Mammalian genes involved in nucleotide excision repair
Boxes
| Types of DNA damage and responses to it
| DNA repair
| Xeroderma pigmentosum
(Box 4) | The conundrums of CS, XP/CS
and TTD
A prevalent feature of Cockayne syndrome (CS) is
photosensitivity, without the pigmentary disturbances or other skin
problems that are characteristic of XP.
The mean age of death of patients with CS is about 12 years and the
few patients who have survived to early adulthood do not manifest
skin or other types of cancer.
The photosensitivity of individuals with CS prompted the early idea
that they might be defective in DNA repair. Skin fibroblasts from
these individuals are, indeed, more sensitive to killing by UV
radiation than normal cells.
However, measurements of global NER were normal.
During the early 1980s, Alan Lehmann and his colleagues made the
important observation that cells from individuals with CS recover
from an inhibition of RNA synthesis that accompanies exposure to UV
light much more slowly than normal cells do.
Further studies established that this cellular phenotype reflects
defective transcription-coupled NER (TCNER),
establishing CS as a DNA-repair-defective disorder. It is now
recognized that TCNER specifically requires the products of two
genes called CSA and CSB and that defects in either
gene can lead to the disease.
The molecular pathogenesis of this disease remains uncertain as the
precise functions of the CSA and CSB gene products are
not known.
So far, only a small number of patients have been identified as
having the syndrome, and all of these have mutations in either the
XPB, XPD or XPG genes.
Skin cancer at a young age has been documented in some, but not all,
of these cases.
The XPB and XPD genes have also been implicated in
trichothiodystrophy (TTD).
Most patients with TTD are sensitive to sunlight. However, they do
not develop the severe skin problems characteristic of XP, nor the
typical features of CS. The primary clinical phenotype is that of
brittle hair and nails owing to a deficiency in a class of
sulphur-rich proteins in these tissues. Physical and mental
retardation, as well as ichthyosis (scaly skin), are also prevalent.
At the cellular level many, but not all, cases of TTD are defective
in NER. But skin cancer has not been documented in this
disease.
Genetic analysis has implicated the XPD gene in most cases.
However, in one case the cellular phenotype of defective NER in
vivo was complemented by microinjection of XPB
complementary DNA.
Defective NER in cells from yet another case was phenotypically
corrected by fusion with either XP-B or XP-D cells, leading to the
assignment of a third genetic complementation group called
TTD-A.
Эукариотические клетки м. репарировать многие типы повреждений ДНК. Nucleotide excision
repair (NER) — специфически защищает от мутаций, вызываемых косвенно средовыми канцерогенами. Люди с врожденными дефектами NERстрадают от xeroderma pigmentosum и имеют заметную предрасположенность к раку кожи, вызываемого солнечным светом.
Классическая Дарвиновская эволюция, конечно, существенно зависит от многих источников генетической изменчивости, возникающей в популяции зародшевых клеток, так что понятие 'exceptional genetic stability' является относительным (Рис. 1).
Как клетки у млекопитающих защищаются против вредных послествий соматических мутаций? Понять это помагает феномен репарации ДНК в нормальных клетках человека и наследственное заболевание (XP), которое характеризуется дефектом репарации ДНК и повышенным риском возникновения рака кожи в ответ на воздействие УФЛ.
DNA damage and repair
Одиночные точковые мутации обычно возникают при репликации ДНК, которые являются некоей формой реакции на . Поврежденные основания, в свою очередь, возникающие в результате нескольких различных внутриклеточных механизмов (спонтанные base damage), а также внеклеточных агентов (средовые base damage), изменяют химию и/или последовательность nitrogenous оснований в ДНК (Box 1). Все вместе различные известные источники спонтанных повреждений оснований (Box 1) нарушают примерно 25,000 оснований на геном человека на клетку в день, 3 - 109 оснований на геном. Относительно средовых повреждений ДНК, воздействие УФЛ является повсеместным и мощным источником повреждений ДНК клеток кожи. Др. источником являются химические канцерогены, которые вызывают повреждения ДНК в клетках, которые для них доступны (в частности дыхательный и пищеварительный тракт).
