Golgi Complex: Sorting
Аппарат Гольджи: Транспорт

THE MAMMALIAN GOLGI — COMPLEX DEBATES
Brad J. Marsh & Kathryn E. Howell (Kathryn.Howell@UCHSC.edu)
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 10, 789-795 (2002)


Since the first description of the Golgi in 1898, key issues regarding this organelle have remained contentious among cell biologists. Resolving these complex debates, which revolve around Golgi structure–function relationships, is prerequisite to understanding how the Golgi fulfils its role as the central organelle and sorting station of the mammalian secretory pathway



(Рис.1.)  |  Model of part of the Golgi ribbon in a mammalian cell generated from a dual-axis three-dimensional reconstruction.


(Timeline)  |  The history of the mammalian Golgi debates


(Рис.2.)  |  Dissecting Golgi organization and transport.

Boxes

Box 1 | Key features of the mammalian Golgi complex

It functions as the central organelle of the cell secretory pathway, and interacts with the endoplasmic reticulum (ER) at both sides of the stack.
It consists of stacks of flattened cisternae that are connected at equivalent levels across non-compact regions (holes or fenestrae) to form a ribbon.
Its structure is proposed to be maintained through interactions with a unique matrix.
It contains enzymes that are involved in the post-translational modification of newly synthesized proteins and lipids (for example, phosphorylation, acylation, glycosylation, methylation and sulphation).
It contains enzymes that are capable of synthesizing complex sphingolipds and glycolipids.
Although considered 'resident', Golgi-processing enzymes are in a constant state of dynamic flux between the Golgi, ER, plasma membrane and endosomal compartments.
At the 'trans' face of the Golgi stack, cargo is sorted for exit to several destinations within the cell and for secretion outside the cell.
Molecules recycle to the Golgi from the plasma membrane through the endosomal–lysosomal pathway.
It interacts with all components of the cytoskeleton — microtubules, actin filaments, intermediate filaments, ankyrin and spectrin.
It forms a 'platform' for many signalling complexes, which, in turn, regulate Golgi function.

Box 2 | Current debates on Golgi structure–function
The current debates on Golgi structure–function are:
Is the mammalian Golgi formed de novo or by a (persistent) matrix?
What is the main mechanism of intra-Golgi transport — cisternal progression/maturation, tubules or vesicles?
Do coatomer protein complex I (COPI) vesicles function in anterograde transport?
What is the role of tubules in transport to, from and within the Golgi?
Where and how is cargo sorted for exit from the Golgi to the constitutive, endosomal–lysosomal and regulated secretory pathways?
What is the definition of the trans-Golgi network? Should we re-define it on the basis of current evidence?
What are the roles of signalling in Golgi function?

Links

Swiss-Prot: acid phosphatase | ARF1 | brefeldin A | CDC42 | εCOP | GFP | lectin | PKD | Rab 1 | Rab2 | Rab6 | Rab9 | Rab11 | Rab17

FURTHER INFORMATION
Kathryn E. Howell's lab | The Boulder laboratory for 3D fine structure




Patterson, G. H. et al.
Transport through the Golgi apparatus by rapid partitioning within a two-phase membrane system.
Cell 133, 1055–1067 (2008) Article


