The large GTPase dynamin regulates actin comet formation and
movement in living cells
James D. Orth, E. W. Krueger, H.Cao, and Mark A.
McNive
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 1, 167-172, January 8, 2002
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 1, 167-172, January 8, 2002
| Dyn2-GFP incorporates into endogenous comet-like
vesicles and macropinosomes in living cells. (a)
Confocal time-lapse imaging of Clone 9 hepatocytes expressing Dyn2-GFP.
Dynamic comet-like structures were observed. N, nucleus.
(b-e) Higher magnification revealed that
these motile structures consisted of a brightly stained head followed
by a tail structure (arrows) that extends 180° from the direction of
movement. (f) The velocity of the movement was
uniform as revealed by the consistent distances between projected
frames of the time-lapse images (arrows).
(g-k) Confocal time-lapse imaging of
Dyn2-GFP in NIH 3T3 fibroblasts revealed large vesicular structures
associated with small tails of Dyn2-GFP (arrows and boxes).
(h' and k') High magnifications of
individual macropinosomes from frames h and
k, respectively. Consistent with the formation of
macropinosomes, these structures formed from zones of active membrane
ruffling at the cell periphery. (Bar, 10 µm.) See Movies 1 and 2, which are published as supporting information on the PNAS web site,
.
| Dyn2 is an integral component of actin comets. Cultured rat fibroblasts and Clone 9 hepatocytes showing dynamin incorporated into PIP5KIα-induced actin comets. (a and a') Comets in a rat fibroblast expressing Dyn2aa-GFP and colabeled with cortactin. The Dyn2 labeling is brightest at the head of the comet (arrows) but is prominent also in the tail (Inset, arrows). In contrast, cortactin staining is localized predominantly to the comet tail. RF, rat fibroblast; αCortY, anti-cortactin. (b and b') Comets in a Clone 9 hepatocyte immunolabeled for dynamin (αDyn2) and actin (rhodamine-phalloidin). Note the Dyn2 enrichment in the head and staining in the tails (arrows and Inset), whereas actin stains the tail only. (a: bar, 3 µm; b: bar, 2 µm.)
| Dyn2 regulates comet formation, actin tail length, and comet velocity. For quantitation of comet formation and actin tail length, rat fibroblasts coexpressing Myc-PIP5KIα and wild-type or mutant Dyn2-GFP were fixed and stained for actin (rhodamine-phalloidin). (a) Cells expressing the K44A mutant show on average only 1.2 comets per cell, a 72.1% reduction compared with cells expressing PIP5KIα alone (4.3), and Dyn2ΔPRD expression shows a reduction in comet formation of 25.6% (3.2 comets) compared with PIP5Kα control. (b) The average comet tail length in cells expressing PIP5KIα and Dyn2 was only 6.5% longer than PIP5KIα control (5.7 µm), whereas those in cells expressing Dyn2K44A were 40.8% shorter (3.2 µm). In contrast, comet tails in Dyn2ΔPRD-expressing cells were 16.5% longer (6.2 µm) than control. (c) Particle-tracking analysis showed that Dyn2K44A-GFP and Dyn2ΔPRD-GFP comets progressed with reduced velocities of 0.09 and 0.11 µm/s, respectively, whereas wild-type Dyn2-GFP comets progressed at 0.14 µm/s. See Movies 3-5 (which are published as supporting information on the PNAS web site) for comparison of the Dyn2 comets.
| Mutant dynamin proteins induce abnormal comet movements. Rat fibroblasts coexpressing Myc-PIP5KIα and wild-type or mutant forms of Dyn2-GFP were imaged for 100 frames, and the movement of comet structures was followed. (a) Cells expressing wild-type Dyn2-GFP formed numerous comets (arrows and Inset) that actively incorporated the tagged Dyn2 (see Movie 3). (a') One hundred frames from the time-lapse images were stacked to show the movement characteristics of individual comets. Each color represents a distinct comet path. Note the linear quality of comet movement. Arrows, multiple comets appeared to form from a single domain. (b) A K44A-GFP-expressing cell with comets (arrows). The comets are fewer and much smaller than those of wild type (see Movie 4). (b') One hundred stacked frames from the K44A-GFP time-lapse. These comets often had curved and wandering paths (arrows) and were less efficient in their translocation. See the Dyn2K44a-GFP video (Movie 4, arrow on right) for an example of defective movement. (c) Comets in cells expressing the truncated Dyn2ΔPRD-GFP are dark and do not incorporate the mutant protein (see Movie 5). (c') One hundred frames from the ΔPRD-GFP video revealed that these comets moved in a similar manner to those of wild-type Dyn2, with smooth curvilinear paths. (Bars, 10 µm.)
