Ins(1,4,5)P₃

Ранний интерес к передаче сигналов Са²⁺ ограничивался ролью Са²⁺ в активации яиц (1-4). Эксперименты того времени были не в состоянии непосредственно наблюдщать за динамикой изменений Са²⁺ в цитозоле и эффективно модулировать внутрикелеточне и внеклеточные уровни Са²⁺. Сегоднф разработано несколько Са²⁺ репортёров (5-7), буфферов (6, 8-13) и ионофоров (14, 15).

Недавние улучшения методологи Са²⁺-imaging дали более чувствительные и менее инвазивные технологии как в отношении используемых репортеров кальция (люминисцентных (16, 17) и флюоресцентных (18, 19)), так и в отношении техники визуализации сигналов, ими испускаемых (люминисцентных (20, 21) и флюоресцентных (22-25)). В частности Roger Tsien et al., внесли большой вклад в эту область исследований, разработав новые инструменты и техники (6, 18, 26, 27). Недавние исследования разлинчх видов животных показали, что передача сигналов Са²⁺ ассоциирует со многими последолвательными ступенями и процессами, которые являются общими в развитии животных. Степень сходства между некоторыми из этих паттернов передачи сигналов и механизмами, которые их производят, указывает на то, что они м.б. общим свойством развития животных. Сигналы выявляются уже в первичных культурах индивидуальных эмбриональных клеток (28), эксплантатах эмбриональных тканей (29, 30) и в интактных, здоровых нормально развивающихся эмбрионах (31-35).

Передпача сигналов Са²⁺ во время оплодотворения и др. ранних процессов во время развтия зигот (разрыв ядерной оболочки, митоз, цитокинез) рассмотрены в др. обзорах (36-40), по этому не будут рассматриваться. Однако, следует заметить, что элементарные события, которые составляют передачу сигналов внутриклеточного Са²⁺ - Са²⁺ BLIPS или QURKS (41, 42), PUFFS или SPARKS (43, 44) и INTRACELLULAR WAVES (45) - наиболее вероятно формируют основу почти всех последовательных внутриклеточных сигнаьных событий (49, 50). Когда количество эмбриональных клеток увеличивается, то это сопровождается уменьшением размеров клеток, так что инивидуальные клетки оказываются окруженными все увеличивающимся количеством соседних клеток. Мы предполагаем, что на этой стадии, когда онтогенетические события нуждаются в скоординированной активности, инициируются и заметно возрастают межклеточные коммуникации. Это происходит на стдаии бластулы, которая является переходом от внутриклеточной к меклеточной передаче сигналов Са²⁺ (51)(Рис. 1а-с). Исследования показывают, что в фазе ранней бластулы события внетриклеточной передачи сигналов Са²⁺, по-видимому, локализуются внутри небольшого числа клеток, сообщающихся др. с др в данный определенный период времени (Рис. 1с и 2). У эмбрионов рыбок данио эти сигнальные события ограничены Enveloping LAYER (EVL) клеток и это указывает на то, что одной из их функций м.б. помощь в увеличении межклеточной адгезии этой формирующейся PERIDERM (31). Затем с увеличением потребности в кординации в широком масштабе во время экстенсивных клеточных перестроек и перемещений, которые характеризуют гаструляцию - формирование зародышевых слоёв и закладка осей тела - межклеточные сигнальные события, скорре всего начинают обнаруживать более экстенсивную, глобальную природу (29, 35, 52, 53) (Рис. 1d, 3). Как только зародышевые слои и основные оси тела будут установлены, то начинает обнаруживаеться возобновление более локальных межклеточных сигналов, которые ассоциированы с генерацией специфических эмбриональных структур (32, 51) (Рис. 1e,f 4 и 5), а также с возобновлением внутриклеточных сигнальных событий в одиночных клетках (54).

Мы предполагаем. что 5 общих факторов объясняют уникальную передачу сигналов Са²⁺ во время этого критического периода развития. Во-первых, это способ, с помощью которого Са²⁺ отграничивается как от цитоплазмы, так и от ядра и хранится или во внутриклетоыных или внеклеточных резервуарах (48). Во-вторых. это различные механизмы высвобождения и повтороного секвестрирования, которые модулируют уровни Са²⁺. В третьих, это количество чувствительных к Са²⁺ молекулярных мишеней, которые связывают Са²⁺ с многочиленными др. онтогнетическими путями передачи сигналов (49). В-четвертых, это взаимодействие между пространственными и временными паттернами высвобождения Са²⁺ и их эндогенными цитоплазматическими буферами (56). И, наконец, это динамическое взаимодействие и взаимоотношения между клетками во время эмброгенеза, которые потенциальные пути для обще-эмбриональных коммуникаций с помощью межклеточных волн Са²⁺ (51). Мы предполагаем, что эти 5 факторов взаимодействуют при переносе некоторой регуляторной информации, которая необходима для генерации сложной трехмерной структуры эмбриона.

Мы уделим основное внимание передаче сигналов Са²⁺ во время многоклеточных стадий развития, которые сопровождают генерацию основного эмбрионального паттерна и дифференцировку ключевых стстем органов. На этих стадиях хакладываются также основные оси, детерминируются зародышевые листки и координируются клеточные движения...

