Посещений:
Schwann Cell Development
Шванновские клетки: Роль Brn-2 и Oct-6,

The POU proteins Brn-2 and Oct-6 share important functions in Schwann cell development
Martine Jaegle, Mehrnaz Ghazvini, Wim Mandemakers, Marko Piirsoo, Siska Driegen, Franзoise Levavasseur, Smiriti Raghoenath, Frank Grosveld, and Dies Meijer
GENES &DEVELOPMENT 17:1380 –1391 ©2003

The genetic hierarchy that controls myelination of peripheral nerves by Schwann cells includes the POU domain Oct-6/Scip/Tst-1and the zinc-finger Krox-20/Egr2 transcription factors.These pivotal transcription factors act to control the onset of myelination during development and tissue regeneration in adults following damage.In this report we demonstrate the involvement of a third transcription factor,the POU domain factor Brn-2.We show that Schwann cells express Brn-2 in a developmental profile similar to that of Oct-6 and that Brn-2 gene activation does not depend on Oct-6.Overexpression of Brn-2 in Oct-6-deficient Schwann cells, under control of the Oct-6 Schwann cell enhancer (SCE),results in partial rescue of the developmental delay phenotype,whereas compound disruption of both Brn-2 and Oct-6 results in a much more severe phenotype. Together these data strongly indicate that Brn-2 function largely overlaps with that of Oct-6 in driving the transition from promyelinating to myelinating Schwann cells.


