремоделирования хроматина, хотя доступность, диктуемая модификациями ДНК и гистонов (которые также, вероятно, направляются регуляторными РНК), также может играть определенную роль. Hox-белок Bicoid D. melanogaster (контролирующий формирование передне-заднего паттерна) связывает РНК через свой гомеодомен²⁵⁵. SOX2 связывает РНК с высоким сродством через свой HMG-домен^256,257, как и другие члены семейства HMGB^257-259.

Во время эмбриогенеза мыши локус Sox2 экспрессирует также перекрывающуюся lncRNA²⁶⁰, и существуют хорошо документированные примеры lncRNAs, которые взаимодействуют с SOX2 для регулирования плюрипотентности, нейрогенеза, дифференцировки нейронов и развития мозга^257,261-264. Комплексы ремоделирования нуклеосом SWI/SNF направляются в определенные участки хроматина или им противодействуют lncRNAs, включая XIST и энхансерные РНК, в широком диапазоне процессов дифференцировки и рака^251,265-270.

LncRNA MaTAR25, которая избыточно экспрессируется при раке молочной железы, действует in trans положении для регуляции гена tensin 1 через взаимодействие с коактиватором транскрипции PURB²⁷¹. Главный транскрипционный фактор myoblast determination protein (MYOD), который может перепрограммировать фибробласты млекопитающих в мышечные клетки и играет центральную роль в дифференцировке мышц in vivo, регулируется с помощью lncRNAs^272-274, как и другие аспекты экспрессии мышечных генов²⁷⁵. Пионерный транскрипционный фактор CBP также связывает РНК, в том числе транскрибируемые с энхансеров, чтобы стимулировать ацетилирование гистонов и, следовательно, транскрипцию²⁷⁶. Некоторые транскрипционные факторы (OCT4, NANOG, SOX2 и SOX9) также регулируются lncRNAs, включая псевдогенные lncRNAs^277-281, и взаимно регулируют экспрессию lncRNAs²⁸². Энхансерные lncRNAs также регулируют экспрессию рецептора ядерного гормона ESR1 (см. 283) и CCAAT/enhancer-binding protein-α (CEBPA)²⁸⁴.

Энхансеры - это некодирующие геномные локусы, которые контролируют пространственно-временную экспрессию других генов во время развития. В геноме млекопитающих насчитывается ~400 000 (±100 000) энхансеров^285-288, которые иногда объединяются в "суперэнхансеры" или "энхансерные джунгли "^288-291. Считается, что энхансеры функционируют путем соединения транскрипционных факторов, связанных c промоторами энхансеров, с промоторами целевых генов^292,293.

Несомненно, действие энхансеров изменяет топологию хроматина и может быть ответственно за формирование доменов хроматиновых петель, которые действуют как локальные центры транскрипции и сплайсинга^294,295. Энхансеры транскрибируются в клетках, в которых они активны^{141,289,296-299}, что привело к неопределенности в вопросе о том, являются ли образующиеся РНК побочными продуктами связывания факторов транскрипции или играют роль в активности энхансеров²⁹⁸.

Последнее, по-видимому, имеет место. Эпигенетический ландшафт и особенности инициации транскрипции на промоторах белок-кодирующих генов и энхансеров практически неотличимы^296-300. Энхансеры экспрессируют двунаправленные промотор-ассоциированные короткие РНК^301-303, называемые 'eRNAs', хотя такие короткие РНК не являются специфичными для энхансеров, поскольку аналогичные двунаправленные транскрипты производятся с промоторов белок-кодирующих генов^304,305. Также по аналогии с мРНК, производимыми белок-кодирующими генами, энхансеры экспрессируют длинные (не-кодирующие) РНК (их также путано называют "eRNAs "^298,306), и транскрипция считается лучшим молекулярным индикатором активности энхансеров в процессах развития^{296,297,306-308} и рака²⁸⁸. Более того, было показано, что сплайсинг enhancer-lncRNA модулирует активность энхансеров^309,310.

