Последнее обновление: 01/26/2025 05:58:51  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Посещений:
Signal-transduction network
В лимфоциты

Unravelling the signal-transduction network in B lymphocytes
GILBERTO R. SAMBRANO, GRISCHA CHANDY, SANGDUN CHOI, DIANNE DECAMP, ROBERT HSUEH, KENG-MEAN LIN, DENNIS MOCK, NANCY O'ROURKE, TAMARA ROACH, HONGJUN SHU, BOB SINKOVITS, MARY VERGHESE & HENRY BOURNE
Nature 420, 708 - 710 (12 December 2002); doi:10.1038/nature01305

The Alliance for Cellular Signaling выбрал мышиные В лимфоциты в качестве модельной системы для понимания основных принципов управления передачей сигналов в клетке. Сначала внимание было сфокусировано на создении воспроизводимых экспериментальных клеточных систем и характеристике существенных сигнальных реакций.
В лимфоциты вополняют важную роль по защите хозяина и поддержанию большого комплекта рецепторов клеточной поверхности, которые регулируют его многие иммунологические функции. В лимфоциты путешествуют по всему кровообращению и постоянно мигрируют в и из селезенки и лимфотических узлов, всегда готовые действовать, когда встречают антигены, цитокины, бактериальные эндотоксины, молекулы с поверхности Т клеток и др. стимулы. 1-3. Миграция управляется с помощью коперативного набора хемокинов. а выживаемость обеспечивается с помощью др. средовых стимулов4-6. Они м. пролиферировать и дифференцироваться в плазматические клетки, секретирующие антитела, когда стимулируются антигенами, и подвергаются запрограммированной клеточной гибели в отсутствие стимулов7.
The Alliance for Cellular Signaling (AfCS) избрал для изучения покоящиеся В лимфоциты т.к. они обладают интересными биологическими свойствами, регулируемыми с помощью взаимодействующих сигнальных систем. Авт. решили собрать данные по комплексным путям передачи сигналов в надежно контролируемых и определнных клеточных системах, чтобы адресовать вопросы об основных принципах, лежащих в основе сигнальных механизмов.

Characterizing the cells
Прежде всего было необходимо создать стардатизованную процедуру выделения и очистки В лимфоцитов селезенки. Отталкиваяь от уже существующих методов8, исследователи AfCS лабораторий изобрели и отладили воспроизводимую процедуру выделения клеток селезенки и изучения их реакций на лиганды in vitro. Детали изложены в первом сообщении AfCS (см. reports/v1/BC0001/BC0001), в результате процедуры выделения получали популяцию клеток на >95% из B лимфоцитов, из которых >80% были покоящимися, зрелыми B2 клетками. Клетки, изолированные таким образом сохраняли свою жизнеспособность в течение кратковременного культивирования и демонстрировали воспроизводимые функциональные реакции in vitro на набор 'sentinel ligands', которые включали anti-immunoglobulin M (anti-IgM) антитела, terbutaline, anti-CD40 антитела, stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α) и interleukin (IL)-4.

