A plus-end raft to control microtubule dynamics and function Curr. Opin. in Cell Biol. 2003, V. 15, P. 48-53 | |
|
(Рис.1.) | Механизмы накопления МТ-связывающих белков на растущих плюс концах МТ. (а) Согласно модели разметки (treadmilling) ('transient immobilasation of protein') +TIPs (зеленым)связываются с плюс концом МТ во время ее элонгации (большая красная стрелка) (i). Это достигается за счет ко-полимеризации +TIPs с тубулиновыми олигомерами и/или за счет прямого распознавания определенных структур на растущем конце МТ ( такой как GTP шапочка или структурна шапочка). Изменения в структуре после сборки м. обеспечивать отсоединение +TIPs (маленькие карасные стрелки). Высокое сродство связывания +TIP на полимеризующемся конце (символизируется большого размера стрелкой) сопровождается т.обр. более асинхронынм отделени ем от поксимальной части МТ пространственной решетки и это ведет к образованию комето-подобной структуры во время МТ элгнгации (ii, iii). Согласно этой модели в нормальных условиях +TIPs ассоциируют преимущественно с полимеризующимися концами. Следовательно, деполимеризующиеся MN не метятся (iv). Присутствии +TIP кометы сильно коррелирует с элонгацией МТ; а ориентирование головы и хвоста кометы само по себе м.б. использовано для определения направления роста МТ и полярности МТ. (b) Согласно модели скольжения (sliding) ('delivery of proteins) +TIPs (зеленым) ассоциируют с МТ вдоль ее длины (маленькие красные стрелки, направленные к МТ) и перемещаются, преимущественно с помощью кинезин-обеспечиваемой подвижности в направлении плюс конца (большие красные стрелки). Ассоциация +TIPs вдоль МТ м. происходить на полимеризующихся МТ (i-iii), а также на распадающейся МТ (iv). Кинезиновое перемещение +TIPs v/ приводить к образованию комета-подобных структур и/или давать концентрационный градиент на периферии клетки. В зависимости от своей способности отпадать, достигнув плюс конца МТ +TIPs м. быстро теряться с плюс конца (маленькие красные стрелки указывающие прочь от конца МТ) как и в модели treadmilling , или м. оставаться на этих концах, даже во время распада МТ (iv). (Рис.2.) | Функции белков, связывающихся с дистальным концом МТ. +TIPs (зеленым) накапливаются на плюс-концах избранных МТ. Три функции этих белков. (i) +TIPs участвуют в закреплении МТ на клеточных структурах ( таких как кортикальный актин, нарисован в виде голубых линий) и в высвобождении белков на периферии клеток. (ii) +TIPs играют роль в регуляции динамики МТ, модифицируя вероятность элонгации МТ (красные стрелки, направленные к периферии клеток), укорочения (красные стрелки, направленные к центру клетки). (iii) +TIPs регулируют активность динеиновые моторов. Эти моторы переносят грузы ( серые пузырьки) в направлении минус концов МТ (turquoise стрелки). И взаимодействие с грузом, и дивжение самого динеина м. регулироваться с помощью +TIPs. (Рис.3.) | Сеть взаимодействия +TIPs. Хотя все +TIPs способны взаимодействовать с МТ, они также взаимодействуют, по крайней мере, с одним членом +TIP семейства. Прямые взаимодействия существуют между известными МТ-связывающими +TIPs показаны здесь солидными линиями. Цветные квадратики указывают подсемейства ( оранжевый для CLIP-170-родственников; голубой для CLASP-родственников; светло-зеленый для LIS1; зеленый для ЕВ1 и красный для АРС). Указаны названия лишь человеческих ортологов. Хотя LIS1 не связан прямо с p150glued все же указано его взаимодействие, которое существует с р50 субъединицей динактинового комплекса, т.к. большинство p150glued связывается с динактином в стандартных условиях. | |
){kind=link}
){kind=link}
){kind=link}
Микротрубочки (МТ) являются существенными компонентами цитоскелета, которые помогают регулировать развличные процессы, такие как миграция и рост клеток, транспорт органелл и правильное расхождение хромосом во время митозов. МТ являютя трубчатыми стукрурами, сформироваными из протофиламент, состоящими из α и β-тубулиновых гетеродимеров. Включение тубулиновых димеров в пространственную решетку МТ генерирует внутренне присущую полярнось, β-тубулин экспозируется на "плюс" конце Мт, а α-тубулин на "минус" конце. В большинстве типов клеток минус концы МТ вставлены в МТ-организующий центр (МТОС). В зависимости от определенных сигналов плюс концы подвергаются фазе роста, остановки и усадки, т.е. испытывают динамическое поведение ('dynamic instability'). Так, в мигрирующих клетках МТ обычно располагаются вдоль оси клетоного движения, при этом большинство стабилизированных МТ обращено к ведущему краю. Поляризация МТ цитоскелета вместе с актиновыми цитоскелетом важно для клеточного движения и регулируется малыми GTPases Rac, Cdc42 и Rho.
