Juan S. Bonifacino (juan@helix.nih.gov) Nature Reviews Molecular Cell Biology5, No 1, 23-32 (2004); doi:10.1038/nrm1279
The GGA proteins are a family of ubiquitously expressed, Arf-dependent clathrin adaptors that mediate the sorting of mannose-6-phosphate receptors between the trans-Golgi network and endosomes. Recent studies have elucidated the biochemical and structural bases for the interaction of the GGA proteins with many binding partners, and have shed light on the molecular and cellular mechanisms by which the GGA proteins participate in protein sorting.
Рис.1 | Schematic representation of the domain organization of GGA1 and γ1-adaptin.
Рис.2 | Proteins with DXXLL-type sorting signals that bind to the VHS domain of the GGAs.
Рис.3 | Crystal structures of the different domains of the GGAs.
Рис.4 | Schematic representation of the structures of GAE-binding accessory proteins.
Рис.6 | Schematic representation of the assembly of GGA-containing coats.
Boxes
Box 1 | Arf proteins
Arf (ADP-ribosylation factor) proteins are small GTP-binding proteins of the Ras superfamily that have important roles in the regulation of membrane traffic and the actin cytoskeleton. Three classes of Arf proteins have been described, which, in human cells, comprise Arf1 and Arf3 (class I), Arf4 and Arf5 (class II), and Arf6 (class III)75. Class I Arfs, in particular, participate in the formation of intracellular transport vesicles and the selection of cargo for incorporation into these vesicles. They do so by recruiting various coat proteins — that is, the GGAs (Golgi-localized, γ-ear-containing, Arf-binding proteins), adaptor protein (AP)-1, AP-3, AP-4, and coatomer protein (COP)I — to membranes, and by activating lipid-modifying enzymes such as phospholipase D1 and type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase, which synthesize phosphatidic acid and phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, respectively. The activity of Arfs is regulated by specific guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs), that convert Arfs to their GTP-bound (active) and GDP-bound (inactive) forms, respectively. Arf-GEFs and Arf-GAPs far outnumber the Arfs and direct their specific activation and inactivation, respectively, at different cellular sites32.
Box 2 | Monomeric clathrin adaptors
In addition to the heterotetrameric adaptor-protein (AP) complexes AP-1, AP-2 and AP-3, many monomeric proteins have been recently shown to function as clathrin adaptors. These include: the GGAs (Golgi-localized, γ-ear-containing, Arf (ADP-ribosylation factor)-binding proteins) and enthoprotin/epsinR56-59 at the trans-Golgi network; epsin 1 (Eps15-interacting)76, 77, ARH (autosomal recessive form of hypercholesterolaemia)78, 79, Dab2 (Disabled 2)80,81, HIP1 (Huntingtin-interacting protein 1)82, HIP1R (HIP1-related)83 and Numb84 at the plasma membrane; and Hrs (hepatocyte-growth-factor-receptor substrate)77, 85 and Stam (signal-transducing adaptor molecule)86 on endosomes. These proteins: are recruited to membranes by virtue of interactions with Arfs or phosphoinositides; interact with clathrin through 'clathrin-box' or related peptide sequences; bind to AP-1 or AP-2 or to one another through specific motifs; and recognize peptide signals in, or ubiquitin conjugated to, the cytosolic domains of transmembrane proteins. The ability of some of these proteins to interact with the 'ear' domains of AP-1, AP-2 or the GGAs has led to them being included among the class of 'accessory proteins'. The discovery of these monomeric adaptors has led to a reassessment of the structure of clathrin coats, which are now viewed as scaffolds that support a diverse array of recognition proteins for different transmembrane cargoes.
Бклки оболочки, которые ассоциированы с цитозольной стороной мембраны играют ключевую роль в формировании носителей везикулярного транспорта и в выборе белков-грузов для включения в такие носители1,2. Оболочки являются супрамолекулярными ансамблями, которые откладываются на мембране с помощью регулируемой поставки составляющих их белков из цитозоля. Для большинства оболочек небольшие GTP-связывающие белки, такие как члены семейства ADP-ribosylation factor (Box 1), также как , инициируют сборку оболочек, функционируя подобно док-сайтам для белков. Адапторы, в свою очередь, соединяюся: с поддерживающми (scaffolding) белками, которые полиеризуются, чтобы сформировать наружный слой оболочки1; с accessory белками, которые регулируют или влияют на различные аспекты функции оболочки3; и с в грузовых трансмембранных белках, это обеспечивает их концентрацию в покрывающих мембрану доменах4.
