Roughing up Smoothened: chemical modulators of Hedgehog signaling Randall W King (randy_king@hms.harvard.edu)
Journal of Biology, Volume 1, Issue 2, P. 8 (2002)
Journal of Biology, Volume 1, Issue 2, P. 8 (2002)
Small-molecule antagonists of Hedgehog-pathway signaling, such as cyclopamine, have been known for some time. Now, small-molecule agonists of the Hedgehog pathway have also been identified. The finding that both antagonists and agonists target the protein Smoothened supports the emerging hypothesis that Smoothened may be regulated by endogenous small molecules.
(Рис.1.) | The structures of small molecules that activate or inhibit Hedgehog (Hh) signaling
(Рис.1.) | The structures of small molecules that activate or inhibit Hedgehog (Hh) signaling
Еще до открытия у Drosophila hedgehog мутантов, естественно возникший 'chemical genetic' эксперимент привел к появлению овец с более или менее выраженным фенотипом: cyclopia. Отсутствие структур средниной части лица было связано с поедением лилий Veratrum californicum, а последующие работы выявили jervine семейство стероидных алкалоидов, включающих соединение cyclopamine, в качестве тератогенов, отвечающих за эти эффекты. Лишь в середеине 1990s были выявлены мутации гена Sonic hedgehog (Shh) у мышей или людей, вызывающие дефекты, которые напоминали те, что вызывались cyclopamine у животных. Shh секретируемый белковый лиганд, активирующий сигнальный путь Hh и играющий важную роль в формировании паттерна многих тканей. Предполагается, что тератогены м. индуцировать циклопию, противодействуя Hh пути.
В лаб. Beachy идентифицирована мишень для cyclopamine, белок Smoothened (Smo), удаленно сходный G-protein coupled receptors (GPCRs). В нестимулированных клетках активность Smo каким-то образом репрессируется белком Patched (Ptc), который является, по-видимому, рецептором для Shh-лиганда. Когда Ptc соединяется с Shh, то Smo активируется и стимулирует транскрипционные факторы семейств Cubitus interruptus (Ci) или Gli, чтобы индуцировать экспрессию специфических генов. Хотя Smo и обладет определенной гомологией с GPCRs, но не выявлен еще G белок для пути передачи сигналов Hh.
Подобно др. GPCRs Smo, по-видимому, м. активироваться малыми молекулами. Jeff Porter и др. сообщают об идентификации синтетических малых молекул (Рис. 1a), которые способны активировать Hh-сигнальный путь посредством связывания белка Smo protein. Я обозначил этот класс химических агонистов как 'leiosamines' (по греч. leios, означает smooth), чтобы отразить их способность находить белок Smo. Помимо важного терапевтичесого значения (Stecca and Ruiz i Altaba) открытие leiosamine подтверждает также новую идею, что эндогенные малые молекулы м. регулировать активность Smo in vivo.
Успех в идентификации Smo в качестве мишени для cyclopamine и leiosamine подтверждает, что задача по идентификации таких малых молекул м.б. выаолнена и что стратегия pathway-based м. принести ощутимые дивиденты.
Сначала на клеточных линиях, в которых передача сигналов постоянно активирована из-за мутации потери функции в Ptc, было показано, что место действия cyclopamine находится ниже Ptc. Cyclopamine блокировал также передачу сигналов постоянно активированной онкогеном мутантной формы Smo, хотя и были необходимы более высокие концентрации, это указывало на то, что Smo м.б. его мишенью. Синтезирована радимеченная версия cyclopamine с photo-activatable crosslinker. Трансфекция этой версией Smo позволила выявить специфическое поперечное связывание с Smo. Клетки, трансфицированные Smo, также специфически связывали флюоресцентное производное cyclopamine, a с помощью экспрессии укороченных мутантов Smo было показано, что для связывания cyclopamine необходимы только семь трансмембранных доменов Smo. Итак, cyclopamine ингибирует передачу сигналов Hh за счет связывания Smo.
