Посещений:
Остеобласты: Влияние ВКМ

Control of Osteoblast-Specific Gene Expression by the Extracellular Matrix Enviroment
R.T.Franceschi
Connective Tissue Vol.35, No 3, P.147-153. 2003

Внеклеточный матрикс (ВКМ) играет важную роль в дифференцировке и функционировании остеобластов. Как клетки, наделенные в первую очередь синтезом маткикса, остеобласты д. облать способностью мониторинга состава ВКМ, который они секретируют, и модифицировать продукцию матрикса в соответствии с меняющимися механическими нуждами в кости. Неизвестно, как это осуществляется. Но имеются строгие доказательства того, что дифференцировка остеобластов и сборка колагенового матрикса тесно взаимосвязаны. Показано, что ВКМ-испускаемые сигналы регулируют дифференцировку и экспрессию генов остеобластов.
Use of accorbic Acid as a Tool to Undestand the Role of ECM in Osteoblast Differentiation


АА является существенным кофактором гидроксилирования проколагеновых цепочек, необходимого ступени для образования тройной спирали, секреции и сборки коллагеновых фибрил. Т.о., при нехватке витамина С продукция коллагенового матрикса существенно блокируется. In vivo и формирование кости и дифференцировка остеобластов, осуществляемая за счёт экспрессии мРНК остеокальцина и щелочной фосфатаза, сильно редуцирована у животных с дефицитом витамина С в диете. Эпидемиологические исследования показали, что сходное снижение приёма с пищей втамина С вызывает снижение костной массы у женщин после менопаузы. Эта потребность выявляется также in vitro, где АА необходим для дифференцировки и минерализации культуры первичных остеобластов и нетрансформированныз остеобласт-подобных клеточных линий, таких как МС3Т3-Е1 клетки мышей. Показано, что действие АА на дифференцировку остеобластов опосредуется через коллагеновый матрикс. Нарушение секреции матрикса специфическими ингибиторами или ферментативное переваривание секретируемого коллагена блокирует индукцию связанных с остеобластами генов. Сходная потребность в синтезе коллагена продемонстрирована в ряде др. эксперимент. систем, включая культуру первичных остеобластов и обработанные ретиновевой кислотой ROB-C26 клетки из мультипотентной линии мезенхимных клеток.

ECM Regulation of the Osteocalcin Gene


Синтез ВКМ увеличивает уровни мРНК остеокальцина и активность промотора гена примерно в 20 раз в МС3Т3-Е1 клетках. Эта реакция нуждается в OSE2, в нижестоящем сайте связывания промотора для транскрипционноо фактора остеобластов Runx 2/Cbfa 1. Мутация или делеция этого элемента устраняет реакцию на сигналы от ВКМ. Более того, OSE2 олигомеры в отсутствие др. промоторных элементов способны обеспечивать реакцию на матрикс минимальной промоторной конструкции остеокальцина в 34 nt. Хотя делеционный анализ подтверждает, что др. вышестоящие области промотора остеокальцина между -657 и -147, которые содержат дополнительный OSE2 сайт, м. вность вклад в чувствительность к ВКМ, однако нижестоящий OSE2 сайт очевидно более существеннен, т.к. точковые мутации в этом элементе устраняют реакцию на АА 657 nt промоторной конструкции.
Интересно, что воздействие АА сопровождается также 5-кратным увеличением связывания Runx 2/Cbfa 1 OSE2 ДНК в исследовании по сдвгу электрофоретической подвижности. В предварительных исследованиях также было установлено усиление взаимодействия Runx 2/Cbfa 1 с OSE2 последовательностью в интактных клетках с помощью иммунопреципитации хроматина. В результате было показано, что Runx 2/Cbfa 1 антитела способны иммунопреципитировать больше связанного хроматина из клеток, обработанных АА, чем контрольных. Т.о., синтез ВКМ стимулирует остеобласт-специфическую транскрипционную активность, частично за счёт активации ткане-специфического транскрипционного фактора Runx 2/Cbfa 1, и эта активация сопровождается усилением сродства Runx 2/Cbfa 1 к сайту связывания распознающей ДНК. Вторым неожиданым наблюдением стало то, что действительные уровни белка Runx 2/Cbfa 1 не изменяются во время дифференцировки, индуцированной АА. Это указывает на то, что наблюдаемое увеличение транскрипционной активности Runx 2/Cbfa 1 скорре всего объясняется пост-транскрипционными модификациями этого фактора.