Оболочки, содержащие полимеризованные в качестве их поддерживающих белков, были изучены детельно. Два гетеротетрамерных комплекса adaptor-protein (AP) — AP-1 и AP-2 — как известно участуют в рекрутировани клатрина в trans-Golgi network (TGN) и эндосомы (AP-1) и в плазматическую мембрану (AP-2). Третий AP комплекс — AP-3 — как полагают, функционирует как клатриновый адаптор на эндосомах5, хотя, по крайней мере, некоторые из его функций не зависят от клатрина6. Эти AP комплексы состоят из 4-х гомологичных субъединиц, которые организованы в стержневой ('core') домен, два ушных ('ear') или приатковые ('appendage') домены и два длинных, неструктуированных шарнирных ('hinge') сегмента, которые соединяют "ушные" домены со стержневым. Стержневые домены обеспечивают рекрутирование AP комплексов на мембрану путём соединения с Arf–GTP (AP-1 и AP-3) и/или phosphoinositides (AP-1 и AP-2). Стержневые домены соединяются также с сортинг-сигналами, которые содержатся в цитозольных хвостах грузовых трансмембранных белков. Шарнирные сегменты всех трех AP комплексов содержат 'clathrin-box' или родственные последовательности, которые связываются с терминальным доменом клатрина. Наконец, их ушные домены рекрутируют акцессорные белдки.
Первначально гетеротетрамерные AP комплексы рассматривались как главные, если не единственные, адапторы, отвечающие за сборку клатриновых оболочек и выбор груза. В последние годы однако всё увеличивается количество мономерных белков, удовлетворяющие некоторым или всем ролям клатриновых адапторов (Box 2). Ключом к возникновению этой концепции мономерных клатриновых адапторов стало открытие локализованного в Golgi, γ-ear-containing, Arf-связывающего семейства белков (GGAs). Идентификация этих белков впервые осуществлена в 2000 г (7–10). Последующие исследования этих белков выявили выдающиеся свойства этих белков, некоторые из которых и стали базой акронима GGA. Вскоре стало ясно, что GGAs экспрессируются повсеместно в виде мономерных белков, которые: содержат С-терминальный домен, гомологичный С-терминальному домену - и -субъединиц изоформ AP-1; ассоциированы с TGN и эндосомами; и взаимодействуют с Arf белками, клатрином и цитозольными хвостами внутриклеточных транспортных рецепторов. Annette Boman в 2001 (11) писала: "Hold on, there is more to come!" (Держитесь, это ещё не всё!). И в самом деле спустя 2 года была получена обильная биохимическая, структурная, морфологическая и функциональная информация о GGAs.
Domain organization
У людей имеется три GGAs (, и ), два у дрожжей Saccharomyces cerevisiae ( и ) и один у Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster. Одним из наиболее выдающихся свойств этих белков является их законсервированная модульная организация (Рис. 1). Все они состоят из тандемно расположенных трёх образующих складки доменов — обозначенных (Vps27, Hrs, Stam), (GGA and TOM (target of myb)) и GAE (γ-adaptin ear) — разделенных двумя линкерными последовательностями. ~140-остатков VHS домен выявлен также в др. белках, которые участвуют в trafficking мембраны, такие как дрожжевой Vps27 (vacuolar protein sorting 27) и Hse1 (Hbp, Stam and EAST), и соотв. их ортологи у млекопитающих Hrs (hepatocyte-growth-factor-receptor substrate) и Stam (signal-transducing adaptor molecule). Этот домен сопровождается ~20-остатками линкерных последовательностей, которые богаты пролиновыми остатками и которые соедеиняют его со следующим доменом, GAT. ~150-остатков GAT домена обнаруживаются во всех GGAs и обнаурживают ограниченную гомологию с доменом, найденным в белке, известном как (target of myb1), и в родственном белке, известном как (TOM1-like 1) или Srcasm (Src activating and signalling molecule). Следующей областью является вариабельные 80–286-остатков шарнирной последовательности, которые не обнаурживают существенного сходства последовательностей в разных GGAs и как полагают являются в основном неструктуированными. Наконец, 124-остатков GAE домена являются гомологичными ear домену γ1- и γ2-adaptin-субъединицам изоформ AP-1 (Рис. 1). Подобное чередование складчатых доменов и линкерных последовательностей делает вид GGAs как бусы на нитке ('beads on a string'), это является общим свойстом многих компонентов белков оболочки.
Function and structure of the different domains
Модульная орагнизация GGAs очень существенно облегчает вычленение индивидуальных доменов для биохимического, стуркутрного и функционального анализа.
The VHS domain. Установлено, что домен VHS белков млекопитающих функционирует как модуль распознавания сортинг-сигналов, которые присутствуют на цитозольных хвостах sortilin12 и двух (MPRs) — катион-независимых MPR () и катион-зависимыхt MPR ()13-15. MPRs известны давно в качестве сортировщиков лизосомных предшественников гидролаз в лизосомы, т.к. они проходят цикл между TGN и эндосомами16. Прохождение этого цикла зависит от сигналов, известных как 'acidic-cluster–dileucine' или 'DXXLL' (где X любая аминокислота), которые локализованы вблизи С-концов обоих MPR хвостов17-19 (Рис. 2). Ключевыми элементами этих сигналов являются кластеры кислых остатков, включая важный остаток aspartate, который располагатся тремя позициями ниже важной пары лейциновых остатков. Два дальнейших элемента, которые вносят вклад в общуюю эффективность этих сигналов, являются способные к фосфорилированию сериновые остатки, которые вставлены в кислый кластер, и размещение сигнала одного или двух остатков с конца цитозольного хвоста. Каждая из этих характеристик важна и для способности MPRs сортировать лизосомных предшественников гидролаз in vivo17-20 и для взаимодействий с GGA VHS доменами у дрожжей в двугибридном и in vitro испытаниях связывания13-15,20,21. Эта корреляция данных по сортировке и связыванию подтверждает мнение, что GGAs функционируют как адапторы для сортировки MPRs между TGN и эндосомами.