| GTPase-defective Dyn2 comets move with decreased efficiency. Dyn2K44A-GFP comets show a dramatically reduced MI compared with actin-GFP, Dyn2-GFP, and Dyn2ΔPRD-GFP comets. One hundred frames from GFP time-lapse videos were stacked and superimposed over a circle with an outer radius of 5.0 µm (red) to provide a point of origin of individual comets. The distance traveled (yellow) to completely traverse the 5.0-µm radius was determined for at least 12 comets. The ratio of 5.0 µm and the distance traveled is the MI. (a and c) Actin-GFP, Dyn2-GFP, and Dyn2ΔPRD-GFP comets moved nearly linearly (1.0). (b and c) Dyn2K44A-GFP comets have an MI of only 0.54, indicating their efficiency of movement was impaired severely (decreased linearity). Note that Dyn2ΔPRD-GFP comets also had linear movement despite having a reduced velocity as shown in Fig. 3c. (Bar, 5.0 µm.)
| Comets assemble on macropinosomes forming from membrane ruffles in PIP5KIα-expressing cells. Time-lapse confocal imaging of microinjected rat fibroblasts expressing PIP5KIα and actin-GFP. These cells often formed large macropinocytic structures from peripheral membrane ruffles. (a) Actin-GFP fluorescence in a cell undergoing active membrane ruffling (box). (b-d) Enlarged image of the boxed area in a. Time-lapse frames at 10-s intervals revealed macropinosomes forming directly from the peripheral membrane ruffles (arrowhead). The large vesicle head and short, trailing, actin tail are resolved easily (arrows). Similar to the endogenous Dyn2-GFP macropinosomes (Fig.1), the tail remained 180° opposed from the direction of movement. (Bar, 10 µm.) See Movie 6.
| Dyn2 is an integral component of actin comets. Cultured rat fibroblasts and Clone 9 hepatocytes showing dynamin incorporated into PIP5KIα-induced actin comets. (a and a') Comets in a rat fibroblast expressing Dyn2aa-GFP and colabeled with cortactin. The Dyn2 labeling is brightest at the head of the comet (arrows) but is prominent also in the tail (Inset, arrows). In contrast, cortactin staining is localized predominantly to the comet tail. RF, rat fibroblast; αCortY, anti-cortactin. (b and b') Comets in a Clone 9 hepatocyte immunolabeled for dynamin (αDyn2) and actin (rhodamine-phalloidin). Note the Dyn2 enrichment in the head and staining in the tails (arrows and Inset), whereas actin stains the tail only. (a: bar, 3 µm; b: bar, 2 µm.)
| Dyn2 regulates comet formation, actin tail length, and comet velocity. For quantitation of comet formation and actin tail length, rat fibroblasts coexpressing Myc-PIP5KIα and wild-type or mutant Dyn2-GFP were fixed and stained for actin (rhodamine-phalloidin). (a) Cells expressing the K44A mutant show on average only 1.2 comets per cell, a 72.1% reduction compared with cells expressing PIP5KIα alone (4.3), and Dyn2ΔPRD expression shows a reduction in comet formation of 25.6% (3.2 comets) compared with PIP5Kα control. (b) The average comet tail length in cells expressing PIP5KIα and Dyn2 was only 6.5% longer than PIP5KIα control (5.7 µm), whereas those in cells expressing Dyn2K44A were 40.8% shorter (3.2 µm). In contrast, comet tails in Dyn2ΔPRD-expressing cells were 16.5% longer (6.2 µm) than control. (c) Particle-tracking analysis showed that Dyn2K44A-GFP and Dyn2ΔPRD-GFP comets progressed with reduced velocities of 0.09 and 0.11 µm/s, respectively, whereas wild-type Dyn2-GFP comets progressed at 0.14 µm/s. See Movies 3-5 (which are published as supporting information on the PNAS web site) for comparison of the Dyn2 comets.