Анализ белков, слитых с GFP, в живых клетках показал, что некоторые неродственные МТ-связывающие белки специфически ассоциируют с концами растущих МТ.
A Heterogeneous Population of Proteins Associated with the Polymerising Ends of Microtubules
Сначала было установлено в исследованиях на живых клетках, что МТ-связывающийся белок CLIP-170 локализуется на кончиках только субнабора их всех МТ в фиксированных клетках. Затем было установлено, чтол и некоторые др. белки специфически ассоциируют с концами растущих МТ. Все эти белки были названы 'plis-end tracking proteins' (+TIPs). Ассоциация с плюс концами Мт наблюдалась и с ортолагами этих белков у др. организмов, напр., CLIP-170 (млекопитающие) и Tip1p (S. pombe).
CLIP-170 связывается с МТ посредством законсервированных 'CAP-Gly" (cytoskeletal associated protein-glicine-rich) доменов , которые присутсивуют также и в др. +TIPs (напр., CLIP-115 и p150glued ). CAP-Gly мотив был кристализован и было показано, что это новая типичная белковая складка. Этот домен обнаружен также в белках, которые не ведут себя как +TIP, напр., белок транс-Гольджи сети CLIPR-59 и tubulin-folding факторы В и Е.
Mechanisms for Microtubule Distal-end Assotiation of Proteins
Специфическая ассоциация GFP--CLIP-170 с дистальными концами МТ объясняется на Рис. 1. В противоположность классической разметке (treadmilling) тубулиновых димеров in vitro treadmilling GFP-CLIP170 использует ассоциацию белка с самым концом растущей МТ или с полимеризующимися молекулами тубулина или за счет распознавания специфических свойств дистального конца МТ и последющего высвобождения из старой, более проксимальной части МТ. Т.о., эффективная разметка заключается во временной иммобилизации цитоплазматических молекул GFP-CLIP-170 на кончиках МТ, при этом не наблюдается движения флюоресцентного белка в направлении элонгации МТ. Высвобождение м. нуждаться в пост-трансляционных модификациях GFP-CLIP-170 или в конформационных изменения в МТ и/или в слитом белке. Хотя фосфорилирование и ингибирует связывание МТ CLIP-170, но фосфорилирование CLIP-170 с помощью rapamycin-sensitive kinase (FRAP) увеличивает ее взаимодействие с кончиком МТ. Но РКА предупреждает взаимодействие p150glued с МТ.
Treadmilling не единственный механизм, объясняющий концентрацию белков на кончиках МТ. Напр., продукт гена adenomatous polyposis coli (APC), супрессор опухолей в толстом кишечнике человека, законсервирован у различных организмов. АРС регулирует стабилизацию β-катенина, ключевого эффектора пути передачи сигналов Wnt. Большинство мутаций АРС ведет к спорадическим и семейным формам колоректальных опухолей в результате потери С-конца белка. На дрожжах идентифицирован end-binding protein 1 (EB1) как АРС-связывающий белок. ЕВ1 в свою очередь является важным членом семейства +TIP. АРС снует между рахными субклеточными компартментами; он локализуется на кончиках МТ ЕВ1-зависимым и -независимым (но АТФ-зависимым способом.
Armadillo повторы АРС, которые отсутствуют в ЕВ1- и МТ-связывающих доменах, достаточны для локализации АРС в кортикальном кластере. Показано, что АРС взаимодействует со членами kinesin supwerfamily (KIF), KIF3A и KIF3B путем связывания KIF-associated protein (KAP3). Накопление АРС в кластерах на клеточных концах зависит от этого взаимолдействия, указывая тем самым на то, что АРС м. откладываться на клеточных концах посредством транспорта, обеспечиваемого кинезином. Следовательно, в дополнение к Treadmilling или временной иммобилизации белков на кончиках МТ, накопление м. происходить за счет высвобождения (или открыдваани) белков, которые пермещаются кинезинами (Рис. 1b). Более одного кинезина м.б. использовано для такой локализации, хотя вряд ли каждый белок плюс-конца взаимодействует с уникальным кинезином.