Помимо MPRs несколько др. трансмембранных белков обладает DXXLL сигналами, которые взаимодействуют с VHS доменом GGAs (Рис. 2). Хотя мало известно о обмене этих трансмембранных белков, но м. предположить, что они также м. проходить цикл между TGN и эндосомами. Поразительно, но шарнирные сегменты GGA1 и GGA3 каждый содержит по DXXLL последовательности, которая взаимодействует с лиганд-связывающим сайтом на соотв. домене VHS22. Фосфорилирование с помощью (CK2) серинового остатка, расположенного тремя остатками выше внутренней DXXLL последовательности, модулирует взаимодействие с VHS доменом23. Эта внутренне присущая DXXLL последовательность, как полагают, выполняет аутоингибирующую роль, которая является критической для функционирования GGAs in vivo24. В противоположность GGAs, белки TOM1, TOM1L1, Hrs и Stam содержат VHS домены, которые не связывают сигналы DXXLL13,15. Наконец, GGA VHS домены не связывают др. типа dileucine сортинг-сигналы, которые характеризуются мотивом [DE]XXXL[LI] (любой из остаков в квадратных скобках допустим в указаных позициях)2,13. Это указывает на специфичность взаимодействийGGA VHS–DXXLL-signal.
Структурная основа специфического распознавания сигналов DXXLL с помощью GGA VHS доменов была выяснена с помощью рентгеновской кристаллографии25-27. Домен VHS у GGAs состоит из right-handed суперспирали из 8 α-cgbhfktq, который сходен с VHS доменами TOM1 (28) и Hrs29 и напоминает (epsin amino-terminal homology) домен epsins30 и ANTH (AP180 (assembly protein of 180 kDa) amino-terminal homology) домен и AP180 и CALM (clathrin assembly lymphoid myeloid leukaemia)31 (Рис. 3a). Еpsins и AP180/CALM составляют два др. семейства мономерных покровных белков с характеристиками адпторов. Пептид DXXLL соединяется в расширенной коформации с расщелиной между шестой и восьмой α-спиралями GGA VHS домена25,26. Ключевые D и LL остатки сигнальной последовательности соединяются с электропозитивным карманом и двумя мелкими гидрофобными карманами, соответ., на поверхности GGA VHS домена, тогда как остаток phosphoserine21 и терминальная carboxyl группа25 вносят вклад во вспомогательные электростатические взаимодействия25 (Рис. 3a). Остатки из домена GGA VHS млекопитающих, которые участвуют во взаимодействиях с DXXLL сигналами не являются законсервированными в VHS доменах из TOM1, TOM1L1, Hrs, Stam и дрожжевых Ggas, это объясняет, почему эти белки неспособны связывать такие сигналы25,26.
The GAT domain. Среди первых обнаруженных свойств GGAs была их способность взаимодействовать с GTP-связанными, но не с GDP-связанными формами (8) и (7). Эти два Arfs очень близки по первичной структуре и относятся к группе 'class I' Arfs, которые контролируют рекрутирование др. белков оболочки, таких как coatomer protein (COP)I, AP-1, AP-3 и AP-4, в мембрану32 (Box 1). Молекулярный анализ GGAs показал, что эта способность связывать остатки Arf белков принадлежит их GAT доменам8,33-35. Мутационный анализ выявил область вблизи N-конца домена GAT, которая содержит ключевые остатки для взимодействия с Arf33. Мутации этих остатков устраняют не только связывание с Arf, но также и рекрутирование полной длины GGAs в TGN in vivo33,34 Кроме того, слияние GGA GAT домена с green fluorescent protein (GFP) давало химер, которые эффективно поставлялись в TGN8, 34. Эти наблюдения указывают на то, что, по крайней мере, в клетках млекопитающих взаимодействие домена GAT с Arf является и необходимым и достаточным для рекрутирования GGAs в TGN. Однако отложение химер GFP–GAT в TGN, по-видимому, гомогенно8 в противопложность точечному распределению эндогенных GGAs7-9, это подчеркивает возможную роль и др. GGA доменов в спецификации локализации в дискретных сайтах TGN. В этой связи домены VHS и GAE в S. cerevisiae Ggas, как было показано, кооперируют с GAT доменом, чтобы направить локализацию Ggas в поздний комплекс Golgi34.