Высокая скорость проведения нервными волокнами является характерным признаком нервной системы у высших позвоночных и зависит от структурных и молекулярных специализаций, которые возникают во время развития. Эти специализации появляются в результате интимных и постоянных взаимодействий между нейроном и ассоциированными глиальными клетками и в результате отложения глиальными клетками миэлина, важной мембранной структуры, которая окутывает и изолирует аксоны (Arroyo and Scherer 2000;Fields and Stevens-Graham 2002;Mirsky et al.2002). Два типа глиальных клеток продуцируют миэлин: олигодендроциты в central nervous system (CNS) и Schwann клетки в peripheral nervous system (PNS). Хотя и очень сходно организованы, но молекулярный состав миэлина в CNS и PNS отличается существенно и олигодендроциты и Шванновские клетки приобретают разные, хотя и перекрывающиеся наборы регуляторов транскрипции для скоординированного миэлогенеза (Hudson 2001;Topilko and Meijer 2001). Эти различия отражают их разное эмбриональное происхождение. В то время как олигодендроциты происходят из нейроэпителиальных предшественников, которые выстилают просвет спинного мозга и желудочков головного мозга, Шванновские клетки происходят в основном из нейрального гребня, временной популяции embryonic stem (ES) клеток, которые дают большое разнообразие типов клеток, включая сенсорные и автономные нейроны и меланоциты (Le Douarin and Kalcheim 1999;Richardson 2001).
Предшественники Шванновских клеток заселяют рано вырастающие нервные пучки, где они пролиферируют и сегрегируют индивидуально и группами из волокон до тех пор, пока количество Шванновских клеток и волокон в конечном итоге не окажется достаточным. Во время первых нескольких дней постнатального развития большинство шванновских клеток устанавливает соотношение 1:1 с аксонами, прекращает пролиферировать и начинает образование миэлина, так что в конце первой постнатальной недели развития все миэлин-компетентные аксоны активно становятся миэлинизированными. Шванновские клетки, которые остаются ассоциированными с группами волокон малого калибра, разделяют эти волокна в виде цитоплазматической санжетки, не миэлинизируя их (Webster 1993). Хотя в действительности ничего неизвестно о молекулярной природе сигнала(ов) ассоциированного с аксонами, которые заставляют идти Шванновксие клетки по пути миэлинизации или не-миэлинизации, однако накапливается информация о транскрипционных факторах, участвующих в дифференцировке и миэлдинизации Шванновских клеток.
Кстати, обнаружено несколько транскрипционных факторов, участвующих в дифференцировке Шванновских клеток, включая zinc-finger белок Krox20 (Egr-2), Sry box белок Sox10 и POU доменовый белок Pou3f1/Oct-6/Scip/Tst-1 (обозначаемый здесь как Oct-6;Topilko and Meijer 2001). Эксперименты по генному таргетингу у мышей выявили функциональную роль каждого из этих факторов и их возможный порядок внутри генетической иерархии. Sox10 необходим рано в развитии для установления и/или поддержания предшественников Шванновских клеток из нейрального гребня (Britsch et al.2001). На поздних стадиях развития Oct-6 и Krox20 необходимы для дифференцировки миэлинизирующихся Шванновских клеток на соотв. двух последовательных ступенях генетической иерархии (Topilko et al.1994;Bermingham et al.1996; Jaegle et al.1996;Ghislain et al.2002). Во время плодного развития экспрессия Oct-6 индуцируется в незрелых Шванновских клетках и достигает пика в promyelinating и рано миэлинизирующихся клетках во время первой недели постнатального развития (Scherer et al.1994;Blanchard et al.1996;Arroyo et al.1998). Следовательно, Oct-6 регулирует набор нижестоящих генов, которые включают и Krox-20 (Blanchard et al. 1996;Ghislain et al.2002). Krox-20 регулирует добавочный набор генов, включая и основные миэлиновые гены и те, что участвуют в метаболизме липидов (Nagarajan et al.2001). Кроме того, Sox10 м. вносить вклад в эти транскрипционные программы, т.к. он взаимодействует и с Oct-6 и Krox20, когда связан с соседними ДНК-связывабщими сайтами (Kuhlbrodt et al.1998b).
Дифференцировка Шванновских клеток в нервах Krox20- или Oct-6-дефицитных мышей арестовывается на стадии promyelin (Topilko et al.1994;Bermingham et al.1996;Jaegle et al. 1996). Однако, эта блокада дифференцировки у Krox20 -/- мышей является постоянной и временной у Oct-6 мутантных животных (Oct-6 βgeo/βgeo). Т.обр.,Oct-6βgeo/βgeo Шванновские клетки действительно активируют Krox20 экспрессию и начинают миэлинизацию, хотя и с задержкой в 7-10 дней, тем самым подтверждается некоторая функциональная перекрываемость (redundancy) генетических программ (Ghazvini et al.2002). Ранее авт. предположили, что временная природа блока дифференцировки является результатом неизвестной Oct-6-подобной активности в Шванновских клетках, причем этот предполагаемый фактор д. действовать позднее, чем Oct-6 в клоне Шванновских клеток (Jaegle and Meijer 1998). Возможно, конечно, что временный блок м.б. результатом действия фактора, который регулирует часть или все транскрипционные мишени для Oct-6, но это было бы менее эффективно. Наиболее вероятным кандидатами на роль этой Oct-6-подобной активности являются др. члены семейства POU доменовых транскрипционных факторов, которое насчитывает 15 членов у млекопитающих (Ryan and Rosenfeld 1997). Интересно, что два POU доменовых транскрипционных фактора, Brn-1 и Brn-2, действительрно имеют идентичные ДНК-связывающие характеристики, сравнимые с Oct-6.
Проверяли экспрессию и функцию кандидатов POU доменовых транскрипционных факторов во времпя развития и у Oct-6-дефицитных мышей. В работе было показано, что Шванновские клетки экспрессируют Brn-2 с онтогенетическим профилем, сходным с таковым Oct-6. Показано, что активация гена Brn-2 не зависит от Oct-6, но, что Oct-6 негативно регулирует уровни экспрессии Brn-2 в Шванновских клетках мутантов Oct-6 обусловливая частичное восстановление фенотипа онтогенетической задержки, в то время как гомозиготная делеция Brn-2 в Шванновских клетках мутантов Oct-6 вызывает более тяжелый фенотип. Все это строго указывает на то, что функция Brn-2 в основном перекрывается с таковой Oct-6 в управлении перехода от promyelinating к миэлинизации Шванновских клеток.