Существуют две основные модели транспорта белков грузов внутри аппарата Гольджи: модель везикулярного транспорта и модель созревания (или прогрессии) цистерн, последняя признается наиболее широко. Новые данные, полученные Jennifer Lippincott-Schwartz коллегами, ставят эти модели под вопрос и предалагают новую модель, согласно которой происходит быстрое распределение (partitioning) Golgi энзимов и трансмембранных грузов между двумя липидными фазами, в комбинации с быстрыми обменами между цистернами.
Согласно модели созревания цистерн существует временная задержка (lag time) перед тем как груз покинет Golgi и что кинетика его выхода линейна. Чтобы проверить это предсказание авт. избирательно photobleached весь флюоресцентно меченный груз (крупный расстворимый, малый расстворимый и трансмембранный) вне Golgi и затем подсчитывали скорость, с которой груз уходит. Все три типа грузов покидали Golgi по экспоненте скорее, чем по линейной кинетике. Затем авт. photobleached все флюоресцентные грузы в Golgi, после чего месенному грузу позволяли проникать в Golgi в течение 5 мин, и вся флюоресценция вне Golgi также photobleached. они установили, что pulse-labelled груз покидает Golgi с экспоненциальной кинетикой без временной задержки. Это указывает на то, что весь груз одинаково склонен покидать Golgi изо всех цистерн.
Lippincott-Schwartz с сотр. нагружали Golgi энзимы одним флюоресцентным маркером, а белки грузы другим и затем избирательно photobleached флюоресцентный груз и количественно определяли распределение вновь прибывшего груза в Гольджи цистерны, используя двухцветные картины (imaging). Груз не распределялся одинаково по всем компартментам аппарата Гольджи — транспорт промежуточных образований наблюдался в почки (bud) от регионов, которые были обогащены меченными белками грузами ('export domains'), тогда как 'processing domains' были обогащены меченными Golgi энзимами. Однако скорость транспорта среди цистерн была высокой, это согласуется с мнением. что цистерны являются непрерывными. Поэтому авт. предложили новую модель 'membrane partitioning' , согласно которой груз перемещается между двумя разными расположениями Golgi мембран. в
Авт. разработали эту модель на базе описанных наблюдений, в соответствие с липидным составом Golgi и дифференциальным сродством резидентных энзимов и белков грузов к разным составам липидов. Симулирование модели подразделения мембран (membrane partitioning) подволилоо подсчитать некоторые ключевые характеристики транспорта и организации Golgi, включая cis-to-trans градиент glycerophospholipids и sphingolipids, распределение постоянных белков в Golgi stack и экспоненциальную кинетику высвобождения груза. Модель может объяснить некоторые очевидные расхождения, описываемые в литературе, правда возникают новые вопросы; напр., что же является транспортным средством (т.е. пузырьки или трубочки), какой Golgi груз используется в этой модели?

FURTHER READING

De Matteis, M. A. & Luini, A.
Exiting the Golgi complex.
Nature Rev. Mol. Cell Biol. 9, 273–284 (2008) Article
Хотя Camillo Golgi описал 'internal reticular apparatus' более 100 лет тому назад, многие вопросы, связанные с Golgi все еще остаются. В клетках млекопитающих Golgi представлен полосками, уплощенными стеллажами (stacks) из цистерн, которые испещрены отверстиями различных размеров, через которые проецируются трубочки и движутся пузырьки (vesicles). В 1950s A. J. Dalton and M. D. Felix впервые использовали electron microscopy (EM), чтобы показать основное расположение цистерн. Структурные наблюдения Golgi вызвали к жизни многочисленные модели, объясняющие как молекулы перемещаются через эти органеллы. C. de Duve предложил технику клеточного фракционирования для определния функции органелл. Была предлжена гипотеза, что белки 'находятся' в специфической органелле.
В последнее время используются новейшие технологии, напр., in-vivo imaging техника и green fluorescent protein (GFP)-слитые белки для изучения мембранного переноса и высокого разрешения three-dimensional (3D) EM для выявления динамической природы и трехмерного устройства аппарата Гольджи. Рис. 1 показывает трехмерную организацию части Golgi полос (ribbon) в клетках млекопитающих. Общие свойства аппарата Гольджи млекопитающих суммированы в Box 1. Сформирована новая концепция и по-новому интерпретированы старые биохимические, микроскопические и бесклеточного assay данные.
Интеграция данных по in-vivo imaging с данными световой микроскопией высокого разрешения (~5 nm) трехмерной структуры, полученными с помощью EM томографии быстро замороженных клеток/тканей позволи разрешить вопрос структуры и динамики. Применение proteomics техники, развитой сравнительно недавно, позволит определить основные белковые компоненты Golgi и позволит определить, как эти молекулы модифицируются посттрансляционно. Функциональная proteomics обладает потенциалом выявления многих молекулярных изменений, происходящих с изменением физиологии или клеточной функции, и с помощью информатики это поле обещает очень быстрое развитие. По-прежнему остается неясным, как мембранные и сигнальные липиды участвуют в функционировании Golgi и какие функциональные модификации они испытывают для выполнения своей роли.
На Timeline показаны в исторической перспективе исследования аппарата Гольджи, суммированые в Box 2.

Golgi formation


Было предположено J. Lippincott-Schwartz и др. в 1999, что аппарат Гольджи у млекопитающих формируется за счет само-организации из компонентов, которые экспортируются из endoplasmic reticulum (ER). G. Warren и др. в 2000 предположили, что аппарат Гольджи формируется, испоьзуя сохраняющийся матрикс, на котором и собирается аппарат Golgi. Встал вопрос, каков этот матрикс Golgi и как функционирует. Хотя две группы исследователей J. Lippincott-Schwartz и G. Warren считают что их идеи несовместимы, однако, все же существует возможность, что некоторые Golgi белки и энзимы прераспределяются из и в ER, а др. матричные белки персистируют и служат в качестве семян ('seed') при воссоздании аппарата Гольджи.