Домены GAT в GGA1 и GGA2 млекопитающих также непосредственно взаимодействуют с Rabaptin-5 (36) — a эффектор, который присуствует в комплексе с Rab5 guanine nucleotide exchange factor (GEF) Rabex-5 (37). Rabaptin-5, как полагают, состоит из двух основных α-спиральных доменов (возможно структуированых в виде суперспирали), которые соединены длинной, неструктуированной последовательностью (Рис. 4). Мутационный анализ выявил область, участвующую во взаимодействиии GAT–Rabaptin-5, в виде сегмента направленного к С-концу домена GAT, и предсказанный суперскрученный сегмент в С-терминальном складчатом домене у Rabaptin-5 (36). Принимая во внимание, что комплекс Rabaptin-5–Rabex-5 ранее был замечен как участник события эндосомного связывания/слияния (tethering/fusion), которое делает возможным перенос материалов между эндосомами37, м. предполагать, что взаимодействие этого комплекса с GGAs м. подчеркивать его возможное вовлечение в перенос грузов из TGN-производных покрытых оболочкой носителей в эндосомы.
Выяснение кристаллической структуры домена GAT в GGAs проливает свет на природу взаимодействий, которые соединяют GAT домен с его партнером по связыванию. Домен GAT состоит из удлинённой, целой α-спиральной складки, которая представлена двумя субдоменами — N-терминальным 'hook', который соединяет Arf и С-терминальный 'triple-α-helical bundle', связывающий Rabaptin-5 (38–41; Рис. 3b). Субдомен hook является helix–loop–helix структурой, которая взаимодействует посредством гидрофобных и водородных связей взаимодействий с областями switch 1 и switch 2 Arf–GTP39 (Рис. 3b). Они являются в точности областями Arf, которые подвергаются крупным конформационным изменениям в ответ на окупацию GTP или GDP42. Структура субдомена hook уникальна и не найдена в др. Arf-связывающих модулях, таких как Arf-GEF и Arf-GAP (GTPase-activating protein) домены известных структур39. В самом деле, способ, с помощью которого каждый из этих модулей взаимодействует с Arf является самостоятельным. Несмотря на это поверхности на Arf, с которыми они соединяются, существенно перекрываются. Напр., Arf-GAP домен контактирует с switch 2 (43), тогда как Arf-GEF домен контактирует и с switch 1 и switch 2 (44). Следовательно, взаимодействия этих трех Arf-связывающих модулей с Arf д.б. действительно исключительным, это объясняет, почему домен GAT ингибирует действие Arf-GAP на Arf33,45.
Вторая α-спираль субдомена hook распространяется дальше, чем первая и с др. α-спиралями образует up-and-down пучёк из трёх α-спиралей38-41 (Рис. 3b). Интересно, что теоретический анализповерхности этого helical-bundle субдомена предсказывает существование законсервированного кластера гидрофобных аминокислотных боковых цепей, которые м.б. постояннями сайтами связывания для др. белков38,40,41. Этот домен напоминает N-терминальный домен некоторых target-membrane (t)-, включая , , Sso1 (suppressor of sec one 1) и (vacuolar morphology 3)38, 40. Это сходство распространяется даже на присутствие законсервированных гидрофобных участков, которые в случает этих t-SNAREs участвуют во внутримолекулярных, регуляторных взаимодействияхс 'SNARE мотивами', которые расположены ближе к С-концу белков46. Интересно бы определить, м. ли гидрофобные участки в helical-bundle субдомене GGA GAT служить сайтами связывания для Rabaptin-5 или SNARE. Если это так, то открывается возможность участия GGAs в событиях закрепления или слияния пузырьков. Этот гидрофобный участок отстоит на 35-A от Arf-связывающего сайта, , следовательно, Arf и предполагаемый вторичный партнёр м. б. соединяться с GAT доменом одновременно.
The hinge segment. Шарнирный снгмент GGAs состоит из длинной полипептидной последовательности, которая, по-видимому, в осовном не имеет вторичной структуры. Полностью растянутые эти последовательности достигают 300 A. В др. оболочечных белках последовательности подобного типа представляют собой короткие пептидные мотивы, которые заняты специфическими пептид-распознающими модулями. Напр., шарнирные сегменты β1 субъединицы AP-1, β2 субъединицы AP-2 и β3 субъединицы AP-3, все они содержат clathrin-box мотивы, которые представлены L[LI][DEN][LF][DE] консенсусными последовательностями (любой остаток в квадратных скобках возможен в соотв. позиции) и взаимодействуют с терминальным доменом тяжёлой цепи клатрина5, 47. Шарнирные сегменты трёх GGAs человека и двух S. cerevisiae Ggas содержат варианты мотива clathrin-box, которые позволяют им связывать клатрин in vitro14, 33, 48, 49. Более того, избыточная экспрессия GGAs in vivo вызывает повышенное рекрутирование клатрина на TGN33. Эти наблюдения вместе с коликализацией GGAs и клатрина в области TGN и эндосом33, 50, 51, также как и генетические взаимодействия Ggas с клатрином у дрожжей48, подтверждают мнение, что GGAs функционируют в ассоциации с клатрином.
