V(D)J Recombination and the Evolution of the Adaptive Immune System
Eleonora Market and F. Nina Papavasiliou (papavasiliou@rockefeller.edu) PLoS Biology Volume 1 | Issue 1 | October 2003
References
.
Villa A, Santagata S, Bozzi F, Giliani S, Frattini A, et al. (1998) Partial V(D)J recombination activity leads to Omenn syndrome. Cell 93: 885–896. Find this article
online
Иммунная система необходима для идентификации и разрушения чужеродных нарушителей. Для этого она использует два основных типа иммунных клеток, T клетки и B клетки (или вместе, лимфоциты). Лимфоциты обладают большим разнообразием рецепторов на клеточной поверхности, которые м. распознавать и реагировать на неограниченное количество патогенов, признак, который является характерным свойством “adaptive” иммунной системы. Чтобы реагировать на такое разнообразие захватчиков, иммунной системе необходимо генерировать огромные количества рецепторов. Если количества разных типов рецепторов, присутствующих на лимфоцитах, кодировались бы индивидуальными генами, то весь геном человека был бы израсходован на рецепторы лимфоцитов. Чтобы обеспечить необходимый уровень разнообразия В- и Т-клеточных рецепторов (BCR и TCR, соотв.) гены создаются за счёт рекомбинации уже предсуществующих сегементов генов. Т.о., разные комбинации финальных наборов генных сегментов, и дают рецепторы, которые м. распознавать неограниченные количества чужеродных наруштелей. Это сопровождается набором чрезвычайно хорошо скоординированных реакций, начинающихся с расщепления ДНК внутри специфических, хорошо законсервированных recombination signal sequences (RSSs). Эта высоко регулируемая ступень осуществляется с помощью специфичных для лимфоцитов recombinationactivating genes (RAG1 и RAG2). Сегменты затем собираются вновь за счёт использования общих клеточных репарационных механизмов.
Рис.1. | V(D)J Recombination Takes Place within the BCR and TCR Loci. (A) Schematic of a receptor locus.V, D, and J segments are found just upstream of the constant region. (B) A cartoon view of a VJ recombination reaction. V segments (red) are flanked by RSSs with 12 bp-long spacers (green), while the J segments are flanked by RSS with 23 bp-long spacers (orange). Breaks are introduced directly between the heptamer and the coding sequence, and a CJ is formed between a V and a J segment, while the RSS ends are put together to form an SJ within a circular DNA that is later lost. Symbols: P, promoter; E, enhancer.
Против чужеродных нарушителей и их белков (антигенов), которые не являются частью хозяина, чтобы вызывать иммунный ответ иммунная система д.б. способна распознавать бесчётное количество антигенов. По понятным причинам неограниченное количество уникальных рецепторов к антигенам не м.б. закодировано генетически. Скорее необходимое разнообразие рецепторов достигается созданием вариантов в областях распознавания антигенов рецепторами как В, так и Т клеток. Эти области создаются в результате спаривания двух разных белковых сегментов, называемых полипептидными цепями (heavy [H] и light [L] цепей в случае BCR and α and β цепей в случае TCR), которые образуют щель (cleft), которая и является местом связывания антигена. Механизм, который генерирует варианты антиген-связывающих карманов этих рецепторов, связан со смешиванием и сопоставлением variable (V), diversity (D) и joining (J) генных сегментов в процессе т.наз. V(D)J рекомбинации. Чтобы собрать одиночный функциональный рецептор предсуществующие V, D, и J генные сегменты перестраиваются, чтобы дать непрерываную V(D)J область с непосредственно выше стоящим др. элементом рецептора constant (C) областью ().
BCR H цепь и TCR α цепь состоят V, D и J сегментов, тогда как BCR L цепи и TCR β цепь представлены только V и J сегментами. Количество каждого типа сегментов внутри цепей делает возможным большую, но конечную возможность комбинационной перестройки, феномен названный комбинационным разнообразием (combinatorial diversity) (). Однако, варианты, генерируемые с помощью V(D)J рекомбинации, неисчислимы, т.к. они полагаются не просто на количество генных сегментов. Дальнейшее разнообразие вносится благодаря тому, что соединения между перестроенными генными сегментами содержат небольшие инсерции и делеции (junctional разнообразие). Наконец, и BCR и TCR являются гетеродимерами (состоящими из двух несопоставимых полипептидов) так что вероятность различных спариваний между цепями также м. увеличивать разнообразие. Успешная V(D)J перестройка чётко используется в смысле распознавания антигена и она является абсолютно необходимой для развития и выживанияt В и Т клеток.
