Выявлена строгая экспрессия fragilis у основания формирующегося аллантоиса, в области где бнаруживается обычно PGC кластер на ст. Е7.25. Обнаруживается лишь слабый сигнал в мезодермальной части позади амниона, и что важно, экспрессия не распространяется на аллантоис. Экспрессия fragilis сохраняется вплоть до ст. поздней почки (Е7.5), но постепенно ослабляется примерно на ст. головной складки (Е7.75) и существенно снижается в мигрирующих PGCs на Е8.5.
На ранней стадии толь слабая экспрессия fragilis обнаруживается по всему эпибласту эмбрионов Е6.0). Но примерно на Е6.25-Е6.5 (перед гаструляцией) заметная экспрессия обнаружи вается в наиболее проксимальном слое эпибласта, который интимно контактирует с внеэмбриональной эктодермой, источником сигнальных молекул, включая Bmp4 и Bmp8b. Экспрессия fragilis и в самом деле индуцируется внеэмбриональной эктодермой. C началом гаструляции домен экспрессии мигрирует в задний конец развивающейся первичной полоски на ст. ранней/средней полоски и становится очень интенсивным в позиции, где дифференцируются PGCs, начиная со ст. поздней полоски. Экспрессия fragilis первоначально распространяется в более проксимальную область, которая, по-видимому, охватывает некоторые из клеток раннего зачатка аллантоиса, соседствующие с этой областью Эта экспрессия fragilis однако слабее, чем в PGC кластере и позднее снижается в направлении к периферии. Это согласуется с паттерном возникновения и миграции PGC предшественников. Ген fragilis , следовательно, первым маркирует начало приобретения компетентности зародышевых клеток и это согласуется с сегрегацией зародышевых клеток от предшественников аллантоиса.
Ген stella, впервые обнаруживается на стадии поздней полоски, примерно Е7.0. Локализация, время и специфичность сигнала stella заметно совпадет с пявлением молодых PGCs. При сравнении с экспрессие fragilis экспрессия stella обнаруживается только в субнаборе клеток в центре fragilis-позитивных клеток. На ст. поздней почки (Е7.5) интенсивность сигнала stella увеличивается и некоторые клетки, которые м. расматривать как мигрирующие из инициального кластера. также окрашены. На ст. Е8.5 группы мигрирующих PGCs окрашиваются исключительно в развивающейся задней кишке. Это строго указывает на то. что stells это первый ген, экспрессирующийся в клоне, ограниченном молодыми (nascent) PGCs и , следовательно, клоном зародышевых клеток.
Диссоциированные клетки (Е7.25) обнарживают Fragilis в плазматичекой мембране, а также в презумптивном аппарате Гольджи, что предполагает быстрый синтез и транспорт fragilis на поверхность клеток. Более того, fragilis линейно концентрируется на местах межклеточных контактов , это согласуется с его принаделжностью к IFN-индуцибельным белкам клеточной поверхности. Напротив, stella обнаруживается как в цитоплазме, так и ядре, с ядерным окрашиванием до некоторой степени комплементарным с таковым propidium iodide, это указывает на то, что stella м. локализоваться в структурах ядерного матрикса. Установлено, что ряд fragilis-позитивных клеток существенно больше, чем stella-позитивные клетки. Двойное окрашивание антителами выявило, что только клетки, которые обладают высокой экспрессией fragilis, позитивны по stella. Stella обнаруживается также в Е12.5 гонадных PGCs.
The relationship between fragilis and stella
PGCs рекрутируются среди fragilis-позитивного сообщества клеток. Анализировали кДНК одиночных клеток. Было установлено, что PGCs постоянно обладют высоким уровнем экспрессии fragilis (и Tnap) по сравнению с уровнями в соседних соматических клетках. Более важно, что экспрессия stella обнаруживалась лишь в молодых PGCs с наивысшими уровнями fragilis и отсутствием экспрессии Hoxb1. В самом деле экспрессия stella никогда не обнаруживалась в клетках, в которых fragilis отсутствовал или экспрессировался на низких уровнях. Однако, были найдены две клетки, которые были негативны по stella несмотря на строгую позитивность в отношении fragilis и Tnap и негативность по Hoxb1. Эти клетки будут экспрессировать stella позднее или они действительно неспособны приобретать судьбу зародышевых клеток.