Хотя эти механизмы дают сходные картины накопления белков, поведение ассоциации с плюс концами МТ различно на молекулярном уровне (Рис. 1). Treadmilling +TIPs не связано с транспортом белков - только волны +TIP сигналов движутся по направлению к периферии; чем быстрее скорость роста МТ, тем выше сигнал +TIP на плюс конце. Распадающиеся МТ д.б. лишены +TIP. C этим согласуется исчезновение GFP-CLIP-170 срезу, как только начинается деполимеризация МТ. Treadmilling GFP-CLIP-170 подтверждается и fluorescence speckle анализом и обнаружением GFP-CLIP-170 на растущих, но не расподающихся концах, не связанных с центромерами МТ.
Подобно CLIP-170 EB1 локализуется только на растущих кончиках МТ в живых интерфазных и митотических клетках. Fluorescence speckle анализ яйцевых экстрактов Xenopus исключил управляемую моторами ассоциацию ЕВ1 с плюс концами МТ. Эта ассоциация объясняется преимущественно определенного типа структурными или химическими свойствами плюс концов. Диссоциация ЕВ1 осущестялется с кинетикой первого порядка. Интересно, что накопление флюоресцентных ЕВ1 молекул, которое выглядит комета-подобной тенью на дистальных концах, обнаруживается только в митотически арестованных экстрактах; в интерфазных же ЕВ1 декорирует МТ целиком и диссоциирует с более медленной кинетикой. Кажется очевидным, что цитозольные факторы (напр. киназы) м. модулировать МТ-связывающиес войства +TIPs белков перед их ассоциацией с МТ.
В противопоожность Treadmilling, высвобождение белков является зависимым от энергии, и д. создаваться градиент концентриций белка, несмотря нато, что плюс-концевые binders подвергаются рециклингу (Рис. 1b). Кроме того, если маркеры плюс-концов поднимаются вдоль МТ трека, то более длинные МТ, больше белков будет откладываеться на периферии клеток. При таком механизме распадающиеся МТ также м.б. меченными, а при низких скоростях роста ожидается накопление больших количеств белка на конце МТ. Мечение кончиков распадающихся МТ с помощью tea1p у делящихся дрожжей и накопление Kar9p на кончиках остановихших свой рост МТ у почкующихся дрожжей делает их видимыми. Это еще раз доказывает, что Treadmilling и отложение белков вносит вклад в накопление МТ-связывающих елков на дистальных кончтках.
Function of Microtubule Distal-end-binding Proteins
Известно, что МТ передают позиционную информацию и что связывающиеся с плюс концами МТ белки играют важную роль в этом процессе. М. обнаружить три функции, которые не являются взаимоисключающими, по концентрации белка на кончиках МТ.
Regulation of microtubule dynamics
У делящихся дрожжей одной из функций tip1p является действие на МТ в специфических клеточных местах, обусловливая отклонение (deflect off) их кортекса в сторону продольной оси клетки. В результате МТ способны продолжать рост и достигать концов клетки. У tip1p мутантов подобного отклонения не происходит и клетки становятся искривленными (bent). Т.к. tip1p предупреждает реверсию роста МТ к укорочению (наз. "катострофическим"), то tip1p считается анти-катострофическим фактором. Для hадиальных СНО и нормальныхз клеток почек крыс (NRK)показано. чтоМТ, исходящие из центросом имеют очень высокую вероятность достичь периферии клетки без катостроф. Оказавшись на периферии МТ начинают флюктуировать в результате высокой частоты катастроф ( благодаря эффекту клеточной границы - когда МТ, достигнув клеточной границы, перестраивают свои силы в направлеии, противоположном их росту) и высокой частоты восстановления. В результате имеется в 20 раз больше концов внутри 5 μm зоне от края клетки, чем вокруг центросомы в стабильном состоянии. В клетках СНО МТ позитивны по CLIP-170 и CLIP-115, а экспрессия доминантно-негативной формы этих CLIP вызывает снижение частоты восстановления, это вызывает изменения сети МТ. Экспрессия МТ-связывающего головного домена CLIP-170 вместе с с доминантно-негатисной формой, восстанавливает нормальную МТ динамику. Эти результаты указывают на то, что CLIPs действуют как факторы восстановления в клетках млекопитающих.