Calcium signalling and axis specification

Подтверждено, что и внутриклеточный Са²⁺ и inositol-1,4,5-triphosphate (Ins(1,4,5)P₃) помогают закладке дорсо-вентральной (D-V) оси у разных развивающихся эмбрионов (57-60)(Табл. 1). Градиенты кальция визуализованы непосредственно у рыбок данио, у которых вентральная область бластодермы обнаруживает продолжительный подъём концентрации внутриклеточного Са²⁺ на стадии щитка (shield)(52). Сходным образом у Xenopus предположен венрально-дорсальный градиент Ins(1,4,5)P₃/Са²⁺, обеспечивающий установление дорсо-вентральной оси (61, 62). Эксперименты с разрушением этого Ins(1,4,5)P₃/Са²⁺ градиента приводили к нарушению закладки оси и к респецификации (63, 64).

Члены семейства Wnt, секретирующие гликопротеины, также участвуют в различных онтогенетических процессах, включая спецификацию осей. Белки Wnt передают сигналы через рецепторы Frizzled, которые являются членами семейства G-protein-coupled receptor. У позвоночных члены семейства Wnt/Frizzled подразделяются на два функциональных класса, которые отражают их биологические активности - Wnt-1 класс и Wnt-5A класс. Члены Wnt-1 класса передают сигналы через канонический (архитипический) путь Wnt/β-катенин передачи сигналов. Это связано со стабилизацией цитоплазматического β-катенина, который затем функционирует в ядрах, активируя экспрессию специфических генов-мишеней (65). Члены класса Wnt-5А, с др. стороны, стимулируют высвобождение внутриклеточного Са²⁺ ( посредством Ins(1,4,5)P₃ рецепторов) и активируют два чувствительных к Са²⁺ энзима - Са²⁺/calmodulin-dependet protein kinase II (CamKII) (63) и protein kinase C (PKC) (66) - G-протеин-зависимым, но β-катенин-независимым способом (67). Т.к. высвобождение Са²⁺ является главным свойством этого неканонического пути, то и Са²⁺, как полагают, играет ключевую роль в активации CamKII и РКС, поэтому данный путь передачи сигналов известен как путь Wnt/Са²⁺ (67). Показано, что Xenopus гомолог ядерного фактора, активирующего Т клетки (XNF-AT) функционирует как ниже стоящая мишень Wnt/Са²⁺ и Ins(1,4,5)P₃/Са²⁺ пути и играет существенную роль в обеспечении передачи вентральных сигналов у эмбрионов Xenopus gen`v супрессии канонического Wnt пути.

Было предположено, что ионы Са²⁺ м. также вовлекаться в спецификацию и др. главных эмбриональных осей. Эмбрионы рыбок медаки (щкняшфы latipes) обнаруживают область повышенных уровней Са²⁺ в их VEGETAL POLE, который сохраняется вполть до стадии GASTRULA (69). Чётко установлен градиент Са²⁺ вдоль оси между анимальным и вегетативным полюсом (AP-VP). Более того, внесение Са²⁺ буфферов рассеивает область и существенно нарушает нормальное развитие (70).

У рыбок данио два отдельных типа Са²⁺ волн проходят вдоль передене-задней (А-Р) оси на разных стадиях развития (Табл. 1). Во время гаструляции несколько "быстрых" внутриклеточных волн Са²⁺ (71) (движущихся с ~ 5 µm s^-1) описаны, которые перемещаются по туловищу в переднем направлении. Эти т. наз. аксиальные волны являются членами ритмических серий межклеточных волн, которые инициируются с помощью SHIELD. Большинство волн этой серии проходит вокруг края бластодермы. Однако в случае аксиальных волн, они инициируются в той же самой временной рамке, что и маргинальные волны, и , следовательно, скорее всего являются членами одной и той же серии волн, которе перемещаются по альтерантивным маршрутам (52). Пока онтогенетическая функция и значение аксиальных волн неясны. Предполагается, что такие волны м. восприниматься клетками посредстом чувствительных к Са²⁺ молекул клеточной адгезии (таких как кадхерины) и м. , следовательно, функционировать, модулируя клеточное поведение в отношении завершающего convergent extension (29, 53). Однако, поскольку возможно установление и поддержание аксиальной спецификации, то исследования эмбрионов Xenopus на сходных стадиях их развития, показали, что они м. также функционировать в спецификации нейральной эктодермы (34). Позднее у рыбок данио в период сегментации были описана "ультра-медленная" Са²⁺ волна (72) (перемещающаяся с ~0.07 µm s_-1) , которая предшествует закладке А-Р оси в заднем направлении. Предполагается, что эта волна м. играть роль в сомитогенезе и в образовании NEURAL KEEL (32).