Короткий период жизни селезеночных В лимфоцитов в культуре ограничивает использование многих инситрументов, существенных для изучения сигнальных сетей, включая экспрессию чужеродной ДНК и ретровирусные стратегии для экспрессии РНК-interference конструкций. По этой причине была использована WEHI-231 линия клеток в качестве экспериментального суррогата. as an experimental surrogate. WEHI-231 клетки реагируют на многие лиганды, которые действуют на первичные В лимфоциты и довольно поддатливы для временной и стабильной трансфекции рекоминатных структур9-12. Т.обр., были продемонстрированы сильные сигнальные реакции в WEHI-231 клетках, которые были сходны с теми, что наблюдались в селезеночных В лимфоцитах. WEHI-231 клетки также мигрируют в ответ на хемокины и подвергаются апоптозу в ответ на стимуляцию B-cell receptor (BCR).
Ожидалось, что WEHI-231 клетки будут служить как пригодные приложения к исследованию сигнальных путей в В лимофцитах и как первичная экспреиментальная система для проекта 'Focus on PIP3 modules' (FPM), который разработан для ускоренного анализа сигнальных путей с помощью изучения относительно небольших подразделов сети, которые контролируют конценрацию мембранного липида, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3 or PIP3). Однако, эти клетки наложили определенные ограничения на нашу способность изучать желанные сигнальные пути. Напр., функциональная реакция на стимуляцию BCR в WEHI-231 (апоптоз) отличается от таковой в селезеночных В лимфоцитах (пролиферация)13,14. Хотя базовая организация большей части WEHI-231 сигнальной сети, по-видимому, очень напоминала таковую селезеночных В лимфоцитов, анализ специфических путей м. заставить нас обратиться к др. клеткам. Соответственно, мы эксплуатировали и др. возможности, включая использование селезеночных В лимфоцитов, чья жизнь в культуре была увеличена за счет стимуляции агентами, которые способсвуют выживанию, такими как BAFF или CD40 лигандом5,6. Альтернативно, мы смогли изолировать клетки мышей, которые специфически экспрессируют человеческий Bcl-2 трансген в их популяции В лимфоцитов для обеспечения выживаемости15. Если такие клетки окажутся пригодными для трансфекции, то они позволят изучить часть сети В лимфоцитов в дополнение к той, что сохраняется в покоящемся состоянии.

Estimating the complexity of the system

Имея разработанную и относительно хорошо отлаженную систему для изучения мы теперь начали изучение сложности сигнальной сети В лимфоцитов, включая идентификацию компонентов, участвующих в сети, идентифицируя взаимодействия, которые м. появиться среди нее и характеризуя широту сигнальных ответов.

Gene-expression profiles Чтобы пролить первоначальный свет на спектр сигнальных компонентов, которые экспрессируются в нашей популяыции покоящихся В лимфоцитов, мы начали сотрудничество с Genomics Institute of the Novartis Research Foundation16. Профиль экспрессии генов был установлен, используя мышиные Affymetrix GeneChip массивы, которые вычислили паттерны экспрессии примерно 12,000 транскриптов. Профиль целиком м. посмотреть online на http://www.signaling-gateway.org/reports/v1/BC0001/SupplGNFArray.xls. Эти добавочные данные транскрипционных профилей большой шкалы были скомпилированы в AfCS лабораториях. Более детельный анализ этой коллекции позволил нам сконцентрировать внимание на сигнальных белках, которые скорее всего участвуют в сигнальной сети В лимфоцитов.

Protein–protein interactions В сотрудничестве с Myriad Genetics, мы начали комбилировать информацию по межбелковым взаимодействиям с помощью высоко-производительной дрожжевой дву-гибридной скрининговой системы. compile information on protein–protein interactions from a high-throughput yeast two-hybrid screening system. Т.о., было отобрано около 160 сигналных белков и свыше 600 bait–DNA-binding-domain гибридов было подготовлено для скрининга. На сегодня ~317 взаимодействий из 33 baits идентифицировано и их список представлен на нашем web сайте. Эта небольшая выборка уже содержит некоторые хорошо известные взаимодействия, включая взаимодействие phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI(3)K) p110α каталитиской субъединицы с p85α регуляторной субъединицей17 и serine/threonine kinase Pak с малым G белком Rac18. Идентифицированы и некоторые новые взаимодействия, включая взаимодействие phospholipase Cγ c lipid phosphatase SHIP1 и tyrosine kinase Btk с протеин фосфатазой calcineurin. Этот действующий проект обещает представить нам информацию о новых белковых взаимодействиях.

Identifying signalling pathways Предполагалось идентифицировать некоторые из множественных сигнальных путей, стимулируемых в селезеночных В лимфоцитах в ответ на каждый из 32 растворимых стимулирующих лигандов. Лиганды, идентифицированные благодаря изучению литаратуры, включали хемокины, BCR стимулы, липиды, биогенные амины и множественные интерлекины и цитокины, которые известны или подозреваются в их влиянии на В лимфоциты. Целью этого инициального скрининга было определить, какие лиганды дают функционально уникальную реакцию на панели сигнальных assays. Измеренные экспериментальные реакции включали: изменения внутриклеточных концентраций кальция и цАМФ, immunoblots of antiphospho антител против 10 отдельных сигнальных белков и экспрессию примерно 10,000 мышиных генов, используя Agilent комплементарный ДНК микромассив. Эти подходы были выбраны для получения выборки в широких пределах сигнальных путей, имеющихся в этих клетках; к этому мы добавили анализ индуцированных лигандом изменений в концентрациях glycerophospholipids и нами была расширена панель antiphospho антител.