Напротив, RNA interference (RNAi)-обусловленные делеции ЕВ1 из S2 интерфазных клеток Drosophila ведет к увеличению продолжительности пауз , и снижению частоты катастроф. Рекомбинантный ЕВ1 человека, добавленный в яйцевые экстракты Xenopus, увеличивает частоту восстановлений и снижает продолжительность пауз, частоту катастроф и скорость деполимеризации in vitro. Сходный результат с bim1p, ортологом ЕВ1 у дрожжей. Сл действие ЕВ1 законсервировано.
Anchoring microtubules to cell structures and delivery of proteins to cell ends
+TIPs м. участовать в закреплениии МТ в кортексе клеток, это м. сопровождаться отложением белка на периферии клетки. У почкующихся дрожжей захват и укорочение астральных МТ в шейке почки происходит перед позиционированием веретена, для этого необходимы septins и АРС-подобный белок Kar9p. Белок Kar9p накапливается после того, как плюс концы МТ отловлены с помощью septin-позитивного кортекса. У делящихся дрожжей
Tea1p - суперскурченный домен- и Kelch-повторы- содержащий белок - необходим для поддержания линейного роста. Tea1p транспортируется на полимеризующиеся плюс концы МТ на клеточную периферию и, по-видмому, необходим МТ для эффективного распознавания кортекса. На клеточном конце Tea1p переносится с кончика, находящейся в паузе МТ, в клеточный кортекс до наступления катастрофы; Tea1p остается в клеточном кортексе за счет С-терминального суперскрученного домена. Кинезин Tea2p также участвует в контоле элонгаци делящихся дрожжей, не обязательно для перемещения Tea1p на кончик МТ.
В клетках млекопитающих CLIP-170 взаимодействует с IQGAP1, эффектором малых GTPases Rac1 и Cdc42, и способен формироваться трехчастные комплексы с активированнми Rac1/Cdc42. Это указывает на то, что Rac1 и Cdc42 маркируют специальные места закрепления (docking), где захватывается IQGAP1-CLIP-170 комплекс на кончиках МТ, приводя к поляризованному расположению МТ, а , следовательно, и к поляризации клетки. С-терминальный фрагмент IQGAP1, инъецированный в клетки, покидает enhanced-GFP (EGFP)-CLIP170 на кончиках МТ и изменяет расположение МТ. Домен взаимодействия с IQGAP1 располагается внутри области CLIP-170? которая захватывает CAP-Gly мотивы, так что было бы интресно выявить, взаимодействует ли IQGAP1 с CLIP-115 и p150glued.
Regulation of dynein motor activity
Многие +TIPs взаимодействуют с dynein-dynactin или являются частью одного из этих комплексов (Табл. 1; Рис. 3). МТ кончики на концах клеток м. приводить к закреплению динеина к клеточном кортексе, что сопровождается выталкиванем (pulling) МТ и изменением положения центросмы и ядра. Хотя и известно. что реориентация центросомы не нуждается в направленной миграции, у 3Т3 фибрбластов добалвление сыворотки запускает реориентацию МТОС благодрая активации с помощью Cdc42 динеин-динактина. Сходным образом, установлены пути интегирином-обусловленной перадачи сигналов в мигрирующих астроцитах крыс, которые используют Cdc42, mPAR6-PKCζ и динеин. Этот путь контролирует выпячивание мембраны и реориентацию МТОС, аппарата Гольджи и МТ сети в направлении ведущего края.
+TIPs м. также создавать 'landing' платформу для динеина на плюс концах МТ для закрепления органелл, которые затем транспортируются в МТОС. Действиетльно подтверждено, что конгчики МТ взаимодействуют с пузырьками перед их движением внутрь клетки. Интересно, что у фиброластов отсутствие CLIP-115 ведет к увеличению уровня CLIP-170 и p150glued на кончиках растущих МТ, тогда как избыточная экспрессия CLIP-115 в клетках COS-1 вызывает удаление этих белков. Это указывает на то, что CLIP-115, CLIP-170 и p150glued обычно конкурируют за места связывания на кончиках МТ, возникающее в результате перераспределение белков м. влиять на регуляцию динеиновго мотора.