| Mutant dynamin proteins induce abnormal comet movements. Rat fibroblasts coexpressing Myc-PIP5KIα and wild-type or mutant forms of Dyn2-GFP were imaged for 100 frames, and the movement of comet structures was followed. (a) Cells expressing wild-type Dyn2-GFP formed numerous comets (arrows and Inset) that actively incorporated the tagged Dyn2 (see Movie 3). (a') One hundred frames from the time-lapse images were stacked to show the movement characteristics of individual comets. Each color represents a distinct comet path. Note the linear quality of comet movement. Arrows, multiple comets appeared to form from a single domain. (b) A K44A-GFP-expressing cell with comets (arrows). The comets are fewer and much smaller than those of wild type (see Movie 4). (b') One hundred stacked frames from the K44A-GFP time-lapse. These comets often had curved and wandering paths (arrows) and were less efficient in their translocation. See the Dyn2K44a-GFP video (Movie 4, arrow on right) for an example of defective movement. (c) Comets in cells expressing the truncated Dyn2ΔPRD-GFP are dark and do not incorporate the mutant protein (see Movie 5). (c') One hundred frames from the ΔPRD-GFP video revealed that these comets moved in a similar manner to those of wild-type Dyn2, with smooth curvilinear paths. (Bars, 10 µm.)
| GTPase-defective Dyn2 comets move with decreased efficiency. Dyn2K44A-GFP comets show a dramatically reduced MI compared with actin-GFP, Dyn2-GFP, and Dyn2ΔPRD-GFP comets. One hundred frames from GFP time-lapse videos were stacked and superimposed over a circle with an outer radius of 5.0 µm (red) to provide a point of origin of individual comets. The distance traveled (yellow) to completely traverse the 5.0-µm radius was determined for at least 12 comets. The ratio of 5.0 µm and the distance traveled is the MI. (a and c) Actin-GFP, Dyn2-GFP, and Dyn2ΔPRD-GFP comets moved nearly linearly (1.0). (b and c) Dyn2K44A-GFP comets have an MI of only 0.54, indicating their efficiency of movement was impaired severely (decreased linearity). Note that Dyn2ΔPRD-GFP comets also had linear movement despite having a reduced velocity as shown in Fig. 3c. (Bar, 5.0 µm.)
| Comets assemble on macropinosomes forming from membrane ruffles in PIP5KIα-expressing cells. Time-lapse confocal imaging of microinjected rat fibroblasts expressing PIP5KIα and actin-GFP. These cells often formed large macropinocytic structures from peripheral membrane ruffles. (a) Actin-GFP fluorescence in a cell undergoing active membrane ruffling (box). (b-d) Enlarged image of the boxed area in a. Time-lapse frames at 10-s intervals revealed macropinosomes forming directly from the peripheral membrane ruffles (arrowhead). The large vesicle head and short, trailing, actin tail are resolved easily (arrows). Similar to the endogenous Dyn2-GFP macropinosomes (Fig.1), the tail remained 180° opposed from the direction of movement. (Bar, 10 µm.) See Movie 6.
Большая GTPase dynamin (Dyn2) взаимодействует с несколькими различными актин-связывающими белками. Экспрессировали GFP-нагруженный Dyn2 в культивируемых клетках и наблюдали мечение комета-подобных пузырьков и macropinosomes. Структцры комет прогрессировали с постоянной скоростью и напоминали актиновые кометы, ассоциированные с подвижными пузырьками в клетках, экспрессирующих типа I phosphatidylinositol phosphate 5-kinases. Клетки, экспрессирующие типа I
phosphatidylinositol phosphate 5-kinase и Dyn2-GFP выявили четкую ко-локализацию Dyn2 и актина в структурах комет. Формирование комет и подвижность были нормальными в клетках, экспрессирующих Dyn2-GFP дикого типа, но были существенно изменены в клетках, экспрессирующих мутантную форму Dyn2. Dyn2K44A-GFP мутантные клетки обнаруживали существенную редукцию количества, длины, скорости и эффектиности движения комет. Напротив, кометы в клетках, экспрессирующих Dyn2ΔPRD-GFP, выглдели темными и не включали мутаный Dyn2 белок, указывая тем самым, что proline-rich domain (PRD) необходим для рекрутирования Dyn2. Лалее, эти кометы были существенно длиннее и медленнее, чем в контролных клетках. Все это указывает на роль Dyn2 в базирующейся на актине подвижности пузырьков.