Integrin-mediated Signaling Events Control the Matrix Response


Предполагалось, что матрикс взамиодействует с клеточной поверхностью посредством специфичесикх интегринов, которые инициируют пути внутриклеточной передачи сигналов, ведущих к остеобласт-специфической экспрессии генов. Интегрины являются принципиальными медиаторами молекулярнго диалога между клетокй и ее ВКМ окружением и являются критическими для таких процессов как морфогенез ткани, заждивление ран, миграция и прикрепление клеток. Все интегрины функционируют в виде диморов, состоящих из α и β субъединиц. Уникальные комбинации субъединиц предопредляют, какие молекулы ВКМ будут распознаваться клеткой. Напр., коллаген типа I вызаимодействует и α1β1 и с α2β1 интегринами, тогда как фибронектин связывает α3, α4, α5: β1 димеры. Интегрины передают информацию о внеклеточных условиях за счёт осуществления как прямой физической связи между ВКМ и актиновым цитоскелетом посредством белков talin, vinculin и paxillin, так и посредством сигнальной трансдукции молекул, чтобы стимулировать каскады фосфорилирования тирозинов с участием mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) и др. путей.
Накапливаются доказательства, подтверждаеющие роль интегринов в дифференцировке остеобластов. Остеобласты, как известно экспрессируют некоторые виды субъединиц интегринов, включая α1, α2, α3, α4, α5, αv, β1, β2, β3. Более того нарушение взаимодействий интегрины:ВКМ, особенно тех, что вовлекают коллаген и фибронектин, блокирует дифференцировку и минерализацию остеобластов. Так, добавление антител к α2 интегрину или DGEA пептида, который является компонентом клеточного связывающего домена коллагена типа I, блокирует АА-зависимую индукцию щелочой фосфотазы и зависимое от дифференцировки подавление TGF-β рецепторов в клетках МС3Т3-Е1. Эта реакция, по-видимому, нуждается в focal adhesion kinase и МАР киназном пути, т.к. селективное подавление любого из этих участников блокирует индукцию щелочной фосфатазы. Было также показано, что пептид, содержащий RGD клетка-связывающий домен фибрнектина, ингибирует и формирование и резорбцию кости в системе минерализованной органной культуры. Сходное долговременное культивирование остеобластов черепного свода с антителами против фибронектина или с фибронектиновыми пептидами, содержащими RDG клетка-связывающий домен, как было показано, супрессирует дифференцировку. Установлено, что нарушение функции интегрина α2 с помощью анти-α2 антител и DGEA пептидов также блокирует АА-зависимую индукцию экспрессии гена остеокальцина, дифференцировку остеобластов и связывание Runx 2/Cbfa 1 с OSE2 ДНК. Те же концентрации анти-α3 интегриновых антител или RGD-содержащих пептидов оказались неактивными.
Установлено, что драматическое зависимое от матрикса увеличение связывания Runx 2/Cbfa 1 с OSE2 ДНК не сопровождается параллельными изменениями уровня мРНК или белка транскрипционного фактора. Это указывает на то, что ВКМ индуцирует модификацию Runx 2/Cbfa 1, чтобы усилить его активность как транскрипционный энхансер скорее, чем фактор, увеличивающий уровень белка. В качестве одного из первых трансдукторов интегриновых сигналов в ядро клетки MEK/ERK ответвление пути МАРК создает правдоподобную связть между активацией интегрина клеточной поверхности и последующей стимуляцией Runx 2-зависимой транскрипции. Недавно было установлено, что U0126, специфический ингибитор МАРК, быстро и специфически ингибирует и ERK фосфорилирование и ВКМ-зависимую индукцию OCN и bone sialoprotein генов.

ECM, Growth Factor and Mechanical Signals Stimulate Runx 2/Cbfa 1 Phosphorylation


В сходных исследованиях было показано, что избыточная экспрессия постоянно активной мутантной МЕК1, киназы, стоящей непосредственно перед ERK1/2 в каскаде МАРК, индуцирует и жндогенную мРНК и промоторную активность OCN и более того эта реакция нуждается в Runx 2/Cbfa 1 и в интакной последовательности OSE2. Было показано, что Runx 2/Cbfa 1 фосфорилируется с помощью МАРК пути. Фосфорилирование увеличивается после трансфекции клеток постоянно активной МЕК1 и и ингибируется с помощью доминантного негативной мутации МЕК1. Следовательно, МАРК- зависимый каскад фосфорилирования регулирует активность Runx 2/Cbfa 1. Хотя специфические аминокислотные остатки в Runx 2/Cbfa 1, необходимые для чувствительности к и фосфорилирования с помощью МАРК, еще неизвестны, но известно, что они располагаются в 270 аминокислот области proline/serine/threonine-rich (P/S/T) домене в С-терминальной части молекулы. Эта область содержит ряд консенсусных сайтов МАРК фосфорилирования.