Хотя степень соответствия объединенных генетических и транскриптомных данных высокой глубины неясна, поскольку их доступность все еще ограничена, но данные свидетельствуют о том, что многие, если не большинство lncRNAs происходят от энхансеров^{141, 298} и что lncRNAs необходимы для активности энхансеров^{163,284,311-314}, примеры включают lncRNAs Evf2 (также известную как Dlx6os1)³¹⁵, Firre316, Peril317, Upperhand (также известную как Hand2os1)³¹⁸ и Maenli¹⁵⁰ у мышей. Функция энхансерных РНК - благодатная почва для исследований, но если энхансерные локусы считаются полноценными "генами", то парадокс g-значения (предполагаемое отсутствие увеличения числа генов с усложнением развития) разрешается. Это также означает, что ключевым событием в эволюции сложных организмов стало использование РНК для организации траекторий развития³¹⁹. Оказывается, что "каждый тип клеток экспрессирует точные сигнатуры lncRNA для контроля специфических для линии развития регуляторных программ"²⁷⁰, и что состояние клеток в течение онтогенеза, вероятно, направляется lncRNAs.

В последнее десятилетие все большее признание получает роль биомолекулярных конденсатов, или phase-separated domains (PSDs), в организации клеток и хроматина. Эти конденсаты представляют собой высокодинамичные ансамбли с высокой локальной концентрацией макромолекул, что способствует функциональным взаимодействиям. Конденсаты обычно содержат как РНК, так и белки^320-322 , причем последние имеют IDRs, которые являются основными сайтами посттрансляционных модификаций³²³. IDRs взаимодействуют со многими партнерами и настраиваются ими³²⁴. Доля протеома, содержащего IDRs, увеличивается по мере усложнения клеток и развития³²³, и почти все белки, участвующие в регуляции развития, включая большинство факторов транскрипции, гистоны, гистон-модифицирующие белки, другие хроматин-связывающие белки, РНК-связывающие белки, факторы сплайсинга, рецепторы ядерных гормонов, цитоскелетные белки и мембранные рецепторы, содержат IDRs^323,325-332.

РНК имеет решающее значение для формы, состава и функции фазово разделенных РНК-белковых конденсатов^320-322. Специфические "архитектурные" lncRNAs³³³ ассоциируют с ядерными конденсатами разного периода полураспада и функциональности, в том числе в центросомах³³⁴, нуклеолах³³⁵ (lncRNAs SLERT138 и LETN336), в ядерных пятнах (speckles) (lncRNA MALAT1 (Refs. 173,337)), в богатом факторами РНК - процессинге, в связанных со speckles конденсатами, содержащие lncRNA Gomafu у мышей^338,339 и пара-speckles (lncRNA NEAT1 (ссылки 340,341)) (рис. 2) у позвоночных, а также в комплексах полиаденилирования³⁴² и другие конденсаты у растений³⁴³. Конденсаты RNP также включают цитоплазматические безмембранные органеллы, такие как Р-гранулы^344,345, субклеточно-локализованные сборки RNP трансляционных мессенджеров³⁴⁶ и синаптические компартменты^320,322,347. Цитоплазматическая lncRNA NORAD млекопитающих, которая индуцируется при повреждении ДНК и необходима для стабильности генома, предотвращает аберрантный митоз путем секвестрации белков Pumilio (которые связывают множество РНК, регулирующих судьбу стволовых клеток, развитие и неврологические функции) в PSD через свои повторяющиеся последовательности^137,348.