vesicle motility|PIP5KI|membrane trafficking
Dynamin это в 100-kDa большая GTPase, которая функционирует, чтобы tubulate мембраны и высвобождать образующиеся пузырьки из аппарата Гольджи и плазматической мембраны. Dynamin 2 (Dyn2) локализуется в одетых клатрином ямках, аппараете Гольджи и кортикальных актиновых манжетках (ruffles). Известно, что динамин непосредственно взаимодействует с ассоциированными с актином белками, включая Wisckott-Aldrich Syndrome protein (N-WASP) партнер по связыванию syndapin и актин-связывающие белки profilin и actin-binding protein-1. Считается, что актиновый цитоскелет функционирует синергично с др. белками, включая динамин, чтобы скоординировать образование и перемещение пузырьков. Показано, что Dyn2 непосредственно связывается и функционирует с F-actin чвязывающим белком cortactin, чтобы регулировать сборку актина в эпиелиальных клетках. Это прямое взаимодействие обкспечивается proline-rich domain (PRD) и Src homology three доменом Dyn2 и cortactin, соотв. Сortactin, ка известно, локализуется в хвостах базирующихся на актине подвижных пузырьков (comets), индуцируемых с помощью активированной формы малой GTPase Arf6, и с хвостами подвижных эндомоных пузырьков. Актин комет м.б. также индуцирован экспрессией типа I phosphatidylinositol phosphate 5-kinase α (PIP5KIα), обеспечивая в результате локальный синтез и накопление phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate. Его накопление вместе с N-WASP и Arp2/3 комплексом, индуцирует de novo nucleation базирующихся на актине комет, чьей функцией является приведение в движение пузырьков из донорских компартментов через цитоплазму. Эти пузырьки образуются преимущественно в аппарате Гольджи и плазматической мембране, места в которых Dyn2 обеспечивает отшнуровку пузырьков. GFP-нагруженные Dyn2 (Dyn2-GFP) метят комет-подобные пузырьки в культивируемых гепотоцитах крыс (Clone 9). Эти структуры содержат хорошо прокашенные головки динамина, сопровождаемые хвостами, напоминающими хвосты актиновых комет подвижных пузырьков у PIP5KI-экспрессирующих клеток и внутриклеточных патогенов, таких как Listeria monocytogenes. Кроме того наблюдались широкие Dyn2-GFP точки, локализованные на поверхности macropinosomes, формируемых из периферических мембран бахромы (ruffles) клеток NIH 3T3. Иммуноцитохимия живых клеток показала, что Dyn2 является интегральным компонентом актиновых комет, ассоциированных с macropinosomes, и показала, что мутантные белки Dyn2 вызывают уменьшение образования комет, дефекты длины хвостов комет, снижение скорости перемещения и нерегулярнойсь перемещений комет. Следовательно, Dyn2 участвует comet-based транспорте macropinosomes в живых клетках.Dynamin as an Integral Component of Actin Comets.
Итак, установлено, что большая GTPase dynamin является важным компонентом актиновых комет, которая функционирует, чтобы регулировать образование, скорость и подвижность этих динамических органелл. Показано, что Dyn2 ассоциирует как с головками, так и хвостами комет и что Dyn2 является существенным компонентом кухни (machineries) образования и транслокации комет. Мутанты Dyn2 не только ингибируют образование хвостов, но и существенно влияют на нормальную функцию хвостов, приводя к снижению скорости и нарушению свойств транслокации (Рис. 3a и 5). Получены строгие доказательства того, что эта большая GTPase является bona fide компонентом актиновых комет. Ни точковые ни укороченные мутации Dyn2 не нарушают длины и подвижноси комет, указывает на то, что Dyn2 играет функциональную роль. Довольно неожиданна локализация динамина в богатых актином структурах, таких как оборки (ruffles) у мигрирующих клеток или ростовые конусы. Эта локализация, как полагают, обеспечивается, по крайней мере, двумя различными актин-связывающими белками, cortactin и profilin, с которыми непосредственно связываентся dynamin, и которые являются компонентами актиновых комет. Скорее всего динами играет роль в регуляции сборки актина или в обеспечении взаимодействий мембран с актиновыми филаментами.
Dynamin as a Regulator of Actin Dynamics in Motile Comets.