Как уже упоминалось, GGA1 и GGA3 шарнирные сегменты также содержат внутренние DXXLL-подобные последовательности, которые связаны с их соответствующими VHS доменами по CK2-обусловенному фосфорилированию соседнего серинового остатка22, 23. Кроме того, шарнирные сегменты GGAs связывают ear домен γ1-adaptin24, хотя вовлекаемые точные последовательности и способ взаимодействия ещё не установлены. Этинаблюдаения указывают на то, что GGAs и AP-1 взаимодействуют др. с др. и м. , следовательно, кооперироваться при сортировке груза на TGN24.
The GAE domain. Домены GAE в GGAs и родственные ear домены в γ1- и γ2-adaptin-субъединицах изоформ AP-1, как было установлено, взаимодействуют со специфической кагортой дополнительных (accessory) белков в двугибридных и in vitro связывающих исследованиях у дрожжей. Эта кагорта включает γ-synergin9, 52, p56 (53), Rabaptin-5 (9,36,54,55) и epsin-родственный белок, который известен как enthoprotin56, epsinR57, 58 или CLINT (clathrin interacting protein localized in the trans-Golgi region)59 у млекопитающих и два epsin-родственных белка, известные как Ent3 и Ent5 у S. cerevisiae60 (Рис. 4). Хотя все эти белки взаимодействуют с GGAs in vitro, но GGAs и γ-adaptins обнаруживают разные педпочтительные взаимодействия in vivo. Напр., GGAs взаимодействуют преимущественно с p56, тогда как AP-1 стремится взаимодействовать с γ-synergin в клетках53. Недавно было показано, что все эти белки обладают общим каноническим пептидным мотивом — DFGXO (где O большой гидрофобный остаток) — который обеспечивает их взаимодействия с доменами GAE36, 58, 60 (Рис. 5). Этот мотив обычно обнаруживается в неструктуированной области акцессорных белков, который в случае Rabaptin-5 соответствует linker между двумя упакованными (folded) α-спиральными доменами36 (Рис. 4). Как уже говорилось GGAs взаимодействуют также с С-терминальным α-спиральным доменом Rabaptin-5 посредством их GAT домена, это указывает на то, что эти взаимодействия являются дивалентными36. Помимо одного или нескольких DFGXO мотивов все известные GAE-связывающие партнёры обладют также modular доменами и/или др. взаимодействующими мотивами, которые являются характерными компонентами обменной кухни (trafficking machinery). Они вносят вклад в распространение сети взаимодействующих белков, которые необходимы для формирования и целевого направления пузырьков, покрытых GGAs и/или AP-1.
В то время как функции γ-synergin и p56 неизвестны, некоторая функциональная информация имеется для Rabaptin-5 и epsin-родственных белков. Как уже упоминалось Rabaptin-5 участвует как часть комплекса с Rabex-5, в событиях закрепления/слияния эндосом37. Enthoprotin, Ent3 и Ent5 имеют N-терминальный ENTH домен56-60, сходный с тем, что найден на N-конце epsins 1, 2 и 3 (30). Домен epsin 1 ENTH связывает phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate таким способом, что он оказывается частично спрятанным в цитозольный листок плазматической мембраны61. Это вызывает изгибание плазматической мембраны и тем самым вносит вклад в формирование покрытой клатрином почки (buds). Домен ENTH у enthoprotin, с др. стороны, связывает phosphatidylinositol-4-phosphate57, 58 — phosphoinositide, который обилен в мембранах TGN. Следовательно, enthoprotin м. играть роль в выгбании мембраны на TGN, это сходно с тем, что делает epsin 1 с плазматической мембраной. Помимо DFGXO мотивов enthoprotin и Ent5 имеют также канонические clathrin-связывающие мотивы56-60, которые м. вносить вклад в их рекрутацию на клатриновую оболочку или в сборку таких оболочек.
Кристаллические структуры доменов GAE в GGA1 и GGA3 млекопитающих были получены53, 62, 63 и было установлено, что они сходны с таковыми ear домена γ1-adaptin64, 65 (Рис. 3c). Домен GAE состоит из 8-нитчатого β-сэндвича, который состоит из 5-нитчатого β-слоя и 3-нитчатого β-слоя. Пептид, содержащий DFGXO, из Rabaptin-5 (63) or p56 (62) соединяется в совей расширенной конформации с поверхностью, которая образуется β-нитями 4, 5 и 7 (Рис. 3c). Два якорных остатка этих пептидов являются phenylalanineи большим гидрофобным остаком, каждый из которые связан с гидрофобным карманом на поверхности домена GAE. Остаток aspartate и др. остатки по соседству с мотивом добавляют слабые электростатичеакие и гидрофобные взаимодействия, которые вносят вклад в общую силу и тонкую специфичность взаимодействий. Остаток glycine не взаимодействует с доменом GAE, но позволяет правильно позиционировать оба гидрофобных яконых остатка. Пептид-связывающие остатки в домене GAE законсервированы во всех GGAs и γ-adaptins62, 63. Различия в точных последовательностях пептидных мотивов и форма связывающего сайта м. объяснить различия в предпочтениях связывания, которые обнаруживаются GGAs и γ-adaptins в отношении специфических акцессорных белков.
