ARTERIES AND VEINS: MAKING A DIFFERENCE WITH ZEBRAFISH
Nathan D. Lawson & Brant M. Weinstein (bmw7@mail.nih.gov) Nature Reviews Genetics Vol 3 No 9. 674-682 (2002)
Arteries and veins are structurally different and have long been
functionally defined by the direction of blood flow that they carry.
However, a growing body of evidence indicates that the identity of the
endothelial cells that line these vessels is determined in the developing
embryo, before circulation begins. Recent work on the zebrafish has led to
the identification of signals that are responsible for arterial and venous
differentiation of endothelial cells, and highlights the unique benefits
of this model organism in the study of vascular development.
(Рис.1.) | Molecular markers define arterial and venous cell identity.
Lawson, N. et al. phospholipase C γ-1 is required downstream of vascular endothelial growth factor during arterial development. Genes Dev. 1 June 2003 (10.1101/gad.1072203) | | |
We used to think that differences in blood flow determined whether a blood vessel developed as an artery or a vein, but recently it became clear that this decision is genetically predetermined through vascular endothelial growth factor () signalling. Using transgenic zebrafish, Nathan Lawson and colleagues have now identified as a key gene, downstream of Vegf, which directs endothelial cells along the arterial developmental pathway.
Lawson et al. скринировали линии рыбок данио, у которых были флюоресцентно мечены кровеносные сосуды между сомитами. Т.о. они индетифицировали мутант (y10) с дефектами в развити артерий, но не вен и с редцуированной экспрессией артерий-специфических генов в эмбриональной дорсальной аорте.
Мутанты y10 вочпроизводили мутантный Vegf-knockout фенотип мышей и рыбок данио, картированный в локализации удаленной от или его рецептора. Сегрегационный анализ позволил Lawson et al. поместить его в области, в которой находятся несколько ESTs сходных с крыс.
Анализ сцепления и экспрессии plcg1 дал строгие косвенные доказательства того, что мутация в этом гене дает фенотип y10. Последующий анализ последовательностей plcg1 позволил выявить G-to-A transition, которая удаляет сайт splice acceptor.
Использовали антисмысловой morpholino для intron–exon соединений, чтобы воспроизвести эффекты рассматриваемой мутации. Уменьшение количества распространяющихся сегментыных сосудов у эмбрионов после инъекции morpholino соответстовало фенотипу y10. Затем они установили, что инъекция дикого типа plcg1 мРНК восстанавливают мутантов y10.
Однако, наиболее важным аспектом этой работы оказалось то, что y10 мутантный фенотип не м.б. восстановлен инъекциями дикого типа vegf, это первое доказательство in vivo, что plcg1 действует ниже Vegf. Более того, т.к. мыши, у которых отсутствет Plcg1 также имеют тяжелые дефекты в формировании кровеносных сосудов, то кажется, что этот онтогенетический путь м.б. законсервирован у всех позвоночных.
WEB SITES |
Кровеносные сосуды позвоночных выполняют различные функции во время эмбриональной и взрослой жизни. Они разносят насыщенную кислородом кровь по всему телу с целью фильтрации метаболитов и шлаков. Циркулярная система служит также для общения между цдаленныи тканями благодаря транспорту гормонов, делая возможной быструю иммунную реакцию. Существует широкий круг врожденных и благоприобретенных заболеваний у человека, связанных с патологией кровеносных сосудов. Большое внимание привлекают эндотелиальные клетки, выстилающие сосуды. Они возникают из у эмбрионов позвоночных и вносят вклад в первые кровеносные сосуды благодаря процессу и . Имеются доказательства, что выбор клетками в пользу этой судьбы происходит еще до начала циркуляции у эмбрионов позвоночных и что это связано со сложным взаимодействием нескольких сигнальных путей. Более того, установлено, что дифференцировка артериальных и венозных эндотелиальных клеток является обязательным условием образования кровеносных сосудов.
What is the difference?