Analysis of Bmp4 positive embryonic cells
вернемся к 57 Bmp4-позитивным клеткам. Среди них было найдено 47 Tnap позитивных клеток. из которых 4 были stella позитивными. Эти 4 клетки экспрессировали также и fragilis на высоком уровне, но не Hoxb1. 18 клеток с низким уровнем экспрессии fragilis были Hoxb1 позитивными и не экспрессировали stella. Следовательно, экспрессия Bmp4 и спецификация PGCs не являются взаимоисключающими.
Repression of Hox genes in nascent PGCs
Oct4 (центральный ген, асоциированный с плюрипотентностью) обнаруживает широкий паттерн экспрессии, который нехарактерен для PGCs. И PGCs и их соматические соседи экспрессируют принципиальные мезодермальные гены, Т (brachyury) и Fgf8. Т.о., судьба зародышевых клеток, по-видимому, накладывается на клетки, которые первоначально были предназначены приобрести соматическую мезодермальную судьбу. Установлено, что спецификация зородышевых клеток связана с репресией регион-специфичных гомоеобоксных генов, Hoxa1, Hoxb1, Lim1 и Evx1, которые экспрессируются в соседних соматических клетках. Т.к. некоторые становящиеся PGCs обнаруживают низкие уровни Hoxa1 и Evx1? то это указывает на то, что репрессия гомеобоксных генов является активным процессом в ходе которого PGCs клетки избегают судьбы соматических клеток и снова приобретают плюрипотентное состояние. Напр., экспрессия Evx1 в PGCs, возникших на ст. поздней полоски (примерно на 6 ч раньше) высокая как и в соматических клетках, это подтверждает предположение об активной супрессии Нох генов во время спецификации PGCs.
Следует также отметить, что экспрессия генов домашнего хозяйства, включая β-actin и Hprt, существенно ниже в PGCs? что м. отражать или удлиннение продолжительрности их клеточного цикла или временное снижение метаболической активности.
Наконец, экспрессия у млекопитающих генов гомологов, таких как Vasa, которые экспрессируются становящимися зародышевыми клетками у низших организмов, не обнаруживаются в родоначальных PGCs у мышей, хотя они экспрессируются позднее. Помимо млекоптающих земноводные также. по-видимоу. лишены зародышевой плазмы. Зародышевые клетки аксололтя такж, по-видимому, индуцируются в мезодерме, которая экспрессирует мезодермальные маркеры, включая Фчикфю Более того, как и у мышей, экспрессия Vasa ( и др. генов) у аксолотля также происходит во время вступления зародышевых в гонады. Следовательно, различные механизмы оперируют по спецификации зародышевой линиив отсутствие преформированной зародышевой плазмы.
Induction of fragilis by extra-embryonic ectoderm in vitro
Была установлен сильная экспрессия fragilis в дистальных клетках эпибласта на ст Е6.0 (на которой обычно не возникают PGCs) после непосредственного контакта с внеэмбриональной эктодермой, но не в изолированных контрольных кусочках эпибласта и не в самой внеэмбриональной эктодреме. Эта индукция тем выше, чем ближе место контакта.
Одним из принципиальных сигналов от внеэмбриональной эктодермы является Bmp4. Экспрессия fragilis не обнаруживается у Bmp4-/- эмбрионов. Более того, экспрессия aragilis существенно снижалась у Bmp4 гетерозиготных эмбрионов, это согласуется дозово-зависимым эффектоа Bmp4 на количество основателей PGCs.
Analysis of induced distal epiblast cells
Анализ одиночных клеток эпибласта, индуцировнных in vitro 40-88 ч с помощью внеэмбриональной эктодермы показал, что 39 из 73 клеток были позитивными по fragilis ? из них 15 экспрессировали его на высоком уровне. Более того 11 из 39 fragilis позитивных клеток обнаруживали экспрессию Tnap, среди них 5 были позитивны и по Oct4. 14 из 24 fragilis позитивных клеток, позитивных также по Tnap и Oct4, экспрессировали Т (brachyury), а 18 из 24 были также Bmp4 gjpbnbsyvb (маркер задней внеэмбриональной мезодермы. Однако ни одна из клеток не обнаруживала экспрессии stella. Среди этих одиночных клеток удалось отличить клетки внеэмбриональной эктодермы, как негативные по fragilis, T (brachyury и Oct4, но позитивные по Н19 и Bmp8b.