Fig. 2: Roles of long non-coding RNAs in nuclear organization.

a, 5' small nucleolar RNA-capped and 3'-polyadenylated long non-coding (lncRNAs) (SPAs)⁴² and small nucleolar RNA-related lncRNAs (sno-lncRNAs)⁴¹ accumulate at their sites of transcription and interact with several splicing factors such as RNA-binding protein FOX-1 homologue 2 (RBFOX2), TAR DNA-binding protein 43 (TDP43) and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M (hnRNPM) to form a microscopically visible nuclear body that is involved in the regulation of alternative splicing⁴². b, The lncRNA functional intergenic repeating RNA element (Firre) is transcribed from the mouse X chromosome and interacts with the nuclear matrix factor hnRNPU to tether chromosome X (chrX), chr2, chr9, chr15 and chr17 into a nuclear domain^451,452. c, The lncRNA nuclear paraspeckle assembly transcript 1 (NEAT1) is essential for the formation of paraspeckles¹⁷⁸. NEAT1 sequesters numerous paraspeckle proteins to form a highly organized core-shell (dark and light purple, respectively) spheroidal nuclear body⁴⁵³. The middle region of NEAT1 is localized in the centre of paraspeckles, and the 3'-end and 5'-end regions are localized in the periphery⁴⁵³. Different paraspeckle proteins are embedded by NEAT1 into the spheroidal structure in the core region (non-POU domain-containing octamer-binding protein (NONO), fused in sarcoma (FUS) and splicing factor, proline- and glutamine-rich (SFPQ)) or in the shell region (RNA-binding motif protein 14 (RBM14))⁴⁵³. d, The lncRNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) is localized at the periphery of nuclear speckles^172,454 and is involved in the regulation of pre-mRNA splicing^339,455. MALAT1 interacts with the U1 small nuclear RNA (U1 snRNA)⁴²⁸, whereas proteins such as SON DNA- and RNA-binding protein and splicing component 35 kDa (SC35) are localized at the centre of nuclear speckles⁴⁵⁶. e, The lncRNA CHD2 adjacent, suppressive regulatory RNA (Chaserr) forms a compartment within a region of the mouse chromosome corresponding to a topologically associating domain that includes its own gene as well as the Chd2 gene (encoding chromodomain DNA helicase protein 2 (CHD2))⁴³⁷. Chaserr limits in cis the expression of Chd2, which is important for proper regulation of many genes (not shown). f, The perinucleolar compartment contains the lncRNA pyrimidine-rich non-coding transcript (PNCTR), which sequesters pyrimidine tract-binding protein 1 (PTBP1) and thus suppresses PTPBP1-mediated pre-mRNA splicing elsewhere in the nucleoplasm³⁶⁹. The size of nuclear bodies is indicated where relevant⁴⁵⁷. Figure adapted from ref. 80, Springer Nature. Part e courtesy of Inna-Marie Strazhnik and Mitch Guttman.

Предполагается, что РНК играют центральную роль в организации генома и экспрессии генов путем образования пространственных компартментов и транскрипционных конденсатов^349-353. Фазовое разделение, по-видимому, определяет дальние взаимодействия хроматина и необходимо для действия энхансеров и суперэнхансеров^{328,351,354-357}, а также для транскрипции, транскрипционных факторов и комплексов полиаденилирования^342,358-361, хотя сообщалось, что концентраторы транскрипционных факторов работают в отсутствие обнаруживаемого фазового разделения³⁶². PSD, образованные lncRNAs, включая богатые повторами РНК^363,364, опосредуют формирование гетерохроматина^353,365,366, эухроматина³⁶⁷, тел Polycomb³⁶⁸ и альтернативного сплайсинга³⁶⁹. lncRNAs являются существенным компонентом быстро перестраивающейся, богатой повторами РНК (технически называемой "РНК CoT-1"), а визуализация высокого разрешения показывает множество содержащих повторы РНК, связанных с хроматином, это указывает на то, что коллективное присутствие тысяч lncRNAs служит для противодействия конденсации хроматина³⁶⁴. Визуализация высокого разрешения также показывает локализацию многих lncRNAs в компартментах ядра, напоминающих PSDs^136,353. Все эти данные позволяют предположить, что существуют тысячи lncRNAs с низким числом копий, участвующих в организации хромосомных территорий.