Мутационный потенциал, вызываемый повреждением основания реализуется с помощью обычной репликации ДНК поверх такого повреждения. Но поврежденное основание м. также вызывать преждевременный арест репликации ДНК и/или транскрипции, что ведет к гибели клетки. В самом деле, груз поврежденных оснований, возникающий естественно и из средовых источников, должен быть несовместим с жизнью на смотря на то, что клетки обеспечиваются специфичесскими механизмами репарации повреждений ДНК и поддерживания мутаций на разумном уровне. Одной из главных биологических реакци на повреждения ДНК является репарация ДНК — биохимический путь, с помощью которого поврежденные, несоответствующие (такие как присутствие урацила в ДНК) и неправильно спаренные основания восстанавливаются в их нативном состоянии (Box 2). Следовательно, мутационный груз в данный момент времени в зародышевой линии и соматических клетках является результатом динамического равновесия между степенью повреждений ДНК и эффективностью репарации ДНК , а в делящихся клетках физической близостью продвигающейся ДНК к месту повреждения впереди вилки.
Nucleotide excision repair.
Nucleotide excision repair (NER) является одним из нескольких механизмов репарации ДНК (Box 2), с помощью которого поврежденные основания удаляются из генома. Процесс включает эксцизию таких оснований как части олигонуклеотидного фрагмента в отличие от base excision repair (BER), при которой поврежденные или несоответствующие основания вырезаются как свободные основания, или от mismatch repair (MMR), при которой неправильно спаренные основания вырезаются как одиночные нуклеотиды. NER в клетках человека является сложным биохимическим процессом, нуждающимся в нескольких белках (Табл. 1). Белки человека, необходимые для NER, собираются упорядоченно, ступечато в месте повреждения основания, они являются субстратом для NER. В результате сборки образуются большие мультипротеиновые комплексы (иногда обозначаемые
nucleotide excision repairosome). Исследования на дрожжах показали, что некоторые из этих комплесов м. предварительно собираться в клетках, еще не имеющих повреждений ДНК.
Однако, это утверждение принимается не всеми. Репарационный комплекс является разносторонней 'NER machine', которая м. распознавать многие типы повреждений оснований, которые часто обнаруживают мало, если вообще обнаруживают, структурное или химическое сходство, разрезает (incise (nick)) ДНК на точном расстоянии от любой стороны поврежденного основания исключительно на поврежденной нити ДНК и удаляет олигонуклеотидный фрагмент, включая и поврежденное основание (Рис. 2). Все три биохимические события воспроизведены in vitro с использованием очищенных NER белков человека и дрожжей (Табл.1, Рис. 2)).
В клетках человека олигонуклеотидные продукты NER состоят ~ из 25–30 нуклеотидов. Пробелы, образуемые в дуплексе ДНК, репарируются за счет синтеза ДНК с использованием оппозитной, нормальной нити ДНК в качестве матрицы (Рис. 2). Этот процесс называется чтобы отличать его от репликативного синтеза ДНК. Чтобы закончить процесс последний инкорпорированный нуклеотид NER ковалентно соединяется с имеющейся ДНК путем ligation (Рис. 2). In vitro использование очищенных NER человека показало, что биохимические события, которые предшествуют репарационному синтезу (которые катализируются с помощью NER machinery), м. происходить независимо от репарационного синтеза и ДНК ligation. Эти последние два события м.б. физически связанными путем взаимодействия между и DNA polymerase accessory белком proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Такое взаимодействие важно для BER. Итак, в клетках человека, по-видимому, оперируют два отдельных мультипротеиновых комплекса последовательно во время NER — мультипротеиновый комплекс, который отвеает за распознавание поврежденных оснований и инцизию ДНК, а repair synthesis–DNA-ligation клмплекс отвечает за post-incision события. Осталось установить, какой из этих комплексов в действительности вырезает олигонуклеотидные фрагменты.
