Посещений:
Экзоцитоз аквапорина 2 в клетках почек

Functional involvement of VAMP/synaptobrevin-2 in cAMP-stimulated aquaporin 2 translocation in renal collecting duct cells
S. Gouraud, A. Laera, G. Calamita, Monica Carmosino, G. Procino, O. Rossetto, R. Mannucci, W. Rosenthal, M. Svelto and G. Valenti
Journal of Cell Science. 2002. V. 115. P. 3667-3674.

Перевод Л.М. Константиновой
Функциональное участие VAMP/синаптобревина-2 в цАМФ-стимулируемом переносе аквапорина 2 в клетках собирающего протока почек

Исследовали участие растворимых протеинов N-этилмалеимид-чувствительного белкового рецептора (SNARE) в цАМФ-индуцируемом экзоцитозе везикул, содержащих аквопорин 2 (AQP2), в AQP2-трансфицированных CD8-клетках почек. Методами RT-PCR и вестерн-блоттинга было подтверждено присутствие SNARE-гомологов VAMP/синаптобревина-2, синтаксина-1, синтаксина-4 и SNAP-23 в клетках CD8. Использование нейротоксина столбняка (TeNT) было эффективно в разложении синаптобревин-подобного белка, как in vitro, так и в интактных CD8-клетках, инкубированных с токсином. Воздействие TeNT на инкубированные CD8-клетки совершенно прекращало цАМФ-стимулируемый захват аквапорина 2 плазматической мембраной. При количественном анализе было выявлено, что иммунореактивность поверхности клетки к анти-AQP2-антителу возрастает по сравнению с репродукцией пептидов внеклеточной C-петли аквапорина 2.
Эти результаты представляют собой первое свидетельство функционального участия VAMP-2 в цАМФ-индуцированном экзоцитозе аквапорина 2 в клетках почек.

Реабсорбция воды в собирающем протоке почки регулируется аквопорином 2 (AQP2) и сопряжена с процессами экзо-/эндоцитоза. Аквапорин 2 содержится во внутриклеточных везикулах, которые соединяются с апикальной мембраной основных клеток собирающего протока в присутствии антидиуретического гормона - вазопрессина (Knepper & Inoue, 1997; Klussmann et al., 2000). Главные кандидаты на роль белков, обеспечивающих специфичность поляризованной сортировки - растворимые адаптерные молекулы - протеины N-этилмалеимид-чувствительных белковых рецепторов (SNARE). Специфичность этого процесса достигается путём попарного объединения SNARE-белков в везикулах носителя - v-SNARE (Q-SNARE - Fasshauer et al., 1998) с родственными им SNARE-белками в мембране клеток-мишеней - R-SNARE (Aroeti et al., 1998; Rothman, 1994; Rothman & Wieland, 1996). Белки Q-SNARE и R-SNARE были идентифицированы в процессах захвата на всём протяжении от аппарата Гольджи до плазматической мембраны в нейронах и у дрожжей (Rothman, 1994). Вероятно, что событие, которое регулирует перенос аквапорина 2 в клетках почек, использует для экзоцитоза механизм, подобный описанному для клеток нейронов. Этой гипотезе не противоречат предыдущие исследования, которые подтвердили экспрессию SNARE-белков в клетках собирающего протока почки (Jo et al., 1995; Liebenhoff & Rosenthal, 1995; Nielsen et al., 1995; Mandon et al., 1996; Inoue et al.,1998). Однако до настоящего времени не было представлено прямых доказательств функционального участия SNARE-белков в регулируемом экзоцитозе аквапорина 2 водных каналов.
Для того чтобы исследовать, участвуют ли SNARE-белки в этом процессе, нами были использованы AQP2-трансфицированные CD8-клетки (Valenti et al., 1996), которые являются в данном случае идеальной моделью для изучения молекулярных механизмов экзоцитоза (Valenti et al., 1998; Valenti et al., 2000; Tamma et al., 2001). Нами была установлена экспрессия SNARE-белков. Кроме того, мы исследовали эффект нейротоксина столбняка (TeNT) на цАМФ-индуцированное перемещение аквапорина 2 в интактных CD8-клетках. Настоящее исследование ясно доказывает, что SNARE-белок VAMP/синаптобревин-2 (VAMP-2) функционально вовлечён в цАМФ-стимулируемый перенос аквопорина 2 в клетках собирающего протока почек.

ОБСУЖДЕНИЕ
Коэффициент водной реабсорбции в собирающем протоке почки регулируется вазопрессином. Этот гормон управляет межклеточным переносом воды путём перераспределения AQP2-несущих везикул к апикальной мембране основных клеток собирающего протока.(Knepper & Inoue, 1997; Klussmann et al., 2000). Чтобы исследовать функциональную причастность SNARE-белков к процессу регулируемого перемещения инсерции водного канала, мы использовали клетки собирающего протока линии CD8 стабильно трансфицированные чувствительным к вазопрессину аквапорином 2.