Cargo movement through the Golgi


В последнее время дебаты сконцентрировались на вопросе, осуществляются ли антероградный перенос (т.е., транспорт груза далее) через аппарат Гольджи Golgi посредством пузырьков, трубочек или через процесс прогрессии/созревания цистерн. Рис. 2 представляет эти механизмы в контексте организации аппарата Гольджи у млекопитающих. mammalian Golgi. Теперь многие, но определенно не все, полагают, что каждый из этих механизмов (vesicle-, tubule- и cisternal-обеспечиваемый транспорт) играет важную роль в направленном переносе далее через аппарат Гольджи.
Эти дебаты о том, как груз движется через аппарат Гольджи давние и наиболее впечатляющие. Между 1958 и срединой 1960s, cisternal progression/maturation считался главным механизмом транспорта через Гольджи. Эта концепция cisternal progression/maturation затем была вытеснена моделью везикулярного транспорта на базе работ J.Jamieson and G. Palade.
Многие детали anterograde везикулярного транспорта были выявлены и воспиняты в конце 1980s. Идентификация компонента βCOP, из coatomer protein complex I (COPI) (группы из 7 покровных белков, которые образуют не-clathrin везикулярные оболочки для продуцируемых в Гольджи транспортных пузырьков) R. Duden и сотр. и T. Serafini и др.в 1991 сильно укрепили молель везикулярного транспорта.
Ключевые концепции и идентификация регуляторных молекул для COPI-зависимого механизма везикулярного транспорта осуществлены в исследованиях с помощью бесклеточных assay транспорта VSV-G (vesicular stomatitis virus membrane glycoprotein). VSV-G является экзогенным трансмембранным гликопротеином. Хотя ретроградный перенос (т.е., транспорт молекул обратно в аппарат Гольджи и из Гольжди в ER) был известен, но только когда на нем сконцентрировались P. Cosson and F. Letourneur стало очевидным, что одной из функций COPI пузырьков является обеспечение рециклинга ER белков из Golgi (или из промежуточного компартмента между ER и Golgi) обратно в ER. Изучение функции COPI и везикулярного транспорта начато и оно вызвало переоценку cisternal progression/maturation модели.
Накоплены существенные доказательства в пользу не-везикулярных механизмов транспорта через Гольджи. Зависит ли выбор или предоминирование данного транспортного механизма от типа клеток, стадии клеточного цикла, скорости синтеза груза? Хотя и имеются существенные доказательства, что пузырьки также являются важным компонентом транспортного механизма внутри и из Гольджи, но остается пока неясным, эти до какой степени эти др. транспортные механизмы функциональны.

COPI vesicles and bidirectional traffic


Какова же функция COPI пузырьков? Недавние исследования по imaging живых клеток с использованием ε субъединиц COPI (εCOP)–GFP покащзалди, что COPI регулируют перенос между ER и Golgi за счет создания кинетически стабильных мембранных доменов, которые являются промежуточными структурами COPI-containing транспорта. Imaging с помощью procollagen–GFP также указывает на роль COPI в регуляции экспорта груза из ER на pre-Golgi ступени сортировки. Однако, т.к. COPI комплекс состоит, по крайней мере, из 7 различных белков, то есть причины полагать, что такой комплекс м. иметь несколько взаимосвязанных функций — clathrin парадигма подтверждает эту возможность.
Тяжелая и легкие цепи клатрина функционируют как компоненты оболочки на плазматической мембране, на trans-Golgi, и возможно, на всем пути эндоцитоза. Однако, функция покрытых клатрином пузырьков в каждом из этих отдельных клеточных сайтов управляется большим количеством adaptor/effector молекул. Вопрос о том, функционируют ли COPI в anterograde внутри-Голтьжи переносе, остается нерешенным. J. Rothman и др. продолжают приводить доказательства антероградно-направленного везикулярного переноса через аппарат Гольджи. Однако, данные из ряда др. групп говорят против главной роли COPI пузырьков в forward транспорте груза через Гольджи млекопитающих