Diversification of BCRs and TCRs
V(D)J Recombination: A Cut-and-Paste Reaction
На первой ступени реакция “cut-and-paste” разрывает обе нити ДНК спирали (двунитчатые разрывы) внутри RSS сайтов; на вотором этапе, вновь возникшие разрывы репарируются с помощью обычных путей репарации ДНК. В инициальной фазе два лимфоцит-специфических белка, которые кодируются recombinationactivating генами (RAG1 и RAG2), работают вместе, чтобы распознать и соединиться с RSSs. Комплекс, состоящих из этих двух белков, RAG1–RAG2 (в дальнейшем RAG), разрезает ДНК между перестраиваемыми ДНК сегментами и соседними RSS мотивами (). Вторая ступень реакции склеивание вместе концов хромосомы, содержащей перестраиваемые сегменты, которые ультимативно д.б. закодированы для рецептора и называются кодирующими соединениями (coding joints (CJs)). Часть ДНК между перестраиваемыми сегментами теряется из генома, но она тут же склеивается вместе в minicircle (a signal joint [SJ]). Обычно SJs быстро и точно сливаются, тогда как CJs связываются более медленно, частично из-за того, что их слияния довольно часто не являются precise—small инсерциями и м.б. обнаружены даже делеции. (См. ; ). Обе склеивающие реакции необходимы для создания рецепторов, а также для предупреждения разрушений внутри генома.
RAGs: Indispensable for V(D)J Recombination
RAG обеспечивают первую ферментативную ступень реакции сайт-специфического расщепления ДНК (). Исскуственная экспрессия RAGs в клетках млекопитающих, иных нежели
B- или T-лимфоциты показывает, что RAG является единственным лимфоцит-специфическим фактором, необходимым для этго события рекомбинации (). В самом деле, у мышей, у которых RAG гены были делетированы (RAGα/β), V(D)J рекомбинация полностью отсутствовала и такие мыши не имели зрелых ни В, ни Т клеток (; ). Сходный тип иммунодефицита, названный Omenn синдромом, наблюдается у людей с мутациями в их RAG генах ().
В test-tube экспериментах, очищенных RAG белков было достаточно для расщепления синтетических ДНК, содержащих соотв. RSS (). Эта реакция м.б. подразделена на две стадии. Во-первых, делается разрез (nick) ДНК, в специфическом месте внутри RSS, это ведет к специфическим химическим модификациям на концах (). Затем, один свободный конец со специфической (3?-hydroxyl) группой формирует новую (диэфирную) связь с отличающейся химической (phosphoryl) группой на комплементарном нуклеотиде противоположной нити (это т.наз реакция transesterification). Это ведет к формированию шпильки (hairpin) на кодирующем конце, тогда как leaving the signal конец тупой ().
RSSs: The Targets of the Reaction
RSSs находтся по=соседсту с каждым variable (V), diversity (D), и joining (J) сегментом. Они состоят из трех отдельных элементов: гептамерныъ и нонамерных последовательностей, разделенных спейсерным элементом или в 12 или 23 п.н. () (; ). Хотя два RAG белка работают вместе в белковом комплексе, они имеют уникальные функции. RAG1 соединяется как с 12- так и с 23-RSSs с равным сродством, тогда как RAG2 не соединяется ни содной из последовательностей RSS. Это указывает на то, что RAG1 формирует инициальный комплекс с ДНК, который затем рекрутируется и стабилизируется с помощью RAG2 ().
Рис.1. | RSSs Consist of a Fairly Conserved Heptamer and Nonamer Sequence, Separated by a Spacer Element
Heptamer is shown in red and nonamer in green. Conserved nucleotides are shown in bold. The spacer is either 12 or 23 bp long.
И гептамер и нонамер содержат нуклеотиды, которые абсолютно необходимы для эффективной V(D)J рекомбинации. Первые три нуклеотида в гептамере законсервированы, тогда как мутации в следующих четырех позициях влияют, но не устраняют реакции. Внутри нонамера позиции 5 и 6 законсервированы, тогда как изменения в остальных позициях переносимы (). Длина спейсера (но не его последовательность), как полагают, играет важную роль в регуляции того, какие элементы будут рекомбинированы (): 12mer отличаетя от 23mer одиночным витком спирали ДНК, это важно для белков, которые соединяются с RSSs, чтобы остаться в той же самой ротационной фазе (). Работа данного номера PLoS Biology решает эту парадигму. Они сообщили, что не только длина спейсера, но также его последовательность важна, так что изменения последовательностей спейсара непосредственно влияют на скорость рекомбинации. Исходя из этих данных, они разработали алгоритм, который точно предсказывает относиетельную эффективность RSS связывания, расщепления и перестройки, исходя из нуклеотидных последовательностей.