Критическим аспектом NER, который остается слабо изученным, это то, что эукариотическая ДНК интимно ассоциирована в гистонами и сложена в нуклеосомы. Упорядоченная структура нуклеосом и их сверхупакованность, генерирующая хромосомы, делает определенного типа процессы разборки и перестройки хроматина обязательными, так что необходимые большие мультипротеиновые комплексы для NER м. делать доступными места повреждений оснований, в частности в областях генома, которые транскрипционно молчат.
В транскрипционно активных областях, разборка или перестройка хроматина, которые сопровождают транскрипцию, м. позитивно предоставлять частично или все для доступа, необходимого для NER. Это ведет к распознаванию определенного способа NER, названного transcription-coupled NER (TCNER), чтобы отличать от той, которая оперирует в покоящемся геноме и которая не зависит от транскрипции RNA polymerase II (т. наз. 'global genome repair').
Early steps of NER in transcriptionally silent DNA.
Три события, которые специфичны для NER — распознавание поврежденных оснований, бимодальная инцизия ДНК и вырезание олигонуклеотидных фрагментов —
известны в деталях. Способность NER machinery распознавать многие типы повреждений оснований и отличать их от неповрежденной ДНК (включая неповрежденную нить, непосредственно противостоящую поврежденному основанию), также как и от ДНК, содержащей типы повреждений, которые не являются субстратом для NER, являет собой загадку. Однако, известно, что некоторые субъединицы NER мультипротеиновой машины специфически необходимы для этого процесса. Сюда входит и белок, называемый XPC(Табл.1, Рис. 2), который мутантен у индивидов с xeroderma pigmentosum из генетической C (XP-C), второй XP белок, (Табл.1, Рис. 2), и комплекс из трех белков, известный как replication protein A (RPA) (Табл.1, Рис. 2). Очищенный XPC белок связывается преимущественно с ДНК, содержащей разные типы повреждений оснований ДНК, которые являются субстратом для NER. Однако, точные молекулярные детерминанты, которые способствуют связыванию, неизвестны. Получены также доказательства в исследованиях in vitro, согласно которым связывание XPC белка с поврежденной ДНК является скорость ограничивающим для процесса NER, указывая тем самым. что это связывание является ранним, если не инициальным биохимическим событием NER.
Геном человека содержит два родственных, но не идентичных ортолога дрожжевым NER генам . Белки, кодируемые генами человека названы и (human homologue of RAD23) (Табл.1 ). Очищенный из клеток человека, XPC тесно комплексуется с HHRAD23B. In vitro, NER м. осуществляться в отсутствии HHRAD23B, но эффективность реакции in vitro существенно усиливается в его присутствии. Делеция обоих Hhrad23 генов у мышей (но не одного из них) ведет к эмбриональной гибели (Табл.1), указывая тем самым, что помимо их участия в NER HHRAD23A и HHRAD23B белки млкопитающих обладают неизвестной перекрывающейся функцией, связанной с жизнеспособностью клеток. Третьий белок, названный centrin2/caltractin1, присутствует в центросомах некоторых организмов, он выявлен в XPC/HHRAD23B комплексе и, по-видимому, участвует в стабилизации XPC белка с помощью HHRAD23. Эта ассоциация открывает интересную возможность регуляторных взаимоотношений между NER и делениями клеток.