Cargo movement to and from the Golgi


До средины 1990s считалось, что пузырьки обеспечивают транспорт в и из Гольджи и между цистернами. С помощью EM было показано, что эта модель везикулярного транспорта довольно привлекательна. Концептуально, пузырьки предоставляют рациональный механизм сортировки, а пути из и в аппарат Гольджи являются главным местом сортировки в секреторных путях у млекопитающих. Трубочки, по большей части, не брались в расчет,т.к. яснфе картины трубочек редко наблюдались на тонких срезах для EM.
Т.к. иммунофлюореценция всей клетки начинает широко использоваться — особенно в комбинации с пертурбациями brefeldin A — они повлияли на нашу концепцию Golgi переноса. Brefeldin A является грибковым метаболитом, который ингибирует активацию ADP-ribosylation factor 1 (ARF1) на мембранах Гольджи и , следовательно, сборку COPI пузырьков, в результате чего транспорт вновь синтезированных белков из ER в Golgi блокируется. In-vivo imaging флюоресцентных липидов и GFP-гибридных белков выявляет как мембранные трубочки, так и большие, плейоморфные транспортные промежуточные структуры, как основные переносчики груза для формирования аппарата Гольджи. К сожалению, из-за ограничений световой микроскопии эти исследования не смгли определить, до какой степени малые пузыртьки также участвуют в данном пути.
Выполняют ли трубочки и пузырьки одну и ту же функцию и если да, то используют ли одну и ту же кухню (machinery) для сортировки грузов и задействуют ли компартментные регуляторные системы? Вносят ли трубочки также вклад в транспорт внутри аппарата Гольджи? Световая микроскопия не позволят решить эти вопросы. Флюоресцентный сигнал внутри стека (stack) обычно столь интенсивен, что аппарат Гольджи кажется единой, большой структурой. Более того, частоты, с которыми в разных лаб. наблюдаются такие трубочки с помощью EM указывают на то, что они вряд ли играют большую роль в переносе внутри Гольджи.
Rambourg и др. показали, что расширенные мостики между трубочками и цистернами служат для соединения не-эквивалентных цистерн в точках, где Гольджи полосы (ribbon) разветвляются — напр., между cis-цистерной в одной области и trans-цистерной соседней области. Такие соединения д. облегчать перемещение молекул вперед и/или назад через Гольджи в значительной степени. Разрешение вопроса, являются или нет соединения между трулочками и цистернами обычными внутри аппарата Голджи и если да, то выполняют ли они функции общего или специфического транспорта, будет очень важным для более полного понимания, как перенос мембран осуществляется через аппарат Гольджи.

Sorting and exit from the Golgi


Компартмент для сортировки груза для выхода из Гольджи определен как trans-Golgi network (TGN) G. Griffiths и K. Simons в 1986. Он называется также как trans-Golgi reticulum (TGR). Считается, что этот компартмент является одиночной наиболее trans цистерной аппарата Гольджи и сетью, которая из неё исходит. Помимо содержания молекул для сортировки груза, выходящего из Гольджи эндосомно-лизосомным регулируемым секреторным и конституитивным секреторным путём, TGN обладает несоменными структурными характеристиками. Все обилие отпочковывающихся тубуляирных и/или везикулярных мембранных профилей покрыто клатрином.
Большая часть данных указывает на то, что белки, предназначенные стать или базолатеральным доменом поляризованных клеток или предназначенные для эндоцитотического пути, сортируются с помощью распознавания специфического сигнала аминокислотных направляющих мотивов в их цитоплазматических доменах. Хотя и имеются указания на природу этих сигналов, однако полный ансамбль покровных белков и ассоциированная кухня (machinery), которые распознают, сортируют и формируют пузырьки и трубочки в trans-Golgi еще не установлены. Даже хорошо известный пример клатрином обеспечиваемого транспорта из trans-Golgi в endosomal–lysosomal путь оказывается чрезвычайно осложненным из-за идентификации многих адапторных комплексов и адаптор-подобных молекул. Апикально направляемые белки, как полагают, сортируются с помощью их lectin-подобных свойств или за счет ассоциации их трансмембранных доменов с микродоменами, которые обогащены cholesterol и sphingolipids — обозначаемыми как липидные платформы ('lipid rafts').
Собственные исследования авт. с помощью высоко-разрешающей 3D EM томографии Golgi complex покащзали, что груз сортируется не в одной, а в нескольких trans-цистернах, которые м.б. всегда отличены др от др по своей структуре, морфологии оболочки и по везикулярно/тубулярному профилю. Важно, что эти 3D структурные исследования Гольджи подтверждают и тесную ассоциацию специализированного ER с trans-цистернами. Тесная аппозиция специализированной формы ER с trans-Golgi впервые описана A. Novikoff в 1964, она стала краеугольным камнем структуры и функции 'GERL'(Golgi–ER–lysosomes). Интимная ассоциация этого модифицированного ER с trans-Golgi, вместе с согласующимся наблюдением, что наиболее trans цистерна Golgi позитивна по acid phosphatase (маркерному энзиму для лизосом), привела к формулировке 'GERL hypothesis'. Согласно этой гипотезе лизосомные энзимы обходят Golgi стек и высвобождаются непосредственно в наиболее trans компартменте Гольджи для биогенеза лизосом. Хотя концепция 'GERL' 'далека от совершенства', мы считаем, что выявление роли(й) специализированного ER в сортировке и выходе груза из trans-Golgi остается критическим для понимания функции комплекса Гольджи.
Молекулярный механизм(ы) сортировки груза, который осуществляется, по крайней мере, тремя разными путями (apical, basolateral and endosomal–lysosomal) их одиночного trans-Golgi компартмента, д. существенно отличаться от процесса, с помощью которого груз, предназначенный для каждого пути транспортировки, отсортировывается перед тем, как попасть во множественные, структурно отличимые trans-цистерны. Фактически, не совсем ясно, сколько существует vesicle/tubule популяций в Golgi и варьируют ли эти их количества существенно у разных типов клеток. Конституитивный перенос по апикальному и базолатеральному путям осуществляется как в поляризованных, так и неполяризованных клетках, а молекулы движутся по каждому пути в разных популяциях пузырьков и трубочек. Клетки, которые формируют секреторные гранулы, обладают дополнительным регулируемым секреторным путем, а морфологические данные указывают на то, что секреторные гранулы м. формироваться на разных уровнях внтруи Golgi стека (stack) и м. даже существовать в Гольджи в разных сайтах в зависимости от типа клеток. В дополнение, получены важные доказательства, что молекулы, покидающие Гольджи движутся как в ранние, так и поздние эндосомы, для этого необходима дополнительная популяция post-Golgi носителей. Чтобы выяснить сколько же различных популяций пузырьков и трубочек возникает в Гольджи, необходимо отслеживание с помощью множественных эндогенных маркеров, используя технику, такую как correlative light imaging и 3D EM.