В одном из немногих случаев, в котором сигналы Са²⁺ м.б. визуализированы у пост-зиготических эмбрионов беспозвоноыных , было отмечено, что область повышенной концентрации Са²⁺ обнаруживается на вентральной стороне эмбрионов дрозофил во время стадии SYNCYTIAL BLASTODERM (ст. 1-4), когда происходит вентральная активация (33). Какова онтогенетическая функция повышенного Са²⁺ сигнала во время ст. 1-4, все ещё остаётся предметом споров, т.к невозможно непосредственно сравнить её с повышенными Са²⁺ сигналами на вентральной стороне ранних эмбрионов позвоночных (52). Несколько позднее ( примерно на ст. 5) уровни Са²⁺ становятся относительно высокими на дорсальной стороне скорее, чем вентральной и предполагается, что этот сдвиг в паттерне возникает в результате супрессии вентральных концентраций Са²⁺ (33). Опять же возможная функция этой дорсальной "реверсии" выского градиента Са²⁺, довольно спекулятивна. Предполагается, что это м.б. функцией по закладке дорсо-вентрального градиента секретируемых морфогенеов. Несмотря на отсутствие данных, подтверждаюющих механистические основы специфических онтогенетических функций, мы полагаем, что эта впечатляющая работа на Drosophila важна, т.к. представляет один из немногих примеров этого у беспозвоночных моделей. Дорсо-вентральная спецификация сигнальных путей у дрозофилы генетически описана достаточно хорошо, так что эта развивающаяся система обладает потенциалом выявления взаимодействий между Са²⁺ и белками сигнальных путей.

Calcium signalling and cell motility

У позвоночных обычно развитие характеризуется разноооьбразными морфогенетическими перемещениями клеток и перестройками. Они варьируют от миграции одиночыных клеток или небольших популяций клеток до высоко скоординированных крупномасштабынх клетоных преобразований целых тканей. Хотя механизмы передачи сигналов, которые регулируют эти разные типы движений всё ещё не очень хорошо изучены, начинают накапливаться доказательства, указывающие на то, что передача сигналов Са²⁺ м.б. ключевой функцией в короординации и контроле движений индивидаульных клеток и позициионировании популяций клеток в специфических местоположениях во время эмбриоенеза (29, 52,53, 73) (Табл. 1). Экстенсивные клетоыне перемещения и перестройки, которые происходят во время гаструляции, являются одним из примеров участия Са²⁺.

Dj время гаструляции основной план тела эмбриона начинает проявляться, когда серия крупномасштабыных морфогенетичесеких перемещений клеток - а именно EPIBOLY, INVOLUTION, CONVERGENCE и EXTENSION - приводят к образованию трёх зародышевых листков, энтодермя, мезодермы и эктодермы. Прямая визуализация передачи сигналов Са²⁺ во время этих скоординированых клетоных движений опять же получена на эмбрионах рыбок данио и Xenopus. Две группы сообщили , что активность Са²⁺ ассоциирует с процессом epiboly у рыбок данио. В первой группе было установлено, что край мигрирующей бластодермы обладает высокими уровнями Са²⁺ с пиком концентрации на дорсальном крае (32). Др. группа описала сложную последовательность переходов Са²⁺, которая ассоциирует с этим периодом развития, в котором наиболее сильны ритмические серии межклеточных волн Са²⁺, которые стартуют при ~65% и перемещаются вокруг края бластодермы со скоростью ~5µm s^-1 и с частотой ~7 волн в ч. во время закрытия бластопора (52) (Рис. 3). Эти волны впервые наблюдались и были описаны, которые были лишены хориона (52), но теперь они обнаружены и у эмбрионов рыбок данио с интактным CHORIONS (35). Предполагается, что и маргинальные волны и области с повышенными уровнями Са²⁺ являются частями одного и того же сигнального феномена и что они м. играть роль в управлении и оркестрировании yolk-plug occlusion во время поздних стадий эпиболии: сначала благодаря функции цитоскелетных компонентов, таких как микрофиламенты (74) м микротрубочки (75, 76) и позднее благодаря обеспечению пространственной проверки (reference) в форме повторяющихся волн, которые исходят от одного и того же относительного местоположения у эмбриона (это epibolizing shield).

Распространение межклеточных волн Са²⁺, как полгают, играет важную роль в движенияех конвергенциии расширения, которые происходят во время гаструляии у Xenopus (29). Используя KELLER OPEN-FACE EXPLANTS во время гаструляции эмбрионов Xenopus выявлена серия межклеточных волн Са²⁺, распространяющихся со скоростью ~5µm s^-1, которые коррелировали и пространственно и по времени с процессом конвергентного расширения. Более того, когда волны Са²⁺ блокировали фармакологически, то convergent extension ингибировалось без, не затрагивая спецификации судьбы клеток (29). И снова, используя Keller open-fase explants, было показано, что движения convergent extension у Xenopus находятся под тонким контролем и Wnt/β-катенин и Wnt/Са²⁺ сигнального пути, первый необходим для для стимуляции конвергентного расширения, тогда как последний функционирует как негативный регулятор этого процесса (77). Недавно (78) получены доказательства, указывающие на то, что Rho GTPase cdc42 ( которая, как известно, регулирует кадхерином-опосредованную меэклеточную адгезию (79)) функционирует ниже Wnt/Са²⁺ пути в регуляции конвергентного расширения у Xenopus (78). Путь Wnt/Са²⁺, как полагают, играет также роль в convergence и extension при гаструляции у рыбок данио. Недавно было показано (80), что активация Frizzled-2 с помощью Wnt-5A ведет к высвобождению внутриклеточного Са²⁺ посредством phosphodiesterase (PDE) и циклической GMP и что эмбрионы, обработанные PDE ингибиторами обнаруживают уменьшение convergence и extension.