Т.о., 18 из 32 лигандов обнаруживали позитивные регистрируемые реакции в одном или нескольких подходах, которые находились в согласии с опубликованными исследованиями, описывающими сигнальное поведение этих лигандов. Как и ожидалось лиганды, известные ка действующие в первую очередь на Gs-coupled рецепторы, индуцировали увеличение цАМФ (с некоторыми отличиями в кинетике), но не обнаруживали эффектов на концентрации кальция. Хемокины, которые стимулировали Gi, все продуцировали кинетически сходное увеличение внутриклеточного кальция, которое сопровождалось пропорциональным увеличением фосфорилирования Erk1/Erk2 и др. мишеней. Временное увеличение цАМФ, ранее описанное для некоторых хемотактических факторов19, наблюдалось также с большинством хемокинов, которые влияют на в лимфоциты. Изменения в экспрессии генов, в некоторых случаях существенные, выявлены практиыески для всех лигандов, но необходимы дополнительные эксперименты и анализ, чтобы отличить незначительные изменения от фоновых шумов.
Anti-IgM, CD40 лиганд и IL-4 вызывают множество изменений в экспрессии генов, которые находятся в согласии с их варьирующими биологическими эффектами на покоящиеся В лимфоциты, включая пролиферацию, выживаемость, дифференциацию и высвобождение цитокинов. Хемокины продуцируют относительно небольшие изменения, которые также согласуются с их более сфокусированной ролью в направлении клеточной миграции. Среди 14 лигандов, которые не вызывали обнаружимых ответов в нашей панели были такие как BAFF, который обнаруживает четкие пролиферативный и способствующий выживанию эффекты на культивируемые В лимфоциты. BAFF действует на группу рецепторов, родственных рецепторам tumour-necrosis factor (TNF), которые стимулируют TRAF семейство сигнальных компонент20. Передача сигналов с помощью рецепторов этого класса обычно вызывает активацию ядерного фактора-κB и/или Jnk3,20. Т.о., наша панель методов неспособна выявить сигнальные пути, запускаемые BAFF (и вообще др. родственными лигандами, такими как TNF-α). Важность этих лигандов в биологии В лимфоцитов демонстрируется дополнительными методами скрининга и antiphospho антителами, которые м. сдалать возможной детекцию таких сигнальных реакций.
Несмотря на небольшое количество проверенных подходов и phosphoproteins, набор имеющихъся данных дает обширную информацию, а более углубленный анализ позволит увеличить шансы этих значений. Мы сейчас начинаем следующую экспериментальную ступень по выяснению сигнальной сложности, путем измерения реакций на комбинации лигандов. Целью будет определение реакций на пары лигандов, которые не являются геометрически аддитивными суммами ответов на отдельные лиганды. Мы надеемся открыть новые синергичне или ингибирующие взаимодействия между лигандами в дополнение к уже документированным. Уровень сложности будет скорее всего более значительным и необходимо время, чтобы накопить данные, необходимые для начала моделирования всей клеточной сигнальной системы. В течение следующих 2-х лет внимание будет сконцентрировано на более ограниченной и хорошо-изученной части сигнальной сети, на более практических подходах к задаче анализа сети.>

