Smith и др. затем вносили Id1, Id2 или Id3 в ES клетки, чтобы определить, м. ли избыточная эксперссиия ограничивать нейральную дифференцировку. Возникающие в результат Id-трансфектанты оставались Lif зависимыми в услоиях бессывороточной среды и не нуждались в Bmp для само-обновления и имели идентичные свойства с родительскими ES клетками, культивируемыми при Lif плюс Bmp. Удаление Lif заставляет Id-трансфектантов дифференцироваться в эпиталиально-подобные клетки, сходные с родительскими ES клетками, обработанными только Bmp. Используя обратимые Id конструкции, они подтвердили, что когда Id экспрессируется, то предупреждает нейральную дифференцировку в отсутствие Lif, хотя клетки м. дифференцироваться в альтернативные клоны. Эта способность контролировать решения стволовых клеток ex vivo является важным в области терапии с помощью стволовых клеток, которая сдерживается неспособностью поддержания стволовых клеток в само-обновляющихся свободных от сыворотки культурах.

J.L.Kopp, B.D.Ormsbee, M.Desler, A. Rizzino (arizzino@unmc.edu). Small Inkreases in the Level of Sox2 Trigger the Differentiation of Mouse Embryonic Syem Cells Stem Cells. - 2008. - V.26, № 4, P.903-911

Используя модельную систему ES клеток с индуцибельной избыточной экспрессией Sox2, было продемонстрировано, что двукратное или меньшее увеличение белка Sox2 запускает дифференцировку ES клеток в дифференцированные типы клеток, включая нейроэктодерму, мезодерму и трофэктодерму, но не энтодерму. При этом быстро снижается экспрессия онтогенетически регулируемых генов, включая Nanog и вновь идентифицированный Lefty1, ген мишень для Sox2:Oct-3/4. Следовательно, самообновление ES клеток нуждается в том, чтобы уровень Sox2 поддерживался в узких пределах, т.е. Sox2 действует как реостат, контролирующий экспрессию критического набора эмбриональных генов.

Miwako Miura, Atsushi Ueda, Yukinari Takao, Emi K. Nishimura, Hiroshi Koide (hkoide@med.kanazawa-u.ac.jp) and Takashi Yokota A stem cell-derived gene (Sddr) negatively regulates differentiation of embryonic stem cells Int. J. Dev. Biol. 54: 33 - 39 (2010) doi: 10.1387/ijdb.082802mm Article

Embryonic stem (ES) клетки, происходящие из внутренней клеточной массы бластоцистов, являются плюрипотентными и продолжают самообновление. Чтобы лучше понять мол. механизмы, лежащие в основе самообновления, искали гены, которые специфически экспрессируются при самообновлении ES клеток. Описывается выделение и характеристика нового гена Sddr (stem cell-derived differentiation regulator). Sddr экспрессируется на высоком уровне в недифференцированных ES клетках и его экспрессия подавляется после дифференцировки. Помимо ES клеток экспрессия Sddr обнаруживается на высоком уровне в овариях и значительно слабее в лёгких. Анализ иммуноокрашивания и фракцинирования клеток указывает на то, что Sddr является цитоплазматическим белком, ассоциированным с цитоскелетом. Sddr-нулевые ES клетки не обнаруживают заметных аномали в своем недифференцированном состоянии. Напротив, в дифференцирующихся Sddr-нулевых клетках индукция некоторых ассоциированных с дифференцировкой маркеров усиливается и подавление генов маркеров само-обновления ускоряется по вравнению с клетками дикого типа. Эти результаты указывают на то, что хотя и безразличный для само-обновления ES клеток, Sddr является негативным регулятором дифференцировки ES клеток.