Discussion


В настоящем исследовании было показано, что class III POU доменовый белок Brn-2 регулируется параллельно с Oct-6 во время дифференцировки Шванновских клеток. Было установлено, что Brn-2 и Oct-6 играют общую роль в качестве позитивных регуляторов перехода от promyelinating к миэлинизации при развитии Шванновских клеток. Учитывая ажность миэлиницзации периферических нервов, активность обоих этих транскрипционных факторов м. скорее всего гарантировать прогрессивный ход этого процесса.

Regulation of Brn-2 expression in the Schwann cell lineage


Исследования авт. на sciatic нерве кур и мышей на разных эмбриональных и после вылупления или постнатальных стадиях показали, что Oct-6 и Brn-2 регулируются одинаково во время развития нервов, это подтвердило предположение, что Brn-2 играет роль в начале миэлинизации. Оба гена активируются примерно в то время, когда большинство Шванновских клеток приобретает незрелый promyelinating фенотип (E14 у эмбрионов кур и E17 у мышей). Экспрессия обоих генов достигает пика в promyelinating Шванновских клетках и подавляется в активно миэлинизирующихся клетках. Используя культивируемые Шванновские клетки крыс в качестве удобной системы in vitro, авт. обнаружили, что экспрессия и Brn-2 и Oct-6 увеличивается при добавлении forskolin (агента, который повышает концентрацию внутриклеточного цАМФ благодаря обратимой активации adenylyl cyclase; Fig.1D). Сходным образом, во время регенерации нервов Sim and colleagues (2002) выявили параллелизм экспрессии Brn-2 и Oct-6. В данной работе Oct-6-and Brn-2-дефицитные мыши показали. что активация этих генов не является независимой и обеспечивает защиту миэлинизации у развивающихся организмов.
Внутриклеточные пути передачи сигналов, которые регулируют экспрессию Oct-6 в Шванновских клетках, конвергируют на SCE, энхансерном элементе, который идентифицирован в локусе Oct-6 и мышей и людей. Первая попытка идентияицировать такой энхансер в локусе Brn-2 на базе гомологии последовательностей неудалась. DNaseI hypersensitivity картирование локуса Brn-2 в Шванновских клетках д. указать на положение соотв. энхансерных последовательностей и облегчить идентификацию соотв. сайтов связывания в энхансерах Oct-6 и Brn-2, а также определить, м. ли активация этих генов обеспечиваться сходным сигнальным путем. Один сигнальный путь, который вызывает особый интерес, является путь NFκB, т.к. Nickols и др. (2003) получили доказательства его вовлечения в миэлинизацию периферических нервов и регуляцию Oct-6 в Шванновских клетках.
Хотя Oct-6 и Brn-2 активируются независимо, уровень экспрессии Brn-2 ослабляется с помощью Oct-6. Уровни экспрессии Brn-2 увеличиваются (2-3 раза) в Oct- 6-дкфицитных Шванновских клетках ро сравнению с диким типом Schwann (Figs. 1C,2A,B). Пока неизсестен механизм, с помощью которого регулируются уровни Brn-2 посредством Oct-6, хотя полученные полуколичественые RT–PCR данные указывают на вовлечение транскрипционных и посттранскрипционных механизмов скорее, чем трансляционных и посттрансляционных. Экспрессия Brn-2 гасится посредством Oct-6-независимого пути, т.к. экспрессия Brn-2 подавляется на поздних стадиях постнатального развития, даже в отсуствие Oct-6 (Fig.2E).