Размер lncRNAs обычно варьируется от около 1 kb до более 100 kb (ссылки 370,371) и имеет модульную структуру^372-375. Они часто мультиэкзонные и с высоким уровнем альтернативного сплайсинга (рис. 3a), что было неочевидно до появления глубокого секвенирования⁹⁸. Они также содержат большую долю сайтов сплайсинга GC-AG³⁷⁶ и поэтому сплайсируются менее эффективно, чем транскрипты, кодирующие белки^377,378, которые обладают свойствами, связанными с альтернативным сплайсингом³⁷⁹. Альтернативный сплайсинг, как неудивительно, привел к изменению функции lncRNAs^{42,152,380,381}.



Fig. 3: Modular structures of long non-coding RNAs.

a, Targeted RNA sequencing has revealed that human chromosome 21 (chr21) is pervasively transcribed into long non-coding RNAs (lncRNAs) and that lncRNA exons are almost universally (but not randomly) alternatively spliced to form diverse and complex isoforms⁹⁸. The circle indicates the fraction of non-coding exons across all chr21 transcripts that are alternatively or constitutively spliced. b, Modular structural domains in lncRNAs that fulfil a range of functions^372-375, including targeting DNA, such as in the case of auxin-regulated promoter loop (APOLO)⁶¹; binding other RNAs - for example, terminal differentiation-induced non-coding RNA (TINCR)⁴⁵⁸, potentially involving RNA-binding proteins such as Staufen 1; and recruitment of proteins - for example, pyrimidine-rich non-coding transcript (PNCTR) recruiting of pyrimidine tract-binding protein 1 (PTBP1) through special RNA motifs³⁶⁹ and X-inactive-specific transcript (XIST) recruiting split ends homologue (SPEN) and Polycomb repressive complex 2 (PRC2), perhaps in concert, which is the subject of active exploration and debate^{142,397,399,423,424,459}. Modular functional domains can be repeated within a lncRNA or in multiple different lncRNAs^{7,87,186,369,388,391,393-401}. Figure courtesy of Tim R. Mercer.

Некоторые lncRNAs также демонстрируют общие мотивы и комбинации мотивов¹⁰¹. По меньшей мере 18% генома человека консервативны среди млекопитающих на уровне предсказанной структуры РНК³⁸², а сходные и потенциальные структуры паралоги РНК встречаются во многих местах генома^383,384. Химическое зондирование показало, что lncRNAs , включая Xist, образуют сложные многодоменные структуры^108,385-389, причем химические данные совпадают с данными, предсказанными эволюционным сохранением вторичной структуры³⁸⁹. Более того, lncRNAs с аналогичным содержанием олигонуклеотидов в k-основании (короткий мотив) имеют родственные функции, несмотря на отсутствие общей гомологии, что предполагает, что малые элементы последовательности также являются ключевыми детерминантами функции lncRNAs³⁹⁰.

Многие экзоны lncRNA происходят от транспозиционных элементов^187,391. Наиболее высоко консервативными последовательностями в Xist, который интенсивно изучался, являются его повторы⁷ , в то время как его уникальные последовательности быстро эволюционировали³⁹² , и многие его биологические функции, включая рекрутирование генных репрессивных комплексов и сайленсинг генов, опосредуются через его модульные повторяющиеся элементы^{142,186,388,393-399}. Последовательности, производные от транспозируемых элементов, участвуют во многих РНК-белковых взаимодействиях^369,400,401, это позволяет сделать вывод о том, что повторяющиеся структуры являются общими строительными блоками lncRNAs^87,391,396 и существенными компонентами их функции³⁹¹.

Молекулярные механизмы действия lncRNA неясны. В большинстве хорошо изученных случаев РНК-регуляции, таких как RNAi, snoRNAs, CRISPR и теломераза, РНК действует как проводник, направляющий комплексы эффекторных белков на комплементарные последовательности РНК или ДНК. Данные об отдельных lncRNAs (например, HOTAIR, roX1, roX2, Meg3, Tug1, PARTICLE (также известная как PARTCL), PAPAS и KHPS1) показывают, что они образуют триплексные структуры с ДНК на пурин-богатых участках GA для привлечения модификаторов хроматина к определенным локусам в геноме^402-408, с доказательствами того, что образование триплексов lncRNAs является широко распространенным явлением^409-411. Другие, особенно антисмысловые lncRNA, по-видимому, функционируют через образование гибридов РНК-ДНК^61,412,413, но подробная информация об этом в настоящее время отсутствует.