XPA является металопротеином, который также преимущественно связывается со многими типами поврежденной ДНК in vitro (Табл.1), а RPA (первоначально называемый single-stranded binding protein) (Табл.1) жадно связывается с однонитчатой ДНК. Типы повреждений оснований, которые способствуют NER генерировать до некоторой степени раскручивание ДНК дуплекса, обеспечивают тем самым связывание RPA. XPA и RPA как полагают, связываются с ДНК после присоединения XPC–HHRAD23 (Рис. 2). Показано, что распознавание всех типов повреждений оснований во время NER нуждается в двух фундаментальных элементах: разрыва обычных Watson–Crick спаривания оснований и изменения химии в поврежденной нити, обычно за счет оснований. Некоторые пациенты с XP из генетической комплементационной группы E имеют дефекты NER, но точная роль(и) XPE в этом процессе неизвестна и не является обязательной для NER в воссозданных системах.
Сайты специфического распознавания субстрата для NER, прослеженые с помощью ступенчатой сборки покоящейся NER machinery, представлены (по крайней мере)полипептидами, показанными на Рис. 2. Среди них имеется субкомплекс, называемый стержневым transcription factor IIH (TFIIH), который состоит из 6 субъединиц (Табл.1). Эти 6 субъединиц (вместе с добавочными белками) составляют одну из нескольких RNA polymerase II , которые необходимы для инициации транскрипции с помощью RNA polymerase II транскрипционной кухни. Неясно, как этот основной транскрипционный фактор стал частью NER мультипротеиновго комплекса. TFIIH облегчает частичное раскручивание дуплексной ДНК.
Центральными в этом процессе являются две ДНК helicases (раскручивающие белки) XPB и , субъединицы TFIIH (Табл.1, Рис. 2), которые как полагают, выполняют эту функцию во время как транскрипции, так и NER. Во время транскрипции, процесс раскручавания (bubble
formation) способствует инициации новым мРНК транскриптов. Напротив, раскручивание ДНК во время NER с помощью TFIIH генерирует дискретные соединения между двунитчатой и однонитчатой ДНК на концах bubble структур(Рис. 2). Эти соединения фундаментальны для правильных разрезов ДНК во время NER. Имеются и др. субъединицы комплекса NER, представленные двумя , которые вырезают соединения между двунитчатой и однонитчатой ДНК с установленной полярностью. Эндонуклеазная активность (Табл.1) вырезает поврежденную нить ДНК с 3' относительно места повреждения основания (Рис. 2), тогда как эндонуклеазная активность ERCC1–XPF гетеромерного белка (Табл.1) разрезает поврежденную нить с 5' (Рис. 2). Как уже указывалось, расстояние между этими разрезами в поврежденной нити ДНК ~ 30 yerktjnbljd. Поврежденное основание всегда располгается лиже к 3' разрезу (Рис. 2). Однакоr, точное расстояние между разрезами варьирует от одного типа повреждения основания к др.
Присутсвие разрезов ДНК, фланкирующих поврежденное основание, дает олигонуклеотидный фрагмент, который удаляется из ДНК. Точный механизм удаления еще не установлен. Возможно, что эксцизия олигонуклеотидов по времени и механистически связаны с репарационным синтезом ДНК, так что образования больших однонитевых пробелов (которые м.б. быть чувствительны к атаке нуклеаз, и м.б. вести к разрывам генома) не происходит во время эксцизии олигонуклеотида (Рис. 2).
Transcription-coupled NER.