Figure 2.Elevated and protracted expression of Brn-2 in nerves of Oct-6βgeo/ΔSCE (A )EMSA with whole-cell extracts from sciatic nerves of P4 Oct-6βgeo/ΔSCE mice and a radiolabeled octamer probe reveal a strong complex that migrates at the same position as Brn-2 and Oct-6 DNA complexes. This complex is supershifted with antibodies against Brn-2, unmasking the low residual expression of Oct-6 from the allele. Preimmune serum affects none of these complexes.(B ) Western blot analysis confirms that Brn-2 protein levels are elevated in the nerves of Oct-6βgeo/ΔSCE vs. Oct-6ΔSCE/+ nerves at P4.Tubulin served as a loading control.(C )Semiquantitative RT –PCR using RNA extracted from newborn sciatic nerves shows the higher Brn-2 mRNA steady-state levels in Oct-6βgeo/ΔSCE mice than in Oct-6ΔSCE/+ mice. Cyclophilin mRNA served as a control.(D )Brn-2 is expressed in the nucleus of Schwann cells in the nerves of P4 Oct-6βgeo/ΔSCE mice. Nerves were dissected and teased into single fibers and incubated with antibodies against mouse Brn-2 (αBrn-2) in green and Neurofilament medium chain (NFM)in red.(E )Expression of Brn-2 and Oct-6 was examined in developing nerves of Oct-6ΔSCE/+ and Oct-6βgeo/ΔSCE animals at E17 and P1 –P32. Amounts of nerve extract loaded were normalized for acetylated α-tubulin.The build-up of P-zero immunoreactivity over time illustrates the progression of myelination in both genotypes.