Regulation of Runx 2/Cbfa 1 Phosphorylation by FGF2 and Mechanical Force



FGF2 является важным in vivo регулятором развития и роста скелета. Премежающееся применение FGF2 м. восстанавливать костную массу у крыс после оварийэктомии, модели потери кости в пост-менопаузе. Избыточная экспрессия FGF-2 у трансгенных мышей вызывает преждевременную минерализацию, ахондроплазию и укорочение длинных костей, тогда как разрушение FGF-2 гена ведет к уменьшению костной массы и формирования кости. Более того, активирующие мутации FGF рецепторов ассоциируют с серией краниосиностозных синдромов, характеризующихся ускоренным формированием внутримембранозных костей в швах свода черепа. Т.к. основым путем передачи сигналов от FGF рецепторов является активация ответвления MEK/ERK пути МАРК, то была предпринята серия исследований для проверки, нуждается ли FGF2 индукция гена остеокальцина в активности МАРК и в фосфорилировании Runx 2/Cbfa 1. Сначала было установлено, что FGF2 м. бысто индуцировать фосфорилирование ERK и стимулировать мРНК OCN в клетках МС3Т3-Е1 и в стромальных клетках костного мозга. FGF2 стимулирует также активность трансгенеа в 1.3 т.п.н. OCN промотор-liciferase репортерный ген и эта стимуляция м.б. блокирована с помощью ингибитора MEK/ERK, U0126. Эта стимуляция обнаруживается только в клетках, содержащих дикого типа Runx 2/Cbfa 1 (P/S/T доменовый мутант нечувствителен), и нуждается также в интактном сайте связывания Runx 2/Cbfa 1 в промоторе OCN. Метаболическое мечение показало, что уровень фосфорилирования Runx 2/Cbfa 1 увеличивается при воздействии FGF2 и что эта реакция также предупреждается U0126.
Установлено, что механическая нагрузка играет важную роль в регуляции гомоестаза кости и морфологии скелета во время развития и в постнатальной жизни, когда она увеличивает плотность кости и силу. Напротив отсутствие нагрузки на скелет у людей и крыс, напр. во время космического полета. ассоциирует с потерей кости и снижением механических свойств костей. Путь МАРК является одним из принципиальных сигнал-трансдуцирующих каскадов, ассоциированный механотрансдукцией. Интегрины м. переводить мезанические стимулы в биохимические сигналы. Напр., показано, что механическое натяжение активирует ERK2 и JNK1 , но не р38 в кардиальных фибробластах крыс и что активация нуждается в присутствии двух интегринов α4β1 и в не-α5β1, интегрине, а также в ВКМ (фибронектине). Сходное приложение механической силы к остеобластам специфически посредством интегринов, содержащих α2 и β1, индуцирует активацию МАРК. Два недавних исследования подтвердили важность связи между Runx 2/Cbfa 1 и механиотрансдукцией. В одной работе было показано, что Runx 2/Cbfa 1 м. действовать как мишень для механических сигналов в клетках human peridontal ligament (hPDL)( т.е. в остеобласт-подобных клетках, которые м. диффере6нцироваться в направлении остеобластов в ответ на разнооьобразные внеклеточные стимулы). Низкий уровень постоянных механических нагрузок на hPDL клетки дараматически увеличивает связывание Runx 2/Cbfa 1 с OSE2 ДНК, хотя наблюдалось также легкое увеличение мрНК и белка Runx 2/Cbfa 1. Подобная стимуляция обнаруживается после непродолжительного 30 мин. давления, достигая пика спустя 6 ч и длящаяся, по крайней мере 12 ч. Фосфорилирование ERK1/2 активируется время-зависимым образом в механически растягиваемых hPDL клетках и это хорошо коррелирует с увеличением Runx 2/Cbfa 1 связывающей активности. Более того, индуцируемое растяжением увеличение в Runx 2/Cbfa 1 ДНК связывающей активности полностью устранялось U0126, специфическим ингибитором активации ERK1/2. Особенно интересно то, что активированная растягиванием ERK физически взаимодействует с Runx 2/Cbfa 1 и м. фосфорилировать этот транскрипуионный фактор in vitro. В др. исследовани получены доказательства того .что и активация ERK и фосфорилирование Runx 2/Cbfa 1 нужадются в передаче механических сигналов в стромальных клетках костного мозга мыши и человека. Было показано, что extracorporeal shock wave (ESW) является альтернативным не-инвазивным медодом для стимуляции пролиферации стромальных клеток и дифференцировки остеобластов. Оптимальное воздействие ESW на стромальные клетким костного мозга при 0.16 mJ/nm2 в 500 импульсов увеличивает включение [3H]-thymidine в ДНК, активность щелочной фосфатазы, экспрессию гена OCN и образоване костных узелков. Интересно, что ESW драматически стимулиует ERK-зависимое фосфорилирование Runx 2/Cbfa 1, хотя при этом не меняется уровень белка Runx 2/Cbfa 1. Т.о., механические силы м. регулировать пролиферацию и дифференцировку остеобластов, а тажке формирование кости посредством МАРК- зависимого фосфорилирования Runx 2/Cbfa 1.
Итак, остеобластиы д. контактировать с коллаген-содержащим ВКМ, чтобы дифференцироваться. Они связаны с этим матриксом посредством взаимодействий между коллагеном типа I и специфическими β1 интегринами. Связывание интегринов лигандом активирует МАРК и родственные пути, которые трансдуцируют сигналы в ядро. Runx 2/Cbfa 1 фосфорилируется и активруется с помощью МАРК, это позволяет ему стимулировать дифференцировку остеобластов за счёт повышения транскрипции остеобластных маркерных генов, таких как OCN. Процесс активации до конца непонят, но , по-видимому, он влияет на способность Runx 2/Cbfa 1 взаимодействовать со специфическими сайтами связывания ДНК в генах-мишенях. Кроме того он м. влиять на взаимодействия Runx 2/Cbfa 1 с др. ядерными факторами.