Домен GAE в GGA1 также взаимодействует с клатрином33, хотя биоохимические и структурные основы подобного взаимодействия неизвестны.
Resemblance to AP complexes. Комбинация свойств всех GGA доменов согласуется с мнением, что GGAs функционируют как Arf-зависимые клатриновые адапторы для сортировки MPRs и др. трансмембрнных грузов на TGN. Замечательно, что некоторые взаимодействия, которые необходимы для этой функции, все они ограничены одиночной полипептидной цепью GGAs, тогда как сходные взаимодействия подразделены между субъединицами гетеротримерных AP комплексов. Итак, м. полагать, что GGAs являются 'компактными' адапторами. Несмотря на рарзличия в в четвертичной структуре, GGAs и AP комплексы обнаруживают заметное структурное сходство. Оба типа адапторов имеют: преимущественно α-спиральные N-терминальные домены (VHS–GAT и core), которые связаны с сортинг-сигналами и док(docking)-факторами; длинные флексибельные сегменты с пептидными мотивами для связывания клатрина; и преимущественно β-слой ear доменов. которые свящзывают акцессорные белки. Гибкость и длина шарнирных сегментов позволяет пептидным мотивам и ear доменам распространяться от мембраны к клатриновой решетке и затем поворачивать обратно в направлении пространства мембраны, где происходят взаимодействия между доменами.
Assembly and disassembly of GGA coats
На основании свойств доменов GGA начинают выявляться механизмы сборки GGA-содержащих оболочек (Рис. 6).
Membrane recruitment. Как и в случае др. адапторов, локальная активация Arf, по-видимому, инициирует рекрутирования GGAs на TGN. На Arf-GEF происходит превращение Arf–GDP в Arf–GTP, это приводит в результате к экспозиции myristoylated N-терминальной α-спирали, которая и связывает Arf–GTP с мембраной, также как и структурная перестройка switch 1 и switch 2 областей, которая делает возможным связывание Arf эффекторов32. Arf–GTP , следовательно, оказывается docking белком для привлечения GGAs в мембраны посредством взаимодействия Arf–GTP switch и interswitch области с hook субдоменом домена GAT39 (Рис. 3b). Учитывая, что Arf–GTP ассоциирует также с cis-Golgi цистернами, привлечение GGAs на TGN д. специфицироваться некими др. белками или липидами. Возможными кандидатами на эту роль др. докинг-фактора являются сами Arf-GEFs или Arf-GAPs , или определенные phosphoinositide, которыми богаты мембраны TGN. Связывание домена GAT с Arf–GTP препятсвует действию Arf-GAPs, это вызывает временную стабилизацию GGA–Arf–GTP коомплекса33, 45, это м.б. предварительным условием для последующей ступени сборки.
Signal recognition. Связываение GAT домена с Arf помещает VHS домен в тесной близости к мембране, где он м. взаимодействовать с сигналами DXXLL-типа в цитозольных хвостах MPRs и др. грузовых трансмембранных белков (Рис. 2). Это взаимодействие является мишенью для различных регуляторных импульсов. Во-первых, цитозольные GGA1 и GGA3 присутствуют в аутоингибированном состоянии благодаря CK2-фосфорегулируемому связыванию внутренних DXXLL-подобных последовательностей с VHS доменом22. Освобождение от аутоингибирования нуждается в дефосфорилировании с помощью protein phosphatase 2A (PP2A)-подобного фермента, который м. появиться после связывания GGAs с Arf–GTP23. Во-вторых, CK2-обусловленная фосфориляция серинового остатка выше сигнала DXXLL, который находится в хвостах трансмембранных грузов, даёт в результате более тесное связывание с VHS доменом21. Т.к. эффекты этих двух фосфорегуляторных событий являются противостоящими, то они д.б. объектами пространственного и временного контроля или осуществляться разными киназами. В-третьих, домен GAT освобождается от Arf–GTP для того, чтобы домен VHS м. связать сигналы, которые м. б. связаны GGA 'свободными руками' от Arf в хвосте трансмембранного груза66.
Clathrin assembly. Связанные с мембранами GGAs вносят вклад в привлечение клатрина на TGN с помощью действительных взаимодействий между clathrin-box-подобными последовательностями в шарнирном сегменте GGAs и терминальном домене тяжёлой цепи клатрина14, 33, 49. Домен GAE в GGA1 повышает жадность взаимодействий с клатрином путём связывания с всё ещё неустановленным сайтом клатрина. Пока неясно, м. ли только GGAs собирать клатрин на TGN или они м. это делать в кооперации с др. клатрин-связывающими белками, такими как AP-1 и enthoprotin/Ent5.