Сходство скоростей межклеточных волн было отмечено в двух развивающихся системах, указывая на то, что имеется консервация механизмов по распространению волн. Эти скорости эмбриологических межклеточных волн также сходны со скоростями межклеточных волн, которые выявлены в зрелых, взрослых тканях (81). И снова это указывает, что имеет место консервация механизма распространения, который используется от ранних эмбриологических передач сигналов до функционирования во взрослых тканях. Скоросто этих волн указывает н то, что они скорее всего являются реакционно-диффузионными волнами, которые распостраняются внутриклеточно с помощью Са²⁺-индуцированного высвобождения Са²⁺ (CICR) или регенеративного высвобождения и которые способны передаваться из клетки в клетку (Рис. 6b, c; BOX 1) скорее, чем в результате открытия чувствительных к эл.напряжению Са²⁺ каналов в ответ на деполяризацию плазматической мембраны, как это показано на Рис. 6d (71, 72).

Calcium signalling and organogenesis (Табл. 1)

Development of the nervous system.

Накапливаются доказательства того, что Са²⁺ играет ключевую роль во многих аспектах развития нервной системы, от нейральной индукции до нейральной дифференцировки. Отдельные паттерны передачи сигналов Са²⁺ были визуализованы во время гаструляции интактных эмбрионов Xenopus (34)? такж как и при Keller open-face explants (30). Эти паттерны образуют локальные временные области повышенного уровня Са²⁺, которые ограничиваются исключительно передней дорсальной частью эктодермы и которые увеличиваются в числе и по амплитуде непосредственно перед начлом нейрональной индукции. Поэжтому было предположено, что повышенные концентрации Са²⁺ м. играть важную роль в этом процессе регуляции экспрессии ранних нейральных генов geminin и Zic3 (30, 34). Было предположено, что локальные временные области повышенной концентрации Са²⁺ генерируются с помощью активации L-TYPE VOLTAGE-SENSETIVE CHANNELS в плазматических мембранах участвующих клеток (34). Этот предполагаемый механизм генерации сигналов проиллюстрирован на Рис. 6d, на котором распространяющиеся волны деполяризации плазматической мембрны индуцируют "ультра-быстрые" волны Са²⁺. Са²⁺, который вступает в клетки в этих мембранах также взаимодействовать с др. механизмами высвобождения Са²⁺ (BOX 1) и тем самым генерировать устойчиво локализованный сигналы (71).

Роль передачи сигналов Са²⁺ во время развития NEURAL TUBE из NEURAL PLATE также известна. У эмбрионов кур краниальная часть нервной трубки развивается из нейральной пластинки путём образования двух наборов нейральных складок. Было показано (84), что воздействие Са²⁺ ионофорами ionomycin (15) и А23187 (14) индуцирует преждевременное образование складок, тогда как papavarine и verapamil (который ингибируют приток Са²⁺ через плазматическую мембрану) предупреждают образование нейральных складок обратным способом. Они подтвердили, что актин-зависимый контрактильный процесс, участвующий в формировании нейральных складок, зависит от источника внешнего Са²⁺. Это подтвержается и тем, что калмодулин вовлекается в апикальное сужение (constriction) нейроэпителиальных клеток и в возвышение нейральных складок у эмбрионов кур (85).

Примерно в то же самое время, когда формируется нервная трубка первые нейроны начинают дифференцироваться. Удалось (86) визуализовать Са²⁺ в спинальных нейронах, выделенных из эмбрионово Xenopus во время раннего развития и были выявлены и пики и волны Са²⁺. Пики имели быструю кинетику и затрагивали как проникновение Са²⁺ через запираемые эл.напряжением каналы так и CICR через RYANODINE RECEPTORS (RYRs), тогда как волны имеют медленную кинетику и зависят от инициального притока (influx) Са²⁺ через пути, которые появляются при resting потенциале , и которые затем амплифицируются за счёт высвобождения Са²⁺ из внутриклеточных хранилищ (87)(BOX 1). При блокировании всех Са²⁺ сигналов с помощью среды, лишенной Са²⁺, и затем искуственно манипулируя уровнями Са²⁺, чтобы воспроизвести или пики или волны, им улдалось показать, что эти отличающиеся Са²⁺ сигналы обладают потенциалом контролировать разные аспекты нейрональной дифференцировки; первые были способны стимулировать экспресиию γ-aminobutyric acid (GABA), а последние контролировать рост (extension) нейритов (86).