ECM-dependet MAPK Activity is also Necessary for BMP Responsivebess


И остеобласты и сторомльные клетки костного мозга секретируют BMPs. Эти факторы стимвлируют дифференцировку посредством аутокринной петли, которая м. б. блокирована специфическими антогонстами ВМР. Действие BMP на остеобласты также нужадается в матричных сигналах и м.б. блокировано с помощью U0126. В отсутствие синтеза ВКМ BMPs оченть слобо стимулируют экспрессию генов остеобластов, а между BMP и ВКМ сигналами наблдюается строгая синергичность. Это указывает на то. что активация МАРК важна не тольо для чувствиетльности к сигналам ВКМ, но и для стимуляции с помощью этого важного класса факторов дифференцировки.

Conclusion


Регуляторные сигналы представлены на Рис. ( т.е. те, что инициируются BMPs, ВКМ, FGF2 и механическими нагрузками. Показана также регуляция с помощью РТН, но это вне рамок статьи. Предполагается, что активация Runx 2/Cbfa 1 посредством фосфорилирования является критическим для этого фактора, чтобы сдалеть его транскрипционно активным. Фосфорилирование м.б. вызвано несколькими способами: 1) ВКМ связывается с интегринами на клеточной поверхности и активирует focal adhesion kinase (FAK) и ветвь MEK/ERK пути МАРК; 2)Активация receptor tyrosine kinase (КЕЛ) в рецепторах FGF2 также активирует MEK/ERK путь; 3) Механические нагрузки активируют путь мАРК; 4) Путь классической protein kinase A (PKA), активируемый с помощью PTH/PTHrP рецепторов также м. стимвлировать фосфорилирование Runx 2/Cbfa 1 в сайтах, отличных от тех, которые используются путём MEK/ERK. Напротив, стимуляция МАРК пути посредством PKC является потенциальным маршрутом для передачи перекрёстных сигналов от PTH/PTHrP рецепторов посредством активирования Gq. Путь РКА также регулируется АР-1 родственными факторами, подобными cFos и cJun путем фосфорилирования cAMP response element binding protein (CREBP). AP-1 факторы регулируют экспрессию генов, связываясь с АР-1 сайтами в генах, связанных с остеобластами, а также взаимодействуя с Runx 2/Cbfa 1. Наконец, путь BMP/Smad контролирует Runx 2/Cbfa 1 экспрессию возможно непосредственно усиливая активность гена Runx 2/Cbfa 1. Кроме того R-Smad-Smad4 гетеродимеры м. прямо взаимодействовать с SBEs в регуляторных областях генов, связанных с остеобластами, а также формировать комплексы с Runx 2.
Fdn/ полагают, ято Runx 2/Cbfa 1 м. рассматриваться как фокальная точка интеграции разнообразных сигналов, затрагивающих активность остеобластов. Эти разнообразные сигналы м. влиять на активность Runx 2/Cbfa 1, изменяя уровни транскрипционного фактора, состояние фосфорилирования или взаимодействия с др. транскрипционными факторами, такими как Smads и АР-1 родственные факторы и Osx.
Сайт создан в системе uCoz