Известно, что скорость NER в генах млекопитающих, которые активно транскрибируются быстрее, чем в молчащих областях генома. Повышенная кинетика NER в транскрипционно активных областях объясняется более высокой скоростью NER на транскрипбируемой нити ДНК, по сравнению с нетранскрибируемой нитью. Механизм transcription-coupled NER (TCNER) неизвестен в деталях, пока описан для NER в транскрипционно неактивных областях. Люди и мыши, которые генетически дефектны по XPC сохраняют способность TCNER (Табл.1), это ведет к заключению, что XPC не нужен для этого процесса. Как же повреждения оснований специфически распознаются во время TCNER? Предполгается, что распознавание повреждений дополнительно обслуживается с помощью арестованной транскрипционной кухни RNA polymerase II (Рис. 3). Этот арестованный комплекс, как полагают, включает дополнительные белки, которые, хотя и не являются обязательными компонентами нормальной транскрипционной кухни (machinery), рекрутируются в места ареста транскрипции (Рис. 3). Среди них два белка, CSA и (Табл.1, Рис.3), заслуживат особое внимание, т.к. мутационная инактивация генов, кодирующих эти белки, ведет к наследственному заболеванию, называемому Cockayne syndrome. Комплекс, собираемый на месте ареста транскрипции, как полагают, содержит NER компоненты. рассмотренные выше, а также др. белки (Рис. 3). Следовательно, последующие биохим. события во время TCNER те же самые, что и при global NER в транскрипционно молчащей ДНК (Рис. 3). Взаимоотношения между NER и RNA polymerase II транскрипцией — отраженые в потребности TFIIH на ступени раскручивания ДНК во время NER как в транскрипционно активной, так и молчащей ДНК (Рис. 2) — не должны конфликтовать с взаимотношением между NER и RNA polymerase II транскрипцией, которые отражаются ступенью распознавания повреждения TCNER.
Defective NER predisposes to cancer
Xeroderma pigmentosum in humans.
Аутосомно рецессивное наследственное заболевание у человека XP (Box 3) впервые описано врачем Moritz Kaposi (известная Kaposi sarcoma) и его коллегой Ferdinand Hebra. XP характеризуется тяжелой предрасположенностью к кожным опухолям разных типов, в основном к и (Box 3).James Cleaver и Richard B. Setlow независимо установили, что клетки от пациентов с XP дефектны по NER. Затем на молекулярном уровне получены одназначные доказательства того, что неспособность репарировать повреждения оснований, особенно тех, что возникают в результате воздействия УФЛ, усиливает мутационный груз в клетках и ведет к неопластическим трансформациям.
Генетическая сложность XP продемонстрирована слиянием клеток от разных пациентов и наблюдениями фенотипической коррекции (комплементации) дефектного репаративного синтеза в слитых клетках с ядрами от двух пациентов (гетерокарионы). Таким же способом выявлено 7 групп генетической комплемнтации (обозначенных XP-A -> XP-G) и гены, дефектные в каждой группе (XPA - > XPG), были клонированы.
Потеря функции восьмого гена, названного XPV также вызывает XP, включая предрасположенность к раку кожи, но не связана с нарушением NER. Вместо этого он вызывает дефекты разных клеточных реакций в ответ на повреждения ДНК, которые нуждаются в аккуратном репликационном обхождении индуцированных УФЛ повреждений оснований (Box 3). Следовательно, XP фундаментально возникает в результате накопления мутаций в ДНК клеток кожи, после воздействия солнечным светом. Мутации могут накапливаться или из-за фотопродуктов в ДНК или не удаляются с помощью NER, или из-за нарушения репликативного bypass этих повреждений (Box 3). Выявление молекулярной патологии как XP, ассоциированных с дефектной NER, так и той, что ассоциирована с непрпавильным репликационным bypass повреждений оснований, предоставляют убедительные подтверждения для опухолей у человека, и для роли генов репарации ДНК, как важных опухолевых супрессоров или "дворников" ('caretakers') генома.
Mouse models of XP.