Наблюдая за ростом нейритов in vivo удалось показать (73)б что GROWTH CONE продуцируют временные увеличения уровней Са²⁺, по мере того как они перемещаются внутри спинного мозга эмбрионов Xenopus. Более того, было показано, что когда всплески Са²⁺ были супрессированы с помощью фотовысвобождения Са²⁺ chelator (diazo-2; caged BAPTA (12)), то рост аксонов ускорялся, тогда как фотовысвобождение Са²⁺ ( с использованием NP-EGTA (13)), воспроизводило временные замедления аксонального роста.

В др. работе (88) изучали роль внутриклеточных Са²⁺ сигналов в развитии моторныйх нейронов в спинном мозге интактных рыбок данио. Было показано, что бластомеры ранних эмбрионов, нагруженные BAPTA (6)буффером, блокировали временные всплески уровней Са²⁺ у эмбрионов на стадии 512 клеток и давали в результате достоверно более низкое количество мотонейронов в спинном мозге 1-дневных эмбрионов. Более того, в немногих мотонейронах, которые развивались, рост нейритов был ингибирован. В то время как результаты с BAPTA экспериментов предоставляли косвенные доказательства, что передача сигналов Са²⁺ м. участвовать в развитии двигательных нейронов более чем на одной стадии, то недавние эксперименты по визуализации и характеристике пространственного и временного паттерна сигналов Са²⁺, которые продуцируются клетками нейрональных предшественников в спинном мозге эмбрионов рыбок данио (54) предоставили первые доказателдьтсва, что передача внутриклеточных сигналов Са²⁺ важна для чсамых ранних стадий нейронального развития.

Используя живых рыбок данио, были получены доказательства того, что сигналы Са²⁺ важны и для развития головного мозга. Удалось визуализовать (32) отдельные зоны повышенных уровней Са²⁺ в презумптивном переденем мозге и областях среднего мозга и зоны с низкими уровнями Са²⁺ в презумптивном заднем мозге, которые видны в течение нескольких часов и предшествуют формированию морфологического паттерна головного мозга ( которое происходит примерно в 16 ч после оплодотворения). Наложенные на область с низкими уровнями Са²⁺ в презумптивном заднем мозге выявлялась серия пиков Са²⁺. Всплески Са²⁺ были локализованы в то же время и в презумптивном среднем мозге (51) и в месте будущей границы между средним и задним мозгом. Обе работы подтвердили, что наблюдаемые сигналы м. участвовать в диффференцировке и регионализации ЦНС рыбок данио. На Рис. 4a,b показаны два примера локальных пульсов в рудименте головного мозга рыбок данио.

передача сигналов Са²⁺, по-видимому, играет роль и в развитии глаз как у кур, так и рыб. У эмбрионов кур инвагинация оптического пузырька для образования оптического бокала, как сообщалось, регулируется Са²⁺. Было показано (89), что инвагинация м. начинаться преждевременно при добавлении Са²⁺ ионрофора А23187, в присутствии, но не в отсутствии внешнего Са²⁺. Т.к. инвагинация ингибируется обратимо с помощью verapamil и papaverine (лекарства, ингибирующего ток Са²⁺ через плазматическую мембрану), но не затрагивается ни кафеином, ни theophylline (лекарстом, мобилизирующим внутриклеточные хранилища Са²⁺), то было предположено, что источник Са²⁺, который используется при формировании оптического бокала, является внеклеточным (89).

Недавно было показано (32) у рыбок данио, что инъекции BAPTA буфера в одноклеточные эмбрионы приводят к образованию маленьких глаз. И своа при использовани рыбок данио было установлено при использовании мутантов с потерей функции N-кадхерина (parachute), что Са²⁺-зависимая клеточная адгезия является жизненно необходимой для образования слоёв сетчатки (90, 91). Рис. 4с показывает пример локализованного всплеска Са²⁺ в развивающемся глазу эмбрионов рыбок данио дикого типа, нагруженных AEQUORIN спустя 18 ч после оплдодотворения. Т.к. распространение этого сигнала зажватывает область более одного клеточного диаметра, то было предположено, что события передачи сигналов Са²⁺ м.б. сгенерированы с помощью механизма, который сходен с тем, что проиллюстрирован на Рис. 6d скорее, чем за счёт распространения межкелеточной реакционног-диффузионной волны.

Heart formation

Хотя, как известно, Са²⁺ является ключевым вторичным мессенджером для нормальной активности сердца, с хорошо известными функциями для клеточной реляксации и контракции, однако роль Са²⁺ сигналов во время ранних стадий развития сердца менее охарактеризована. У эмбрионов рыбок данио получены изображения серии низкочастотных с высокой амплитудой пиков Са²⁺ в сердце (32). Более того, инъекции низких концентраций BAPTA буффера в одноклеточные эмбрионы давали в результате образование ювеньльных рыбок с аномальным сердце, с маленькими предсердиями и желудочками, которые неспособны качать кровь, окруженные большим перикардом (32).

Дальнейшие доказательства роль Са²⁺ в развитии сердца получены на рыбках данио miles apart (mil), у который нормальная миграция клеток предшественнков сердца к срединной линии не происходит и формируются два латерально расположенные сердца. Был выделен ген mil (92) и было показано, что он кодирует lysosphingolipid G-protein-coupled рецептор, лигандом для которого является sphingosine-1-phosphate. Было также установлено, что когда клтки Jurkat T временно странсфицируются mil, то sphingosine-1-phosphate индуцирует мобилизацию Са²⁺ в этих клетках, тем самым продемонтстрировано, что мобилизация Са²⁺ с помощью этого сигнального пути м.б. важной для ранних стадий развития сердца (92).

