ATR | ATRIP | RPA | ss

Single-stranded (ss)ДНК как полагали, является общим промежуточным образованием, необходимым для активации КПП (checkpoint). Однако, ssDNA покрыта replication protein A (RPA), это и привело Zou и Elledge к изучению функции RPA. Они обрабатывалди клетки ионизирующими излучениями и отметили, что ATR — который существует в виде комплекса с ATRIP (ATR-interacting protein) — формирует локальные фокусы вместе с RPA. RPA колокализуется полностью с ATR–ATRIP комплексом, рекрутирование которого зависит от RPA.

Chk1 protein kinase является субстратом для ATR, который фосфорилируется в ответ на повреждение ДНК или блокирование репликации. Когда экспрессия RPA70 (самой большой субъедницы RPA) ингибирована с помощью small interfering RNA, то фосфорилирование Chk1 снижается по сравнению с таковым в контрольных клетках. Авт. нашли, что RPA регулирует ATR-опосредуемое фосфорилирование Chk1 в ответ как на блокирование репликации, так и повреждения ДНК.

Zou b Elledge предположили, что RPA м. участвовать в распознавании повреждений за счёт рекрутирования ATR–ATRIP непосредственно в место повреждения. Это оказалось верным, т.к. RPA стимулирует связывание очищенного ATRIP с ssDNA в in vitro связывающем assay, a ATRIP ассоциация поставляет ATR на комплексы RPA–ssDNA. Более того, рекрутирование ATR–ATRIP на ssDNA необходимо для фосфорилирования Rad17, субстрата ATR, ассоциированного с ssDNA. Итак, рекрутирование ATR–ATRIP на ssDNA делает способным активировать её ДНК-связанные субстраты.

В дополнение к этому, RPA функция законсервирована — у дрожжей, RPA необходим для рекрутирования Ddc2 (гомолога ATRIP у дрожжей) на повреждженную ДНК in vivo. А мутантная checkpoint-defective RPA линия rfa1-t11 неспособна поставлять Ddc2 на ssDNA.

В согласии с Zou и Elledge's данными, Cimprich и др. нашли, что RPA и ATR локализуются вместе в местах повреждений ДНК и что внутриядерная транслокация, происходящая в ответ на повреждения ДНК, является регулируемым процессом. В то время как Zou и Elledge идентифицировали регуляторную роль RPA в этом процессе, то группа Cimprich показала, что ATR мутанты, лишенные активности киназы, не способны релокализовать, так они обозначили добавочную регуляторную фукцию, ATR.

Итак, хотя некоторые детали механизма активации ATR checkpoint ещё необходимо уточнить, Zou and Elledge приходят к заключению "...an apparent activation may be achieved by the simultaneous enrichment of ATR–ATRIP and its substrates at the sites of DNA damage." Многофункциональность ATR-зависимого КПП (checkpoint), который м. реагировать на различные типы повреждений ДНК и останавливать репликационную вилку, достигается благадоаря распознаванию общих промежуточных образований, RPA–ssDNA. Эта простая модель передачи сигналов от поврежений ДНК высоко законсервирована, т.к. прокариоты выявляют RecA–ssDNA, а эукариоты определяют RPA–ssDNA.