С помощью нокаута генов удолось получить мутационную инактивацию некоторых XP генов у мышей (Табл.1), получены мышиные модели болезни человека. В целом они аккуратно воспроизводят заметную предрасположенность к раку кожи в результате облучения УФЛ. Они оказались информативны также и в отношении др. аспектов NER и ее взаимосвязи с предрасположенностью к опухолям, которые не выявлялись в исселованиях у человека. Напр., тот факт, что люди с XP дефектны по NER во всех клетках ведет к ожиданию, что это может проявляться повышенным риском опухолей в таких органах как легкие, желудок и толстый кишечник, которые являются частыми мишенями химических канцерогенов. Благодаря редкости заболевания и очень ограниченного числа ХР пациентов это не возможно изучить в деталях. В этом отношении мутантные мыши являются пригодными экспериментальными моделями. Xpa мутантные мыши склонны к опухолям кожи, лимфоидной системы и печени в результате воздействия хим. канцерогеном benz[a]pyrene (Табл.1) и к раку кожи после воздействия 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA) (Табл.1). Сходным образом, ка кдоброкачественные, так и злокачественные опухоли печени и легких появляются наиболее часто у Xpc мышей, после воздействия канцерогеном N-acetoxy-acetylaminofluorene (AAF) или его метаболически активным производным
N-hydroxyacetyl aminofluorene (N-OH AAF) (Табл.1). Следовательно, повышенные уровни опухолей в иных местах помимо кожи, глаз и языка у XP людей в основном отражает потенциал солнечного света как канцерогена, а ранняя гибель большиснтва XP пациентов происходит от солнечным светом индуцированных опухолей или тяжелой нейрологической дегенерации.
Могут ли индивиды, гетерозиготные по XP, иметь повышенный риск опухолей кожи? Не выявлен соотв. фенотип у гетерозигот по XP (биологических родителей XP пациентов), хотя в одном исследовании 31 семьи с XP задокументировано, что показатель не-меланомных опухолей кожи достоверно выше у кровных родственников. На мышах показано, что после примерно 50 недель кинетика индукции опухолей кожи у Xpc гетерозиготных мутантов (Xpc+/-) достоверно выше, чем у сибсов дикого типа. Этот пример по Xpc локусу подтверждает, что связывание XPC с местом повреждения основания во время инициальной ступени NER является скорость-ограничивающим событием. На базе кожных опухолей у мышей
Xpc+/- м. скринировать индивидов на предметобразования кожных опухолей в очень молодом возрасте из-за гетерозиготности по всем XP генам. Это позволяет предупреждать XP гетерозиготных индивидов о риске воздействия солнечных лучей и даже курения.
Когда Xpc гомозиготные мутантные (Xpc-/-) мыши скрещиваются с Trp53 (ортолог TP53 человека) мутантами, то скорость развития индуцированных УФЛ кожных опухолей коррелирует с генотипом следующим образом: Xpc-/-/Trp53-/- > Xpc-/-
/Trp53+/- > Xpc-/- /Trp53+/+. Следовательно, инактивация аллелей Trp53 ускоряет развитие кожных опухолей у мышей. Это генетическое взаимодействие не ограничивается опухолями кожи. Trp53-/- мыши аномально склонны к различным типам опухолей, включая , лимфомы и различные саркомы. Но если такие животные дополнительно Xpc-/-, то они образуют тестикулярные опухоли быстрее, чем Trp53-/-/Xpc+/+ сибсы. Эти мыши не подвергались воздействию УФЛ или др. внешних канцерогенов. Таким образом, эти наблюдения указывают на некторый тип спонтанных повреждений ДНК, репарация которых нуждается в NER machinery в целом или в XPC белке в частности. Эта идея подтверждается независимыми наблюдениями на мышах, показывающими увеличение частот спонтанных мутаций у и у Xpc-/- и у Xpc+/- мышей (но не у Xpa мутантных мышей) с возрастом.
Some NER mutants are not cancer prone
Рак кожи, индуцированный солнечным светом четко ассоциирует с дефектами в XPA, XPC, XPE, XPF и XPG генах и с некоторыми, но не со всеми мутациями XPD гена. Так как XPB и ERCC1 гены также необходимы для NER (Табл.1, Рис. 1), то следует ожидать, что рак еожи м. появляться и у индивидов, дефектных по этим генам. ERCC1 является субъединицей гетеродимерной эндонуклеазы, называемой XPF–ERCC1 (Рис. 1). Однако, Ercc1 мутантные мыши или нежизнеспособны или погибают вскоре после рождения (Табл.1). Более того, не идентифицированы люди с XP с мутациями в гене ERCC1. Следовательно, мутантные ERCC1 аллели несовместимы с эмбриогенезом или постнатальным развитием у человека.