Несколько Са²⁺-зависимых белков участвует в разных аспектах формирования сердца. У эмбрионов кур, напр., N-кадхерин экспрессируется в морфогенетическом поле сердца во время ранних стадий развития сердца, участвуя в сегрегации эндокардиальных и миокардиальных предшественников и в дифференцировке миокарда (93).

Кроме того, Са²⁺-связывающий белок calreticulin ? как было установлено. является существенным для нормального развития сердца у мышей, в отсутствие calreticulin гена эмбрионы Crt-/- погибают in utero из-за нарушений развития сердца (94). Недавно было показано, что в нормальных кардиомиоцитах повышение цитоплазматической концентрации Са²⁺ необходимо для управления кардиальным мтофибриллогенезом и что фенотип Crt-/- v/,/ воспроизведен с помощью chelating Са²⁺ или EGTA (9) или BAPTA. Кроме того, такой подъём уровня Са²⁺ не обнаруживается в кардимиоцитах, которые выделены из calreticulin-дефицитных мышей, но Са²⁺ ионофор ionomycin инициирует подём уровней Са²⁺ и последующее восстановление миофибиллогенеза в этих клетках (95).

Muscle formation

Было показано (96), что культивированный миоциты, выделенные из эмбрионов Xenopus на ранней стадии дифференцировки генерируют спонтанные всплески Са²⁺. Эти всплески, ка было показано, возникают по крайней мере частично, из RYR хранилищ, т.к кратковременное воздействие коффеина (который стимулирует высвобожденияе Са²⁺ через активацию RYR) способно воспроизводить спонтанные вспелески, но продолжительное воздействие истощало хранилища и приводило к исчезновению всплесков. Вспелеки были также выявлены и при некотрых др. аспектах дифференцировки миоцитов in vitro? таких как организация миофибрилл и формирование саркомеров, которые нарушались, если всплески были бликированы BAPTA буффером. Последующий анализ динамики Са²⁺, которая наблюдается в интактной параксиальной мезодерме эмбрионов Xenopus? показал, что всплески Са²⁺ происходят в развивающихся миотомах in vivo , которые имеют сходные характеристики с теми, что наблюдаются in vitro и они коррелируют с формированием сомитов, а также с созреванием миоцитов. В дополнение параксиальный protocadherin (PAPC), член семейства кадхеринов Са²⁺-зависимых молекул клеточной адгезии, участвует в формировании передне-задней сегментной границы во время формирования сомитов (97) путём регуляции эпителизации сомитов (98).

Всплески Са²⁺, как полагают, функционируют также на позних стадиях развития скелетных мышц. Подтверждена роль (99) внеклеточного Са²⁺ при сборке и поддержании саркомеров в развивающихся мышечных трубках, которые были выделены из задних конечностей новорожденных крыс, которая м.б. ингибирована с помощью EGTA, которая chelates внеклеточный Са²⁺, и с помощью L-type Са²⁺-channel ингибиторов, которые блокируют попадание внеклеточного Са²⁺ внутрь клетки. Кроме того получены доказательства, что члены семейства кадхеринов Са²⁺-зависимые молекулы клеточной адгезии играют роль в развитии миотомов и формировании скелетных мышц у кур и мышей (100, 101). Рис. 5 иллюстрирует серии местоположений всплесков Са²⁺ ниже туловищной мускулатуры у эмбрионов рыбок данио спустя 18 ч. после оплодотворения. И снова благодаря почти одновременному появлению сигналов на площади более, чем диаметр клетки, мы предполагаем, что они генерируются с помощью механизма, сходного с тем, что показана на Рис. 6d.

Kidney development

Относительная простата развития PRONEPHROS у позвоночных делает их поплуярной моделью для изучения морфогенеза почек (102). Хотя ещё нет прямых imaging доказательств, подтверждающих предположение, что Са²⁺ участвует в нормальном развитии пронефросов, косвенные доказательства накапливаются, которые показывают, что путь или пути передачи сигналов Са²⁺ м. играть принципиальную роль в этом процессе (103). На это указывае факт, что белки polycystin-1 и polycystin-2 экспрессируются в почечной ткани во время развития мышей и человека (104, 105). Известно, что polycystin-2 обнаруживает строгую гомологию с семейством voltage-gated Са²⁺ каналов (106) и структурно близок к и ассоциирует с TRPC1, членом семейства белков transient receptor potential channel. Кроме того, недавно установлено, что polycystin-1 регулирует Са²⁺-permeable катионовый канал (108) и взаимодействует с промежуточными филаментами в десмосомных соединениях (109) посредством С-терминального домена. Подтверждено. что это взаимодействие м.б. важным для клеточной функции передачи сигналов polycystin-1 (109), т.к. десмосомы, как известно, чувствительны к Са²⁺ и как считают функционируют сами как сигнальные центры (110). Более того, polycystin-1 и polycystin-2 способны функционировать вместе в виде мультипротеинового комплекса и таким образом продуцируют проницаемые для Са²⁺ неселективные катионовые каналы (111). Мутации в этих генах (PKD1 и PKD2)/ которые кодируют эти белки, дают в результате autosomal-dominant polycystic kidney disease (ADPKD), нарушение, которое проявляется уже во время эмбриогенеза и характеризуется прогрессивным развитием больших, выстланных эпителием, заполненных жидкостью цист внутри канальцев и собирающих протоков затронутых почек (112). Более того, ADPKD-ассоциированные мутантные формы PKD1 или PKD2, проницаемые для Са²⁺ каналы, которые возникают в результате взаимодействия polycystin-1 и polycystin-2? не образуются (111).