The role of signalling in Golgi function


Многие регуляторные молекулы, локализованные в аппарате Гольжди, затрагивают его функцию. Роль ARF1 изучена лучше всего и имеетя ряд данных, подтверждающих функцию ARF1 сборке, сортировке и разборке COPI пузырьков. Функция ARF1 в свою очередь регулируется с помощью большого семейства guanine nucleotide exchange factors (GEFs) и guanine nucleotide-activating proteins (GAPs). ADP-ribosylation factors также модифицируют сигнальные липиды в бислойной мембране Гольджи и м. дополнительно функционировать, координируя взаимодействия с цитоскелетом.
Члены др. семейств сигнальных белков, которые оказываются ассоциированными с Гольджи, также модулируют его функцию. Сюда входят семейство Rab белков (в частности, Rab1 и Rab2 в cis-Golgi, Rab6 по всему стеку и Rab9, Rab11 и Rab17 вtrans-Golgi, гетеротимерные G белки, phosphatidylinositide 3-kinases и CDC42. Protein kinase D (PKD), как было установлено, ассоциирует с Гольджи и рекрутируется в Гольджи с помощью diacylglycerol. Это рекрутирование, ка было показано, связано с образованием транспортных промежуточных структур между Гольджи и плазматической мембраной. Было предположено, что Гольджи действительно функционирует как сигнальная платформа, которая регулирует перенос в мембрану, организацию цитоскелета и передачу сигналов. Однако, в этой большой картине отсутствуют доказательства и подтверждение и глобальные подходы, такие как функциональная протеомика в комбинации с информатикой, а это существенно для выявления и интеграции информации о передаче сигналов.

Conclusion and perspectives


Given the significant differences in Golgi structure that are observed among different cell types, we must seriously question whether anybody still expects that a single 'universal' transport model will prevail. A better understanding of Golgi function might be achieved by distinguishing common functional features of those Golgi structures that vary with cell type. In the foreseeable future, the Golgi research community will no longer rely on the expression of exogenous proteins such as VSV-G to study membrane trafficking and sorting. Overexpression experiments will become completely out of date as endogenous proteins are biosynthetically or post-translationally tagged with very small molecules that can not only be followed by light microscopy, but that can also be visualized at the EM level
Certainly more challenging, but also on the horizon, is the prospect of being able to detect and identify macromolecular complexes by virtue of their structure alone, in the context of high-resolution 3D cellular data. We also anticipate that better methodologies will be developed to study the contributions of lipids to Golgi-membrane traffic, and that informatics systems will effectively integrate all the data obtained from genomics and functional proteomics.
Сайт создан в системе uCoz