Shen-Hsi Yang, Tuzer Kalkan, Claire Morrisroe, Austin Smith, Andrew D. Sharrocks (a.d.sharrocks@manchester.ac.uk) A Genome-Wide RNAi Screen Reveals MAP Kinase Phosphatases as Key ERK Pathway Regulators during Embryonic Stem Cell Differentiation PLoS Genet 8(12): e1003112. doi:10.1371/journal.pgen.1003112

Ряд геномных скринингов si/shRNA стал инструментом расшифровки генетических путей ЭСК [4]-[6]. ЭСК мышей могут поддерживаться в плюрипотентном состоянии при культивировании в определенных средах (reviewed in [7]). Традиционно эти клетки культивируются в среде, содержащей сыворотку и цитокин leukaemia inhibitory factor (LIF) [8]-[9]. Однако недавно было продемонстрировано, что ЭСК мышей могут поддерживаться в базовом плюрипотентном состоянии при использовании двух специфических протеин киназных ингибиторов (известны как "2i" состояния), которые нацелены на компонент ERK пути MEK и glycogen synthase kinase (GSK3) ([10]; rev. [11]). Удаление этих двух ингибиторов способствует выходу из исходного базового состояния. Эти исследования выявили важную роль ERK и GSK3 путей для вступления в процесс детерминации судьбы клона (rev. [12]). Более того, супрессия передачи сигналов ERK у эмбрионов мыши достаточна для расширения плюрипотентного компартмента у ранних эмбрионов мыши [13] и может усиливать эффективность генерации iPS клеток, способствуя завершению репрограммирования [14]-[15]. Важно, что те же самые пути могут оперировать функционально аналогичным образом в плюрипотентных стволовых клетках человека, которыми можно манипулировать генетически [16]-[17]. Путь ERK, как было установлено, запускает дифференцировку ЭСК мышей [18]-[19] и участвует в многочисленных онтогенетических процессах (rev. [20]) помимо важной роли в разных типах стволовых клеток (rev. [21]). Менее известно о функции GSK3 в развитии и биологии стволовых клеток и роль GSK3 обычно связываю с её способностью регулировать стабильность β-catenin и, следовательно, ограничивают реакциями на передачу сигналов Wnt (rev. [11], [22]). Недавно β-catenin-зависимый способ действия был продемонстрирован для GSK3 в контексте ЭСК мыши, хотя этот способ действия недостаточен для объяснения всех эффектов передачи сигналов GSK3 в этом контексте ([23]-[24]; rev. [25]).

Одной из основных функций передачи сигналов ERK MAP является контроль программ генной экспрессии в клетках. В частности, этот путь непосредственно нацелен на ряд регуляторов транскрипции и хроматина и тем самым контролирует их активность (reviewed in [26]-[27]). Однако какие из ERK мишеней важны для дифференцировки ЭСК, неизвестно. Неясно также, как канонический ERK путь контролируется в этих клетках. В данном исследовании мы опирались на тот факт, что комбинированное использование ингибиторов ERK пути и GSK3 поддерживает плюрипотентность ЭСК мышей [10] и предприняли геномный siRNA скрининг для идентификации регуляторов и медиаторов этих путей, которые влияют на выход из плюрипотентности. Это привело к идентификации более 400 генов, чья функция необходима для эффективной дифференцировки ЭСК из базового плюрипотентного состояния. Огромное большинство этих генов не были ранее замечены в этом процессе. Более того, дальнейший анализ позволил подразделить эти гены на классы, которые функционально взаимодействуют с ERK и/или GSK3 путями и была выявлена важная роль MAP kinase phosphatases в контроле клеточной судьбы ЭСК.

Эта MAP kinase phosphatases действует как координационный центр регуляции и обнаруживает важную роль в контроле кинетики активации ERK и , следовательно, в детерминации выбора судьбы ранними ЭСК. Итак, при изучении субнабора из выявленных 400 генов удалось показать, что многие сходятся на двух негативных регуляторах одного из ключевых путей, который способствует потере характеристик ЭСК. Эти негативные регуляторы, Dusps, обычно ограничивают способность стволовых клеток менять свои функции и, следовательно, превращаться в разные типы клеток.