Кроме того, некоторые др. Са²⁺-зависимые белки учатсвуют в развитии пронефросов. Сюда входит BMP7, annexin IV и члены семейства кадхеринов. ВМР7 играет важную роль в нефрогенезе мышей и, как полагают, регулируется с помощью Wnt/Са²⁺-зависимого пути (113). Annexin IV является Са²⁺-зависимым фосфолипид-связывающим белком, который функционирует в морфогенезе пронефрических канальцев у Xenopus (114). Некоторые члены Са²⁺-чувствительныого кадхериновго семейства идентифицированы в разивающихся почках людей, мышей и рыбок данио, в которых, как полагают, они участвуют в различных мезенхимно-эпителиальных переходах, которые происходят во время морфогенеза (115-117).

Calcium-signalling targets during embryogenesis

Са²⁺-sensitive gene activation

Корреляция между пространственными паттернами передачи сигналов Са²⁺ и онтогенетической эксрессией генов наиболее важная область исследований сегодня.Известно, что Са²⁺ м. активировать сигнальные пути как в ядре, так и в цитоплазме, чтобы стимулировать экспрессию генов с помощью различных путей (118), что он м. функционировать как ингибитор, а также и как активатор генной экспрессии (119, 120) и что частота, а также и амплитуда всплесков Са²⁺ являются важными для регуляции экспрессии генов (121, 122). Мы предполагаем, что многие свойства Са²⁺-активируемой экспрессии генов, обнаруживаемые в культивируемых клетках, м. иметь отноешение и к интактным эмбрионам. В мышином бластоцисте, напр., мобилизация внутриклеточного Са²⁺ активрует некоторые гены и в то же время подавляет др. (123). Кроме того, у эмбрионов Xenopus экспрессия ранних нейральных генов Zic3 и geminin, как было показано, подавляется во время всплеска Са²⁺, который происходит в правильное время и в правильном месте, будучи ассоциирован с нейральной индукцией, она блокируется с помощью специфических антогонистов L-type Са²⁺-channel.

Са²⁺ signalling and morphogen gradients

Существует хорошо установленная связь между передачей сигналов Са²⁺ и секрецией зрелыми клеткми (124, 125). Предполагается, что сходный Са²⁺-запускаемый экзоцитоз м. играть роль в формировании онтогенетических паттернов, в котором сигналы Са²⁺ м. регулировать секрецию ключевых морфогенов и , следовательно, помогать локализации их активности или установлению градиента этих факторов у эмбриона. Напр., установление паттерна вдоль дорсо-вентральной оси у эмбрионов Drosophila базируется (в дополноение к др. факторам) на дорсальной активации пути decapentaplegic (dpp) (126). Ген dpp кодирует члена семейства трансформирующих факторов роста-β (TGFβ)из факторов роста и дифференцировки (127), известно, что Dpp обладает свойствами внеклеточных сигнальных молекул (128). Хотя всё ещё ведутся споры, но установлено, что области с повышенными уровнями Са²⁺, которые обнаруживаются на дорсальной стороне эмбрионов дрозофилы ст. 5, steepen м. усиливать внеклеточный градиент активности Dpp за счёт стимулирования секреции Dpp (33). Более того, было предположено, что эндоцитоз также м. играть роль в генерации градиентов морфогенов, таких как Dpp, с помщью пузырьками опосредуемого трансцитоза (129). Предложена модель, которая показывает, что после интернализации секретируемого Dpp, комплекс Dpp-рецептор м. или деградироваться за счёт лизосом или подергаться рециклингу на клеточную поверхность. Итак, при изменении относительного соотношения рециклинга к лизосомной дегарадации , концентрация и ранги Dpp м.б. модулированы (129). Это указывает на то, что передача сигналов Са²⁺ играет также роль и в регуляции эндоцитоза как и экзоцитоза (130). Это представляет собой др. механистическую cвязь между передачей сигналов Са²⁺ и генерацией морфогенетических градиентов.

Cell movement and architecture

Считается, что передача сигнеалов Са²⁺ важна для формообразования тканей и органов, а также для поддержания эмбриорнальной архитектуры во время развития. Это м. б. достигнуто регуляцией действия чувствительных к Са²⁺ молекул клеточной адгезии, таких как кадхерины, и чувствительных к Са²⁺ цитоскелетных элементов, таких как микрофиламенты и микротрубочки. Члены семейства кадхеринов идентифицированы, а их опредленное положение пространственно-временное распределение описано во время эмбриогенеза у разных видов (97, 131, 132). Они известны как ключевые морфогенетические регуляторы для многих стадий развития (79, 97, 131).