Role of Brn-2 in Schwann cell development


Скоординированная экспрессия Brn-2 и Oct-6, подтвержджена в исследования in vivo Brn-2, как дополнительного перекрывающего активирующего фактора онтогенетической программы в Шванновских клетках. Установлено, что избыточная экспрессия Brn-2 под контролем Oct-6 SCE в Oct-6-дефицитных Шванновских клетках ведет к увеличению количества Шванновских клеток, которые вступают в фазу миэлинизации по расписанию. Специфичная для Шванновских клеток делеция Brn-2 на Oct-6-дефицитном фоне дает фенотип, который занчительно тяжелее, чем у одиночных Oct-6 мутантных животных, Шанновские клетки при этом арестовываются на стадии promyelin вплоть до 120 дня после рождения. Эти результаты строго подтверждают, что Brn-2 выполняет общую с Oct-6 роль в развитии Шванновских клеток в качестве позитивного регулятора перехода от promyelinating к миэлинизации, ка было предположено ранее (Jaegle and Meijer 1998).
Функциональное перекрывание, продемонстрированное здесь для Brn-2 и Oct-6, является распространенным феноменом среди сленов одного и того же семейства транскрипционных факторов и описано и для др. членов Gata и Sp1 семейств. Внутри POU семейства транскрипционных факторов перекрывание ролей описано для близко родственных генов Brn-1 и Brn-2 в развитии кортикальных нейронов (McEvilly et al.2002;Sugitani et al.2002). Функциональное перекрывание описано и между Oct-6 и более удаленным Skn-1a/i POU геном, оба из которых необходимы для собственно дифференцировки эпидермальных кератиноцитов (Andersen et al.1997). В нашей системе тестировалось, м. ли более дивергентный POU доменовый ген Brn-5 быть функционально комплементарным Oct-6. Выбор Brn-5 сделан, исходя из работы Wu и др. (2001), которые показали, что Brn-5 экспрессируется в миэлинизирующихся Шванновских клетках и регулируется независимо от Oct-6. Высокие уровни экспрессии Brn-5 не ослабляют фенотипа онтогенетической задержки нервов у Oct-6-дефицитных животных. Это не связано с возможной ингибирующей функцией Brn-5, т.к. SCE-Brn-5/Oct-6Δ;SCE+ нервы миэлинизируются нормально.
Анализ экспрессии Brn-2 у мутантов Oct-6 и избыточной экспрессии Brn-2 привел к заключению, что количественно боеее высокие уровни белка Brn-2 необходимы для инициации миэлинизации по расписанию. Эти данные вместе с тем фактом, что Brn-2 и Oct-6 имеют очень сходные ДНК-связывающие предпочтения, указывают на то, что различия в биологической функции между Brn-2 и Oct-6 складываются в основном из различий в сродстве с факторами взаимодействия и/или в репертуаре партнеров по взаимодействию.
POU доменовые бклки, как известно, взаимодействуют с членами семейства Sry box (Sox) транскрипционных факторов. Напр., активация энхансера Fgf4 в ES клетках зависит от синергичности взаимодействий между Sox2 и Oct4 белками (Ambrosetti et al.1997). В глиальных клетках было показано, что Sox10 взаимодействует синергично с Oct-6, но не с Brn-1 или Brn-2, чтобы активировать транскрипцию, когда оба белка соединяются с соседними сайтами связывания искусственного энхансера (Kuhlbrodt et al. 1998a). Синергичная активация нуждается в N-терминальной области Oct-6 и Sox10 (Kuhlbrodt et al.1998b). Сходным образом, олигодендроциты, обогащенные Sox11 белком действуют синергично с Brn2 и Brn-1, но не с Oct-6. Все это указывает на то, что существует специфический POU/Sox код и м.б. постулировано, что специфические POU белки необходимы специфическим Sox белкам, чтобы осуществить кооператинвные эффекты (Kuhlbrodt et al.1998a,b). Если в самом деле важные гены-мишени из Oct-6 в глиальных клетках регулируются путем взаимодействия с Sox10, а пара Brn-2/Sox11 эквивалентна Oct-6/Sox10, то онтогенетический дефект в Oct-6-дефицитных Шванновских клетках, но не в олигодендроцитах (Bermingham et al.1996) м.б. объяснен следующим образом: олигодендроциты экспрессируют Brn-2/Sox11 в дополнение к Oct-6/Sox10, тогда как Шванновские клетки экспрессируют Oct-6/Sox10 и Brn-2, но не Sox11.
Полученные данные демонстрируют, что переход promyelin-to-myelinating регулируется с помощью Oct-6/Brn-2 функции, но даже в отсуствие этих POU факторов Шванновские клетки в конечном счете вступают в фазу миэлинизации по мере дифференцировки клеток. Это не связано с накоплением Oct-6 белка, экспрессируемого гипоморфным аллелем Δ;SCE (Fig.2E). Даже когда делеция Brn-2 в клоне Шванновских клеток полная, мозаицизм экспрессии Brn-2 не м.б. объяснен задержкой миэлинизации (Fig.5). Два наблюдения особенно важны для понимания роли Oct-6 и Brn-2 в дифференцировке Шванновских клеток и того, почему даже в их отсутствие миэлинизация происходит. Во-первых, в отсутствие Oct-6, вступление в фазу миэлинизации задержано, а кинетика этого перехода изменена (Fig.6B). В то время как >80% Шванновских клеток дикого типа вступают в фазу миэлинизации на ст. P8, в отстуствие Oct-6 это происходит спустя несколько недель для того же самого количества Шванновских клеток. В отсутствие обоих, и Oct-6 и Brn-2, этот переход задерживается еще больше. Во-вторых, кинетика этого перехода является зависимой от дозы Oct-6/Brn-2. В терминах регуляции транскрипции это предполагает, что Oct-6 более существенно увеличивает шансы, что его гены-мишени будут активированы. Обнаружение, что отсутствие Oct-6 и Brn-2 эти шансы сводит к нулю, указывает на то, что эти гены-мишени активируются, хотя и с меньшей эффективностью посредством др. транскрипционных факторов, возможно включая и повсеместно распространненный POU фактор Oct-1.
Сайт создан в системе uCoz