Следовательно, дистальные клетки эпибласта, индуцируемые внеэмбриональной эктодремой in vitro приобретают компетентность зародышевых клеток и развиваются в этом направлении, экспрессируя fragilis, Tnap, Oct4 и T(brachyury). Но т.к. не удалось выявить экспрессию stells, то возможно необходим дополнительный сигнал для финальных стадий спецификации PGCs in vivo.
Organization and demarcation of the nascent PGC cluster
Экспрессия fragilis в проксимальном крае эпибласта маркирует начало приобретения компетентности зародышевых клеток, которая зависит от контакта с внеэмбриональной эктодермой. Более того, размер fragilis позитивного кластера, по-вивдимому, зависит от дозы гена Bmp4. Это указывает на то. что размер fragilis позитивного кластера является центральным детерминантом количества образующихся PGCs. Однако. абсолютное количество fragilis позитивных клеток в кластере не является критическим. N/j/? зародышевые клетки рекрутируются из сообщества клеток, которые экспрессируют fragilis и , следовательно, не из пионерских клеток. Предполагается, однако, что влияние Bmp4 l/,/ непрямым, т.к. fragilis, подобно др. членам семейства, содержит два строго законсервированных на IFN отвечающих элемента, выше своего экзона 1. Следовательно, fragilis скорее всего индуцируется IFN, после инициального priming наиболее проксимальных клеток эпибласта с помощью Bmp4, они становятся чувствительными к IFNs. IFNs выявляются во время гаструляции.
Proposed roles of fragilis and stella in PGC specification
Fragilis как типичный IFN-индуцибельный белок клеточной поверхности, по-видимоу, обладает некоторыми общими свойствами, общими всем членам семейства. Острая, но преходящая активация fragilis согласуется с кинетикой IFN-индуцибельных генов, которая м. возрастать более чем в 40 рах в течение часа и быстро снижаться после удаления IFN. Эта fragilis позитивная сборка клеток д. соответствовать примерно 100 TNAP позитивным клеткам, это выше количества stella позитивных клеток (36-43 клеток)., что очень близко к ожидаемому количеству 45 PGCs. Позитивные по fragilis клетки , по-видимоу, формируют сообщество за счет гомотипической адгезии, из которого и рекрутируются основатели PGCs, демаркируя их тем самым от большинства клеток. предназначенных стать соматическими тканями. Эти IFN-индуцибельные белки клеточной поверхности способны передавать антипролиферативные сигналы, которые являются, по-видимому, тем механизмом. с помощью которого увеличивается время клеточного цикла образующихся PGCs с 6 до 16 ч, тогда как соматические клетки продолжат быстро делиться.
Индукции fragilis в клетках эпибласта м.б. само по себе недостаточным для экспрессии stella и м. нуждаться в специфическом сигнале. Этот сигнал д.б. специфическим лигандом, который соединяется с fragilis во время спецификации судьбы зародышевых клеток. Как только возникают молодые PGCs экспрессия fragilis уменшается (Е8.0) и тем самым освобождаются PGCs от гомотипической адгезии и теперь они готовы к миграции в гентальный гребень.
Fragilis м. выполнять и др. функции, т.к экспрессируется и в др. местах эмбрионов. В плюрипотентных ES и эмбриональных зародышевых клетках он м. участвовать в поддержании плюрипотентного состояния. Роль stella м. частично регулироваться его потенциалом сновать между ядром и цитоплазмой.
Критическим событием в спецификации PGCs является репрессия регион-специфичных гомеобоксных генов, что позволяет PGCs избегать судьбы соматических клеток. Скорее всего ген stella участвует в инициации или поддержании репрессии Нох генов в PGCs. Выявление stella в ооцитах и во время преимплантационного развития указывает на то, что он м. выполнять критическую роль на всех фазах поддержания стостяния тотипотентности/плюрипотентности.
Сайт создан в системе
uCoz