Binding of accessory proteins. Наконец, домен GAE в GGAs и ear домен в γ-adaptin субъединице AP-1 функционируют как платформы для сборки сети акцессорных белков, которые обеспечивают различные функции оболочек (Рис. 4). Enthoprotin м. изгибать мембрану, позволяя отпочковываться пузырькам и вообще сортируя др. грузы в формирующиеся носители. Комплекс Rabaptin-5–Rabex-5 м. обеспечивать взаимодействия с Rab5 или Rab4 в процессе целенаправленно доставки GGA-содержащих носителей на эндосомы. Домен EH (Eps15 homology) в γ-synergin м. б. использован для вовлечения белков, содержащих NPF мотивы, а p56 м. взаимодействовать с др. блеками посредством своего GRIP-подобного домена (домена, обнаруженнгго в golgin-97, RanBP2α, Imh1 и p230/golgin-245; Рис. 4). Эти акцессорные белки м. обеспечивать или регулировать сборку и разборку оболочки, отпочковываение пузырьков, взаимодействия с цитоскелетом и поставку или слияние пузырьков.
GGA-containing carriers
Процесс GGA-зависимой сортировки должен давать в конечном итоге clathrin-coated vesicles (CCVs), которые содержат GGAs в качестве их адапторов и MPRs в качестве их груза. В самом деле покрытые оболочкой пузырьки, содержащие GGAs вместе с клатрином, AP-1 и MPRs, наблюдались воочию в области TGN с помощью иммуноэлектронной микроскопии24, 33, 50. Однако GGAs являются немногочисленными в очищенных CCVs9. Это м.б. обусловлено диссоциацией GGAs во время обработки CCVs, на это указыват лабильность ассоциации GGA с мембранами после permeabilization51. Альтернативно, GGAs м. играть не только промежуточную роль в упаковке груза в формирующиеся пузырьки. В этой связи, перенос MPRs с GGAs на AP-1, как было предположено, происходит в ответ на фосфорилирование GGA1 и GGA3 с помощью фермента CK2-like, который ассоциирован с AP-1 (24). Фосфорилирование д. возвращать эти GGAs их состояние аутоингибирования, а диссоциация GGAs от мембраны будет следствием этого. В конечном счёте CCVs будут терять свои оболочечные белки en masse, после чего их непокрытые оболочкой остатки будут сливаться с соседними эндосомами, чтобы освободиться от своего груза.
Недавние исследования дали указания на существование др. типа GGA-содержащих носителей, происходящих из TGN. Imaging белки, меченные вариантами GFP в живых клетках подтвердили существование популяции tubular–vesicular носителей, которые содержат GGA1 (13,50; см ), AP-1 (50,67,68), clathrin50, enthoprotin/epsinR57 and MPRs13,68. Эти носители более pleiomorphic, более крупные и живущие дольше, чем обычные CCVs. Они перемещаются водоль микротрубочек из области TGN в периферическую цитоплазму, где они участвуют во взаимодействиях с эндосомами50,68. Эти носители, по-видимому, часть системы, которая способна к широкомасштабному распределению грузов в отстоящие области цитоплазмы. Поразительно, что покровные белки на этих носителях часто сохраняются до тех пор, пока они не достигнут периферии клетки, это открывает возможность того, что оболочки м. выполнять post-budding роли по рекрутированию моторных молекул69 и tethering/fusion факторов36,55.
Function in sorting to the lysosome/vacuole
Наиболее разумной интерпретацией всех биохимических, структурных и морфологических доказательств является то, что GGAs млекопитающих играют роль в упаковке MPRs и их лигандов (т.е., lysosomal hydrolase предшественников) в CCVs или покрытые клатрином носители, которые отпочковываются от TGN и высвобождают свои грузы или в ранние или поздние эндосомы. Доказательства подобной функции пока в основном косвенные. Единственная попытка связать GGAs с сортировкой MPRs in vivo связана с использованием укороченных GGA1 конструкций, которые соотвествуют VHS и GAT доменам13, 33. Средней степени избыточная экспрессия этой конструкции в клетках обусловливает накопление CI-MPR и CD-MPR на TGN, а их истощение от периферических эндосом, которые возможно появляются из-за интерференции с включением рецепторов в почки, покрытые клатрином. Хотя эта находка демонстрирует функциональное взаимодействие GGA1 с MPRs in vivo, однако это не исключает возможности того, что GGAs м. играть роль где-нибудь ещё, вне TGN. Фактически существенные количества GGAs, по-видимому, существуют в ассоциации с периферически распределенными структурами8,50, где они м. также функционировать в сортировке белков. Пока неясно, если это представляет собой постоянное отслеживание MPRs, когда они путешаствуют вдоль TGN–endosomal пути или исполняют целиком отличные сортинг-функции в эндосомах.