Белки XPB и XPD необходимы для транскрипции RNA polymerase II (Табл.1). Некоторые индивиды с мутациями в этих генах жизнеспособны и некоторые из них обнаруживают склонность к опухолям кожи. Последняя группа носителей мутаций, которая, по-видимому, инактивирует NER, но не нарушает функции транскрипции TFIIH. Наиболле интересны др. пациенты с XP-D, как и большинство пациентов с XP-B, имеющие помимо XP клинические признаки синдрома Cockayne (CS) (Box 4). Три XP-B родословных идентифицированы с 4 затронутыми индивидами, три из которых страдали от XP/CS complex, и один от trichothiodystrophy (TTD) — болезни, которая характеризуется сухой чашуйчатой кожей и ломкостью волос и ногтей.
Обычная форма CS (не осложненная XP) возникает в результате исключительно дефектов в генах CSA или CSB, которые необходимы для TCNER, так что индивиды с CS дефектны по TCNER (Box 4). Однако кожные опухоли не характерны ни для CS ни для комбинации XP/CS syndrome (Box 4). Некоторые пациенты с XP/CS complex (XPB/CS и XPD/CS) имели рак кожи, который ассоциировался с облучением солнечным светом. Однако, известно лишь около десятка XP/CS пациентов по всему миру, так что трудно делать заключение о склонности к опухолям. Пациенты с др. классом мутаций в гене XPD имеют и TTD — также е склонны к образованию опухолей кожи.
Обнаружение, что TFIIH существенен как для транскрипции, так и для NER, и что XPB и XPD белки являются субъединицами TFIIH, привело к идее, что мутации. затрагивающие только функцию NER этих белков, м. давать типичную XP, если затронуты обе функци, то возникает комбинированный XP/CS синдром, если же нарушена функция транскрипции, то возникает TTD. Аллели классических XP и TTD оказались неперекрывающимися. Однако, эта модель неспособна решить некоторые вопросы. Во-первых, почему мутации в гене XPD связаны с чувствительностью к облучению УФЛ и с дефектами NER у большинства TTD пациентов, но тяжелые кожные нарушения, включая опухоли кожи, отсутствуют? Линия мышей, несущая гомозиготную мутацию, идентичную той, что встречается у пациенов с TTD, не только в точности воспроизводят фенотип TTD, но и вызывают предрасположенность к опухолям кожи после воздействия УФЛ. Во-вторых, если некоторые мутации в XPB или XPD м. вызывать комбинированный синдром XP/CS или TTD, то почему мутации в этих генах никогда не вызывают "чистый" CS?
Возможно, что трудно уловимые дефекты в транскрипции скорее всего дают pleiomorphic фенотипические следствия, которые м. варьировать в зависимости от природы мутаций в XPB или XPD генах. Недавно установлено, что количества TFIIH в экстрактах клеток определенных TTD индивидов снижены. В соответствии с этой регуляторной интерпретацией ряд TTD пациентов обнаруживает пониженную экспрессию β-globin гена, который транскрибируется обычно на высоком уровне в окончательно дифференцированных эритроцитах.
Gjxtve Почему мутации в XPG гене вызывают также комбинированный XP/CS синдром? XPG функционирует как endonuclease во время NER и не известно ее участие в транскрипции RNA polymerase II у людей. Однако, инактивация XPG гена у мышей вызывает раннюю постнатальную гибель (Табл.1), указывая на важность др. функции XPG помимо функции в NER. Мутации в XPG гене у пациентов с комбинированным XP/CS синдромом всегда связаны с тяжелыми укорочениями XPG, которые могут устранять вторичную предполагаемую функцию и приводить пациентов к гибели в раннем возрасте. Недавние исследования показали, что эта вторая функция, общая для XPB
и XPD белков, используется в BER при оксидативных повреждениях оснований транскрибируемой нити транскрипционной активных генов (Рис. 3).