Некоторые сообщения указывают на F-ACTIN как обязательную мишень для сигнализации Са²⁺, это наблюдается, напр., в ростовых конусах (133-135). Кроме того, было показано, что ритмичесике управляемые микррофиламентами контракции, которые происходят в бластодерме эмбрионов рыбки медака во время эпиболии, зависят от Са²⁺ (136). Примером связи между Са²⁺ сигналами и микротрубочками также являются эмбрионы медаки, у которых инъекции dibromo-BAPTA блокируют ооплазматическую сегрегацию, из-за разрушения радиальных рядов микротрубочек, которые создают центр, организующий микротрубочки на анимальном полюсе. Са²⁺ сигналы участвуют также в сборке толстых филамент миозина во время миобибриллогенеза при формировании поперечнополосатых мышц у Xenopus.

The elemental Са²⁺-signalling events themselves

Одним из интересных аспектов передачи сигналов Са²⁺ является то, что они играют непосредственную роль в контроле транскрипционных событий, что происходит выбор типов систем передачи сигналов Са²⁺, которые будут экспрессироваться в специфических типах клеток (49). Это м.б. действительно ключевым и существенным свойством в генерации всё увеличтвающейся сложности сигнальных сетей из элементраных сигнальных событий. Временное первичное сигнальное Са²⁺ событие м. приводить к локалиной экспрессии Са²⁺ каналов или рецепторов в специфических областях клеток, которые м. в свою очередь вызывать устойчивые вторичные сигналы. Эти вторичные сигналы м. обеспечивать образование устойчивых увеличений уровня внутриклетчного Са²⁺ или распространение волн Са²⁺. Идея однако требует экспериментального подтверждения.

Interaction with other signal-transduction pathways

Взаимодействия событий передачи сигналов Са²⁺ с другими путями передачи сигналов было рассмотрено ранее (49), также как и перспективы отслеживания потоков информации в клеточных сигнальных сетях с использованием флюоресцентных биосенсоров (139). Мы подтвержадем, что разностороннесть, гибкость и реципрокная природа этих взаимодействий имеет значение и превалирует во время эмбриональнго развития, точнотакже как они функционируют в зрелых клетках и тканях. Примеры взаимодействий в раннем резвитии м. найти в процессах нейральной индукции у амфибий. Установлено, что во время нейральной дифференцировки имеется ключевой взаимодействие между noggin/BMP путём передачи сигналов и активацией L-type Са²⁺ каналов (140), в результате возникают области с повышенными уровнями внутриклеточного Са²⁺, которые в свою очередь активируют экспрессию генов ранних нейральных предшественников (30). Др. пример, упомянутый выше, это взаимодействие между XNF-AT и Wnt/Са²⁺ и Ins(1,4,5)P₃ /Са²⁺ сигнальными путями (68). Чтобы понять взаимодействие и интеграцию событий передачи сигналов Са²⁺ у эмбрионов внутри сигнальных сетей необходимо использование системных стратегий (139).

Conclusion and outlook

Мы полагаем, что дальнейшие технические усоврешенстования в некоторых ключевых областях существенно усилят наше понимание. Прежде всего будет продолжаться разработка Са²⁺ репортеров, которые м.б. нацелены на специфические типы клеток развивающегося эмбриона и на субклеточные компартменты внутри этих клеток. Имеются некоторые обнадёживающие успехи в этой области (17, 141). Следующим будет генерация целенаправленных репортеров, которы м.б. использованы как зонды для неинвазивного imagigng паттернов экспрессии генов в живых эмбрионах. Так, недавно (142) было сообщено о разработке техники долговременного imaging регулируемой генной экспрессии у рыбок данио. Третьим направлением м.б. продолжение разработки репортеров для визуализации активации чувствительных к Са²⁺ мишеней, которые обеспечивают взаимоные связи между сигналами Са²⁺ и др. онтогнетическими сигнальными сетями. Обнадёживают успехи, такие как зонды fluorescein (FL)- или GFP-сцепленный калмодулин (СаМ) (143, 144). и разработка fluorescence resonance energy transfer (FRET)-base биосенсоры для мониторинга агонистами индуцированной активации фосфолипазы С.

CALCIUM SIGNALLING DURING EMBRYONIC DEVELOPMENT
Sarah E. Webb and Andrew L. Miller
Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 539 -551 (2003); doi:10.1038/nrm1149

Links

CALCIUM SIGNALLING DURING EMBRYONIC DEVELOPMENTSarah E. Webb and Andrew L. MillerNature Reviews Molecular Cell Biology 4, 539 -551 (2003); doi:10.1038/nrm1149

Links

CALCIUM SIGNALLING DURING EMBRYONIC DEVELOPMENT
Sarah E. Webb and Andrew L. Miller
Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 539 -551 (2003); doi:10.1038/nrm1149