Значительно больше известно о физиологческой роли Ggas у S. cerevisiae. Делеция или генов, кодирующих Gga1 и Gga2, дают в результате незначительные фенотипические изменения8,9, 48, 70. Однако комбинированные делеции обоих генов нарушают протеолитический процессинг неактивных предшественников вакуольных гидролаз carboxypeptidase Y (CPY), proteinase A (PrA) и carboxypeptidase S (CPS)8, 9, 48, 70. Т.к. в результате процессинга возникают активные формы энзимов, обычно появляющихся в вакуолях, то этот фенотип является показателем дефектного транспорта вакуолей. Растворимые pro-CPY и pro-PrA сортируются с позднего Golgi (эквивалент TGN млекопитающих) на эндосомы путём связывания с (71), трансмембранного рецептора, который функционирует по способу, аналогичному с MPRs. Pro-CPS является трансмембранным белком, которые сортируется с позднего комплекса Golgi на эндосомы Vps10-назависимым образом. В поздних эндосомах, известных также как превакуольные компартменты у дрожжей, pro-CPS подвергаются переносу в мембранные инвагинации с помощью процесса, который зависимт от ubiquitylation хвоста pro-CPS72,73. Дефект сортировки pro-CPS более тяжелый, чем дефект сортировки pro-CPY и pro-PrA в gga1Δgga2Δ клетках48, это указывает на то, что сортировка pro-CPS более сильно зависимт от Ggas.
Сортировка pro-CPY, pro-PrA и pro-CPS проходит несколько ступеней и неясно присутствие какой из них улаживается с помощью отсутствия Ggas. Изучение поздних эндосомных SNARE Pep12 однако показало, этот белок неправильно сортируется из Golgi в ранние эндосомы gga1Δgga2Δ клеток, это указывает на то, что Ggas участвуют в транспорте из позднего Golgi в поздние эндосомы74. В согласии с этим наблюдением, gga1Δgga2Δ клетки секретируют аберрантно-расщепляемую, 'pseudo-mature' форму CPY8, 9, которая указывает на то, что pro-CPY неправильно направляется в др. протеолитически активный компартмент прежде своего высвобождения в periplasmic пространство. Наконец, протеолитический процессинг предшественника феромона спаривания pro-α-factor также нарушен в gga1Δgga2Δ клетках48, 49. Pro-α-factor обычно подвергается процессингу с помощью endopeptidase, трансмембранного энзима, который cycles между поздним Golgi и поздними эндосомами. В отсутствиеe Ggas, Kex2, по-видимому, неспособен перемещаться в поздний эндосоманый компартмент, из которого он м. возвращаться назад в поздний Golgi. Вместо этого он следует по circuitous маршруту через плазматическую мембрану в вакуоль, где он деградирует48, 49. На основании этих наблюдений м. ожидать, что дрожжевые Ggas будут взаимодействовать с цитозольными хвостами Vps10, pro-CPS, Pep12 и/или Kex2. Однако о таких взаимодействиях пока не сообщалось. Кроме того, эти дрожжевые трансмембранные белки не имеют канонических DXXLL сигналов, а VHS домены дрожжевых Ggas не содержат остатки, которые участвуют в распознавании таких сигналов25. Следовательно, возможно, что дрожжевые Ggas распознают sorting-детерминантны, которые отличны от DXXLL сигналов. Др. важное отличие в том, что дрожжевые Ggas, по-видимому, меньше зависят от Arf и clathrin связывания для функционирования по сравнению с их аналогами у млекопитающих34, 49. Всё это указывает на то, что дрожжевые Ggas участвуют в сортировке трансмембранных белков в вакуоль, хотя их точный сайт и механизм действия остаются неизвестными.
Perspectives
In just over 3 years, the GGAs have moved to the fore in studies of the mechanisms of coat-mediated protein sorting at the TGN. Rapid progress has occurred in two main areas — obtaining biochemical and structural data on the GGAs and phenotypic data on Gga-deficient S. cerevisiae strains. So, we now have detailed descriptions of the protein interactions that enable the GGAs to function as sorting adaptors, and of the ultimate consequences of their deficiency in yeast. However, a significant knowledge gap remains between these molecular and physiological aspects. A key issue that needs to be resolved is where the GGAs exert their function in protein sorting. Although all the available evidence points to the TGN as their primary site of action, it is clear that a substantial fraction of the GGAs is associated with peripheral endosomal structures. Some of these structures probably correspond to the large transport carriers that translocate from the TGN, but others seem to be present and stable in the peripheral cytoplasm. Could the GGAs have a role in protein sorting in endosomes? If so, would they be sorting MPRs or other transmembrane cargoes through DXXLL-signal recognition or through other sorting signals? What would be the direction of traffic from this endosomal location — forward to lysosomes or retrograde towards the TGN?
Another unresolved question is why there are three distinct GGAs in humans and mice. Are they largely redundant, as seems to be the case for the two S. cerevisiae Ggas, or do they each perform a specialized function? Yet another outstanding issue concerns the relationship between the GGAs and AP-1. Do they cooperate in sorting at the TGN or endosomes? Or do they function at different locations, one at the TGN and the other on endosomes? Crucial to the resolution of these questions will be a better understanding of the function of AP-1, which is unclear at present. Finally, one more avenue of inquiry will involve the study of the GGA-binding partners. A better understanding of these accessory proteins could shed light on the function of the GGAs themselves.
The continuing development of ever more powerful RNA interference methodologies should prove instrumental in answering the outstanding questions about the mammalian GGAs. The combination of genetic and biochemical approaches in yeast should also contribute to the elucidation of the function of the GGAs. If the past 3 years are an indication of a trend, we can expect even more exciting discoveries on the GGAs to be forthcoming.