CS and TTD in mice.
Линии мышей, мутантные по Csa или Csb генам, не обнаруживают постнатальной задержки роста или нейрологических дефектов, обнаруживаемых у людей с CS (Табл.1). Однако, на клеточном уровне эти мыши подобно CS людям — дефектны по TCNER (Табл.1). Более того, после воздействия УФЛ и Csa и Csbмутантные мыши обнаруживают склонность к опхолям по сравнению с нормальными сибсами (Табл.1), хотя кинетика появления опухолей кожи замедлена по сравнению с XP мышами. Сходным образом, Ttd мыши (которые в точности воспроизводят клинический фенотип TTD у людей), склонны к опухолям кожи после экспозиции УФЛ. Почему же тогда у людей с CS, комбинированный синдром XP/CS и TTD в целом не обнаруживают повышенной чувствительности к опухолям кожи (Box 4)? Возможно, что эти пациенты сильнее повреждены, чем XP индивиды и их частое пребывание в постели защищает их от воздействия солнечного света. Однако, нельзя исключить возможность, что снижена транскрипция RNA polymerase II у пациентов с CS, TTD или XP/CS и это меняет функцию онкогенов, которые необходимы для развития опухолей. Установлено, что если Csb мутантные мыши скрещиваются с Ink4a-/-/ARF-/- мышами, которые имееют повышенную скорость спонтанных лимфом и фибросарком, то двойные мутанты имеют существенно сниженную частоту таких опухолей. Гены Ink4a и ARF являются опухолевыми суппрессорами, участвующими в регуляции нормального клеточного цикла.
Future directions
Специфические механизмы репарации ДНК, особенно BER, MMR и NER, известны в существенных деталях. Известна внутренняя взаимосвязь между различными процессами репарации ДНК, а также между репарацией и транскрипцией ДНК. Однако, механистические детали способов эксцизионной репарации, связанных с транскрипцией RNA
polymerase II все еще неизвестны. Более того, некоторые взаимоотношения между репарацией и транскрипцией ДНК определенно имеют важное регуляторное значение.Напр., тот факт, что TFIIH функционирует при NER и транскрипции RNA polymerase II указывает на то, что транскрипция м.б. ограничена в скорости во время активной NER.
Идентификация центросомного белка в NER machinery указывает на то, что м. существовать взаимосвязь между клеточным делением и NER, а недавние исследования на дрожжах выявили регуляторные взаимодействия между NER machinery и протеосомам — макромолекулярным комплексом, обычно связанным с деградацией белков с помощью ubiquitylation. Однако, взаимодействия между дрожжевой NER machinery и протеосомами, по-видимому, не зависят от протеолиза. Биохимическа роль XPE в NER в клетках млекопитающих неизвестна и необходимо выяснить еще множество загадок относительно многочисленных ролей XPB, XPD, ERCC1 и XPG генов.
Обнаруживаются все новые пути эксцизионной репарации. Напр., установлена новая форма NER у низших эукариот, которая удаляет определенные типы больших повреждений оснований с помощью биохимически отличающегося пути эксцизионной репарации. Наконец, идентификация новых типов естественно возникающих повреждений оснований почти всегда выявляет один или несколько новых способов их репарации.
Определение гаплонедостаточности у Xpc гетерозиготных мутантных мышей подтверждает важность изучения роли гетерозиготных состояний у людей с XP и оценки возможных факторов риска, ассоциированных с полиморфизмами во всех генах ДНК репарации. В самом деле, полиморфизм интронных poly(AT) инсерций/делеций в гене XPC ассоциирует с повышенным риском опухолей слущивающихся (сквамозных) клеток головы и шеи.