Структура и функция RNP lncRNA хорошо охарактеризованы только в одном случае - в комплексе теломеразы, который изучается уже несколько десятилетий. Теломеразная обратная транскриптаза (TERT) катализирует добавление теломерных повторов к концам хромосом, а другие белки комплекса обеспечивают ядерную локализацию, стабильность или привлечение к теломерам или телам Cajal. lncRNA TERC обеспечивает основу для сборки RNP и шаблон для полимеризации ДНК TERT, а мутации в TERT и TERC вносят основной вклад в этиологию рака и являются причиной таких наследственных заболеваний, как врожденный дискератоз^{103-107,414-416}.

Напротив, хотя мы знаем фенотипы, вызванные потерей некоторых lncRNA, мы почти ничего не знаем о том, как работает большинство из них, хотя, учитывая, что еще в 2010 году само существование повсеместной транскрипции все еще было предметом споров^417-419 и огромноuj количества lncRNAs, с техьпор был достигнут значительный прогресс. Предполагается, на наш взгляд обоснованно, что в целом lncRNAs будут участвовать в многосторонних взаимодействиях подобно TERC и комплексу теломеразы¹⁰⁸ , и есть некоторые доказательства в поддержку этого предположения в таких случаях, как XIST (рис. 3б), но предположение еще не было строго проверено. Есть и многообещающие открытия, например, демонстрация того, что консервативные псевдоузелки (pseudoknots) в lncRNA Meg3 необходимы для стимуляции пути p53⁴²⁰. Также появляется все больше доказательств дискретной структурной организации в lncRNAs⁴²¹. Тем не менее, предстоит долгий путь к пониманию структуры и функции многих тысяч lncRNAs и их сплайс-вариантов в контексте связанных с ними комплексов RNP и биомолекулярных конденсатов как в ядре, так и в цитоплазме.

Если сложный онтогенез животных и, в меньшей степени, растений требует большого количества РНК для управления эпигенетическими решениями при каждом клеточном делении, то неудивительно, что многие lncRNAs имеют общие белок-связывающие модули и специфические целевые последовательности, которые различаются на разных стадиях развития. Задача состоит в том, чтобы определить, какие lncRNAs и модули в них взаимодействуют с эффекторными белками, а какие обеспечивают специфичность мишени (ДНК или РНК). Первая задача осложняется высокой субъединичной природой многих комплексов РНК, но ее решают такие технологии, как iCLIP422, RAP-MS423, ChIRP-MS388 и iDRiP⁴²⁴. Определить специфичность мишени еще сложнее, поскольку для специфического нацеливания требуются лишь короткие участки нуклеотидной комплементарности, учитывая силу взаимодействий РНК-РНК и РНК-ДНК⁴²⁵, но эта проблема может быть решена новыми методами, анализирующими взаимодействия РНК-хроматина и РНК-РНК, такими как GRID-seq⁴²⁶, RADICL-seq⁴²⁷, RIC-seq⁴²⁸ и RD-SPRITE³⁵³. Другие lncRNAs локализованы в цитоплазматических компартментах, компоненты которых также необходимо охарактеризовать.

Понимание роли lncRNAs и того, как они функционируют в динамических ансамблях с другими макромолекулами, обеспечит более полное понимание биологии клетки и развития, а также взаимодействия генов с окружающей средой. Новые задачи включают понимание роли lncRNAs и модификаций РНК в функциональной пластичности, особенно в мозге, и дисрегуляции этих lncRNA-опосредованных путей при неврологических расстройствах, раке и других заболеваниях.