Известно, что актиновые кометы транслоцируются через цитоплазму, используя дендритную flow модель полимеризации актина с G-актиновыми мономерами для сборки в актиновые филаменты в головном домене кометы, а все вместе они формируют разветвленную сеть, которая функционирует, чтобы толкать органеллу вперед.
organelle forward. Эта регулируемая нудная работа сборки/разборки обеспечивается за счет присоединения акцессорных белков, таких как profilin, N-WASP, Arp2/3
комплекс, phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate и возможно cortactin. Работа актина является основным, если не единственным источником подвижности, т.к. скорость полимерного обмена равна скорости комет. Dyn2 без сомнения является компонентом
comet regulatory machinery. Это согласуется с фактом, что Dyn2K44A мутантный белок снижает количество кометы-формирующих пузырьков и существенно редуцирует длину, а также скорость и эффективность подвижности комет. Известно, что Dyn2K44A ингибирует динамику актина, но механизм этого не известен.
В противоположность мутантам Dyn2K44A Dyn2ΔPRD укороченные мутанты ведут себя совсем по другому. Эти мутантв также формируют меньше комет, но они значительно длиннее, чем у мутантов Dyn2K44A-GFP (93.8% длиннее) и дикого типа Dyn2 (8.7% длинее) кометы. Укороченные Dyn2ΔPRD не собираются в кометы, превращая их в темные профили у мутантных клеток, экспрессирующих GFP (Рис. 4 и
Movie 6). Клетки, экспрессирующие этот мутантный белок обнаруживают мнгочисленные большие актиновые стрессовые волокна, указываюшщие на то, что равновесие динамики актина сдвинуто в направлении полимеризованного состояния. Далее, укороченный Dyn2ΔPRD белок не способен локализоваться в богатом актином кортексе вместе со своим партнером по связыванию cortactin, тогда как некоторые эндогенные Dyn2 делпюь это. Следовательно, в отсутствие PRD Dyn2 не способен соединяться с cortactin, чте ветед к занчительным изменениям в состоянии полимеризации актина в клетке. Более длинные, более медленные кометы у Dyn2ΔPRD-экспрессирующих клеток согласуются с тем, что без инкорпорации Dyn2 в кометы, нормальная работа актина изменяется в сторону полимеризованного состояния.
Dynamin as a Component of Macropinosomes.
Факт, что Dyn2-GFP обнаруживается как широкая, хорошо определяемая точка в интимной ассоциации с подвижными пузырьками и формирующимися макропиносомами (Рис. 1) в клетках, не экспрессирующих PIP5KIα является информативным. Во-первых, Dyn2 м. участвовать в нуклеации актина с поверхности мембран. Во=вторых, Dyn2 ассоциирует с подвижными мембранами и , следовательно, с образованием комет, происходящим в нормальных клетках без увеличения уровней phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate или ARF6. Хотя длина хвостов комет, ассоциированных с макропиносомами, меньше, чем в PIP5KIα- или ARF6-экспрессирующих клетках, факт, что кометы действительно образуют формы, вообще более физиологической длины, является достоверным. В-третьих, наблдения, представленные на Рмс. 1 и 6 строго подтверждаеют, что Dyn2 является компоенентом процесса макропиноцитоза, одним из немногих белков, участвующих в этом загадочном пути эндоцитоза. Т.к. не удается ингибировать макропиноцитоз, используя ингибирующие антитела или доминантные негативные белки, то м. предположить, что Dyn2 не участвует в этом пути. Возможно, что хотя Dyn2 и не участвует в начальных ступениях интернализациии процесса макропиноцитоза он активен на важной последующей ступени, связанной с базирующейся на актине подвижностью.
Dyn2, dynamin 2; PRD, proline-rich domain; PIP5KIα, type I phosphatidylinositol phosphate 5-kinase α; GFP, green fluorescent protein; MI, movement index.
This article has been cited by other articles:
 |
|
|
|
M. D. Welch and R. D. Mullins CELLULAR CONTROL OF ACTIN NUCLEATION Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., January 1, 2002; 18(1): 247 - 288.
|
|
|
|
|
|
L. Pelkmans, D. Puntener, and A. Helenius Local Actin Polymerization and Dynamin Recruitment in SV40-Induced Internalization of Caveolae Science, April 19, 2002; 296(5567): 535 - 539.
|
|