Группа Curis занималась идентификацией малых молекул, которые д.б. активировать Hh путь в отсутствие лиганда Shh. Получена мышиная линия клеток, активирующая экспрессию luciferase в ответ на добавление Shh белка. Скрининг 140,000 соединений на способность активировать экспрессию luciferase в отсутствие Shh привел к идентификации семейства leiosamine соединений. С помощью методов мед. химии мощность этого класса соединений была увеличена в тысячу раз после алкилирвания basic азота. Авт. продемонстрировали, что leiosamine способны стимулировать экспрессию Hh-специфических генов в клетках и активировать соотв. Hh-зависимые биологические реакции, такие как пролиферация гранулярных нейронов мозжечка новорожденных. С помощью эксплантов нейральной пластинки эмбрионов кур было показано, что leiosamine индуцируют дозово-зависимые измененеия в клеточной судьбе, как это ожидалось для агонистов Hh-пути.
Один из leiosamine оказался способным активировать экспрессию Ptc (мишени активации Hh-пути) у эмбрионов мыши после орального введения беременым самкам. Выявлены преимущества активности этого leiosamine in vivo в узком пределе возможных мишеней. Эмбрионы мыши с гомозиготными мутациями Shh обычно неспособны экспрессировать гены-мишени Hh-пути, такие как Ptc. При обработке беременных матерей, несущих Shh-/- эмбрионов, leiosamine восстанавливал экспрессию Ptc в отсутствие Shh лиганда. Передача сигналов не восстанавливалась у Smo-/- эмбрионов, следовательно, Smo является существенным для передачи сигналов, которые активруются leiosamine.
Подтверждено, что Smo м.б. мишенью для leiosamine. Forskolin, нижестоящий ингибитор пути Hh, оказаолось ингибирует leiosamine-стимулированную передачу сигналов, также как и передачу сигналов, активированную добавлением Shh белка. Но cyclopamine ингибирует leiosamine-стимулированную передачу сигналов в меньшей степени, чем управляемую Shh передачу сигналов, указывая тем самым, что cyclopamine и leiosamine м.б. мишенью для одного и того же рецептора. Это было подтверждено в специальных экспериментах. Др. новый антогонист пути Hh, Cur61414 (Рис. 1b), также конкурирует с leiosamine за связывание, указывая на то, что он также своей мишенью имеет Smo. Изучение равновесия связывания Smo показало, что лучше всего производное leiosamine связывает Smo дикого типа с константой диссоциации (Kd) 0.37 nM. Были получены опреденные указания на то, что leiosamine и cyclopamine связываются с разными сайтами Smo, но что негативная кооперация между этими сайтами веджет в результате к антогонистическому связыванию.
В лаб.Beachy недавно охарактеризован leiosamine и подтверждено, что Smo белок также является его мишенью. Эксперименты по конкуренции с флюоресцентно меченным cyclopamine подтвердили, что трансмембранный heptahelical пучек Smo достаточен для связывания leiosamine. Интересно, что более высокие конц. leiosamine являются ингибирующими передачу сигналов Hh, это указывает на то, что данные соединения м. также взаимодействовать с нижестоящими эффекторами. Личность этого эффектора не установлена.
Чувствительность Smo к активации или ингибированию с помощью синтетических малых молекул указывает на интригующую возможность, что эндогенные малые молекулы также м. регулировать активность Smo. Ранние модели предполагали, что Ptc м. регулировать Smo за счет образования стоихометрического комплекса. Но современные данные указывают на то, что Ptc м. ингибировать Smo на sub-stoichiometric уровене. Ptc обладает гомологией с семейством бактериальных трансмембранных белков, которые м. транспортировать малые молекулы и инактивировать мутации в Ptc. Следовательно, м. предположить, что Ptc м. транспортировать малые молекулы, которые соединяются с Smo и регулируют его активность. Уже известно, что Smo м. или активироваться или ингибироваться синтетическими малыми молекулами, открытие соотв. эндогенных аналогов не за горами.