В данном исследовании, представлено доказательство, прямо подтверждающее гипотезу, что v-SNARE-белок VAMP-2 вовлечён в захват апикальной плазматической мембраной аквапорина 2 из везикул. В интактных CD8-клетках форсколин-индуцированное перемещение аквапорина 2 к апикальной мембране было прекращено при воздействии TeNT (рис. 5). Этот токсин протеолитически разлагает VAMP-2 (Link et al., 1992). Было предположено, что VAMP-2 играет ведущую роль в механизме траффикинга везикул (Sollner et al., 1993). Это доказательство основано, главным образом, на способности TeNT и ботулинических нейротоксинов разлагать VAMP-2 в различных точках (Schiavo et al., 1995), что приводит к ингибированию нейромедиатора в нейронных и нейроэндокринных клетках (Hunt et al., 1994). Регуляторная роль изоформ синаптобревина также была доказана для экзоцитозе GLUT4 (в адипосайтах), гистамина (в энтерохромаффин-подобных клетках), акросом сперматозоидов и для траффикинга H+-АТФазы (в мозговом слое собирающего протока): (Banerjee et al., 2001; Banerjee et al., 1999; Foster & Klip, 2000; Hohne-Zell et al., 1997; Martin et al., 199S; Schuiz et al., 1997). Таким образом, SNARE-белки, вероятно, выполняют универсальную роль в везикулярно-мембранном слиянии как в нейронах, так и в клетках других тканей.
В клетках почек путём количественной двойной иммунометки, была показана, колокализация VAMP-2 с везикулами, содержащими аквапорин 2 (Nielsen et al., 1995), подтверждающая роль VAMP-2 в вазопрессин-регулируемом траффикинге везикул. В том же исследовании авторы продемонстрировали, что TeNT вызывал полное разложение VAMP-2 в мембранной фракции, обогащённой внутриклеточными везикулами из почечного мозгового вещества (Nielsen et al., 1995). Jo и соавторы (1995) сообщили, что очищенные AQP2-содержащие эндосомы внутреннего мозгового слоя из почки крысы, содержат VAMP-2. Авторы продемонстрировали слияние эндосом in vitro, посредством ATФ-зависимого процесса, который значительно ингибируется, если эндосомы были преинкубированы с anti-VAMP-2-антителом или TeNT.
Несмотря на факт, что эти исследования определённо указывают на функциональную причастность VAMP-2 к AQP2-регулируемому перераспределению, прямого доказательства этой роли в интактных клетках почек пока нет. Мы попытались продемонстрировать роль VAMP-2 в поляризованной сортировке путём определения влияния TeNT клостридий на цАМФ-индуцируемый перенос в интактных CD8-клетках почек. Центральным моментом в исследовании была демонстрация того, что TeNT может проникать в клетки и разлагать эндогенно экспрессированный VAMP-2. TeNT в интактных CD8-клетках полностью прекращал цАМФ-стимулируемый захват аквапорина 2 плазматической мембраной. При количественном анализе было выявлено, что иммунореактивность поверхности клетки к анти-AQP2-антителу возросла по сравнению с репродукцией пептидов внеклеточной C-петли аквапорина 2. Эти результаты представляют собой прямое доказательство функциональной роли VAMP-2 в цАМФ-индуцированном перераспределении аквапорина 2 в клетках почек. В отличие от влияния токсина на цАМФ-индуцированное перемещение аквапорина 2 к апикальной мембране, количество поверхностного аквапорина 2 в покоящихся клетках не понижается при выделении токсина (рис. 5). Это наблюдение позволяет предположить, что конститутивная доставка аквапорина 2 может быть не зависимой от VAMP-2.
В нейронах, VAMP-2 формирует комплекс с двумя плазма-мембранносвязанными SNARE-белками: синтаксином и SNAP-25. Они связываются вместе параллельным образом (Hanson et al., 1997), формируя связку с четырьмя завитками, два из которых "оккупированны" SNAP-25 и ещё два - соответственно VAMP-2 и синтаксином (Sutton et al., 1998). Формирование комплекса SNARE-белками само по себе является достаточным, чтобы приблизить две взаимодействующие мембраны на расстояние, делающее слияние возможным (Weber et al., 1998).
Среди известных изоформ синтаксина, только синтаксин-1 и синтаксин-4 связываются с VAMP-2 с высокой аффинностью (Calakos et al., 1994; Pevsner et al., 1994). Синтаксин-4 локализован в апикальной мембране основных клеток собирающего протока (Mandon et al., 1996), из чего можно предположить, что он представляет собой аналоговый белок, взаимодействующий с VAMP-2, который был найден в везикулах, содержащих аквапорин 2 (Jo et al., 1995; Nielsen et al., 1995). Наличие VAMP-2, синтаксина-1A и синтаксина-4 исследовалось методами RT-PCR и вестерн-блоттинга в CD8-клетках. В большом количестве VAMP-2 был найден во внутриклеточных везикулах, в то время, как и синтаксин-1, и синтаксин-4 были найдены в больших количествах во фракции плазматической мембраны. Дальнейшие исследования будут направлены на изучение того, взаимодействует ли VAMP v-SNARE-2 с синтаксином-1 или синтаксином-4 для опосредованного захвата аквапорин 2 .
SNAP-25 участвует в слиянии на позднем этапе (Banerjee et al., 1996; Mehta et al., 1996; Rossi et al., 1997). В клетках внутреннего мозгового слоя собирающего протока обработка ботулиническим токсином E, разлагающим SNAP-23 у крыс, понижала количество H+-АТФазы, перемещённое к апикальной мембране, примерно до 52%, демонстрируя, что SNAP-23 играет критическую роль в регуляции H+-АТФазы экзоцитоза (Banerjee et al., 2001). Мы полагаем, что SNAP-23, обнаруженный в больших количествах во фракции плазматической мембраны клеток CD8, действует аналогично в клетках почек. Дальнейшее исследование необходимо, чтобы оценить роль специфических SNARE-белков в динамике формирования комплекса.
Подводя итог, можно сказать, что результаты данного исследования, во-первых, явно доказывают непосредственное участие VAMP v-SNARE-2 в стыковке и слиянии везикул, содержащих аквапорин 2, с плазматической мембраной интактных AQP2-трансфицированных CD8-клеток; во-вторых, создают основу для понимания механизма и регуляции переноса аквапорина 2 в ответ на цАМФ-агент
Сайт создан в системе uCoz