Breaks: Necessary Precursors of Recombination
После того как RAG разрежут ДНК по RSS, две стороны разрыва оказываются разными. Кодирующие концы закрыты и походят на шпильки, тогда как RSS концы открыты и тупы. Эти тупые RSS концы быстро воссоединяются, образуя SJs, но прежде чем кодирующие концы м.б. слиты, шпильки д.б. открыты ().
Обычно шпильки открываются или с конца или сбоку. В любом случае энзим, называемый terminal deoxynucleotidyl transferase, м. добавить небольшое количества случайных (nontemplated) нуклеотидов к свободным концам и этот феномен N-нуклеотидного добавления вносит вклад в junctional разнообразие CJs ().
Когда шпилька открывается сбоку, то реакция приводик к образованию короткого довеска (overhang) на одной из нитей. Если довески заполнены палиндромными последовательностями, то эти модификации обозначаются как “P-nucleotides” (). Они также вносят свой вклад в разнообразие CJs и обязательно, если перестроенный ген продуцирует белок, в большую вариабельность антиген-связывающего кармана рецептора.
Resolution: The Final Step
Как уже упоминалось, RAGα/β мыши не имеют зрелых В и Т клеток. Это приводит к тяжелому severe combined immunodeficiency syndrome (SCID), характеризующемуся полным блоком развития В- и Т-клеток, но не к др. дефектам (; ). Однако, однако имеются др. молекулярные нехватки, которые также дают SCID фенотип. Одна из них картирована в энзиме DNA protein kinase (DNA-PKcs), которая необходима собственно для соединения концов ДНК (). Мыши, дефицитные по DNA-PKcs, м. инициировать V(D)J рекомбинацию, но не м. формировать CJs (). Такие мыши чувствительны также к процессам, которые индуцируют разрывы двунитчатой ДНК, таким как ионизирующая радиация (). Следовательно, путь репарации, ответственный за фиксацию разрывов ДНК, вызываемых радиацией, также создаёт CJs. В самом деле, вместе с DNA-PKcs, и др. белки этого пути nonhomologous end-joining репарации важны для завершения V(D)J рекомбинации (такие как Ku70 и Ku80, Artemis, XRCC4 и DNA ligase IV) ().
An Evolutionary Model of V(D)J Recombination
После открытия RAG генов исследователи стали подозревать, что V(D)J рекомбинация м.б. результатом присоединения мобильного генетического элемента (a “jumping gene” или транспозона) к геному позвоночных. Указаний более чем достаточно. Во-первых, компактная организация RAG локуса напоминает мобильный элемент (). Во-вторых, RAGs разрезает ДНК после присоединения к RSSs всех BCR и TCR локусов (). RSSs напоминают концы др. мобильных элементов. Биохимически, реакция обладает общими характеристиками с энзимами, найденными в др. мобильных элементах (). Наконец, эти гены появляются внезапно в эволюции: они присутствуют у челюстных (jawed) позвоночных (подобных акулам), но не у более древних организмов ().
Согласно современной модели древний транспозон, содержащий RAG гены, бланкированный RSS концами “запрыгнул” в область клона позвоночных, содержащую примордиальные гены рецепторов антигенов, разделяя их на куски. Если транспозон устраняеется, то с ним уходят и RSSs. Множественные раунды транспозиций и дупликаций в конечном итоге и привели к соверменным TCR и BCR локусам.
Механистически трнаспозиция м. происходить и сегодня, если сегмент ДНК, содержащий SJs, не будет соединен в minicircle. Такие незапечатанные SJs способны вставляться в гетерологические последовательности in vitro и если им позволить свободно перетекать медду клетками, то они смогут проникунуть в геном. Такой феномен м. давать определенного типа хромосомные транслокации, превалирующие при некоторых типах B- и T-клеточных раков (). В целом, репаративные процессы в клетках активно супрессируют этот феномен за счёт быстрого соединения концов SJs.
Conclusion
V(D)J recombination is absolutely crucial for the adaptive immune response. In its absence, our immune system is compromised. When it is not properly controlled, it gives rise to chromosomal translocations and B-and T-cell cancers. The elucidation of all steps of the reaction and attempts to understand exactly how these steps are regulated to avoid disastrous side effects are areas of study that have occupied researchers in the past and will continue to do so in the future.
)
)