A small-scale, detailed analysis of PIP3 signalling networks

Мы решили сконцентрироваться на PIP3, чтобы рекапитулировать на самой маленькой шкале экспериментальные цели AfCS (см. вводную статью 703–706), частично из-за того, что PIP3 открывает возможности мониторинга сигнальных процессов нетолько во времени, но и в пространстве (на уровне индивидуальных клеток и субклеточных компартментов)22. Этот подход является более информативным, чем измерения, сделанные на популяции клеток, которые дают лишь усредненные данные по многим индивидуальным событиям.
Чтобы свести сеть к экспериментально выполнимому размперу, мы выбрали оценку только кратковременных реакций (<20 min) на два стимула (хемокин, SDF-1α bkb BLC, и BCR стимулы) чтобы анализировать только сигнальную сеть выше накопления PIP3 (за исключением фосфорилирование PIP3-регулирующих нижестоящих белков, таких как Akt/protein kinase B, которые будут служить в качестве количественного показателя накопления PIP3). Хотя эти строгие ограничения и будут защищать FPM от учета потенциально критеческих петель обратной связи ниже PIP3, они будут определять мишень в сети из 100–200 белков (Рис. 1). Это достаточно малая сеть, чтобы быть лего управляемой и достаточно большая, чтобы прояснить, что FPM не конкурирует с индивидуальными лабораториями. Предлагаемый проект FPM будет осуществляться на WEHI-231 клетках.

Figure 1 Graphical representation of the PIP3 signalling module in B lymphocytes.   Full legend
 
High resolution image and legend (45k)

Идентификация фокальных точек внутри обширной клеточной сети В лимфоцитов создаст базу для получения приоритета и направления разработки специальных 'Molecule Pages', получаемых реагентов и расширяемых уже извесных способов экспериментов (напр., дрожжевой дву-гибридный скриннг). Альянс будет развиваться в направлении своих самых больших целей, сбирая данные, необходимые для осуществления FPM проекта. Наши литературные проработки, напр., будут сфокусированы на выявлении ключевых игроков в сигнальных каскадах хемокинов и BCR. В гастоящее время список включает белки, которые синтезируют или деградируют фосфолипиды, а также такие как рецепторы, адапторы, поддерживающие (scaffolds), G-протеинровые компоненты, фосфопротеины и др. сигнальные молекулы.
На экспериментальном форонте проект FPM нацелен на разработку методических подходов, которые позволят непосредственно измерять активность PIP3. Кроме того, т.к. модели поведения сети критически зависят от измерения потока информации через узлы сети во времени и пространстве, то одной из главных задач проекта FPM будет развитие методов измерения активностей промежуточных белков внутри PIP3 сигнальной сети.
Эти стратегии будут включать след. 4 анализа. Во-первых, фосфорилирование ключевых белков сети будет определяться с помощью иммуноблотинга с фосфо-специфическими антителами. В сотрудничестве с Cell Signaling Technology, исследователи AfCS начнут тестирование десятков таких антител, направленных (напр.) против энзимов, которые синтезируют или деградируют PIP3 (включая p85 регуляторный компонент PI(3)Ks, PTEN и SHIP1). Во-вторых, межбелковые ассоциации будут анализироваться в ответ на стимуляцию лигандами. Исследователи AfCS сконструируют кодируемые ретровирусами ловушки (baits) для белков сети PIP3. Ассоциированные белки будут определяться с помощью анализа двумерного геля и и масс-спектроскопии и с помощью иммуноблотинга. Этот класс промежутончх реакций поможет также расширить части списка и модифиуировать действительную карту эпистазов (epistasis map). В-третьих, используя метки green-fluorescent белка, будет определяться субклеточное распределение всех FPM белков. Отчетливая лиганд-зависимая транслокация белков между компартментами будет служить как пригодная конечная точка промежуточных образований (intermediate endpoint). Наконец, fluorescence resonance energy transfer (FRET) зонды, которые смогут измерять ассоциации белков во времени и пространстве, станут мишенью FPM белков, чьи активности особенно важны для информационных потоков в сети.

Whither from here?
Like most good experiments, our exploration of the B-lymphocyte signalling network requires considerable preparation and will take longer than we had hoped. It is too early to predict the experiment's outcome, but the first steps augur well. The project has: devised a convenient experimental cell system that produces reproducible results; begun to assess complexity of outputs to multiple ligands, alone and in combination; begun to develop a comprehensive 'parts list' for signalling in B lymphocytes; and laid groundwork for constructing epistasis maps and assessing intermediate endpoints. Finally, we have embarked on a focused but nonetheless ambitious effort to delineate and dissect a small portion of the signalling network of B lymphocytes. Scientists will enjoy continuing access to every aspect of the experiment on the web and will, we hope, profit from its results.

→ | K титульной странице | K оригиналам в pdf- и html-формате
Посещений:

Сайт создан в системе uCoz