Начиная с Harvey's структурные различия между артериями и венами относят к физиологическим факторам, таким как направление и давление крови. До последнего времени не подозревали, что существуют молекулярные различия между артериаьными и венозными эндотелиальными клетками еще до образования сосудов и что генетические факторы, а не физиологические ответственны за эти инициальные отличия.
Впервые в 1998 Wang et al. описали паттерн экспрессии эмбрионального ephrin-B2 (), члена семейства связанных с мембраной лигандов. Efnb2 экспрессируется специфически в артериальных, но не венозных эндотелиаьных клетках еще до начала циркуляции у эмбрионов мыши, в то время как , ген, кодирующий предполагаемый рецептор для Efnb2, обнаруживается на значительно более высоких уровнях в венах, чем в артериях (Рис. 1a). Эти различия выявлены и у эмбрионов кур, лягушек и рыбок данио (, Рис. 1b), а также в кровеносных сосудах взрослых мышей и людей.
У эмбрионов рыбок данио, возникают в задней латеральной мезодермеи мигрируют в , чтобы сформировать дорсальную аорту и заднюю кардинальную (cardinal) вену туловища (Рис. 2). Клональные исследования показали, что некоторые ангибласты м. приобретать или артериальную или венозную судьбу (Box 1)прежде, чем сформируют кровеносные сосуды. Исследования эмбрионов птиц показали, что судьба эндотелиальных клеток остается пласичной даже после начала циркуляции и сто она м. зависеть частично от внешних локальных сигналов. Эндотелиальные клетки из эмбриональных кровеносных сосудов перепела, которые экспрессируют Efnb2 м. вносить вклад или в артерии или в вены после трансплантации в эмбрионы кур. Если донорские артериальные клетки обнаруживались в венах хозяина, то они не экспрессировали Efnb2, указывая тем самым, что они м. переключаться на венозную судьбу. Наоборот, эндотелиальные клетки, полученные из вен м. вносить вклад и в артерии и экспрессировать Efnb2. Однако, на 7 день эмбриогенеза, артериальные и венозные эндотелиальные клетки больше не м. менять свой тип, указывая тем самым что произожшла окончательная (terminal) дифференцировка.
Notch makes a difference
Хотя специфичная для артерий экспрессия Efnb2 необходима для нормального развития сосудов, мыши без Efnb2 продолжают экспрессировать LacZ трансген, вставленный в Efnb2 локус, указывая, что экспрессия артериальных маркеров контролируется др. вышестоящими факторами. Рыбки данио имеют разнообразные артериальные и венозные молекулярные маркиеры (Табл. 1) и очень удобны для изучения развития сосудов (Boxes 2,3). Исследования на рыбках выявили важное значение передачи сигналов Notch для приобретения артериальной клеточной судьбы.
Большой трансмембранный рецептор Notch важен для предопределения клеточной судьбы в различных тканях почти у всех видов животных. У мышей и экспрессируются в эндотелиальных клетках, а экспрессия Notch4 ограничена только этими клетками. Более того, мыши, у которых отсутствует Jagged1 (один из лигандов Notch) или Notch1 имеют аномальное развитие сосудов, а экспрессия активировнной формы Notch4 специфически в сосудах (vasculature) обусловливает дефектный рост ангиогенных кровеносных сосудов. Установлено, что экспрессия некоторых Notch рецепторов и лигандов ограничивается артериями у эмбрионов мышей и рыбок данио, это указывает на их роль для артериальной дифференцировки
У рыбок данио экспрессируется специфически в дорсальной аорте, но не в задней крдинальной вене у развивающихся эмбрионов. Снижение акивности Notch у эмбрионов рыбок, лишеных mindbomb ()гена или у тех, которым микроинъецирована доминантно-негативная форма репрессора транскрипции Suppressor of hairless (Su(H)), ведет к потере артериальных маркеров, таких как ephrin b2a () или notch5. Напротив, активация пути Notch индуцирует эктопическую экспрессию артериальных маркеров в задней кардинальной вене. Несмотря на потерю экспрессии артерий-специфического гена, что ассоциирует с дефицитом передачи сигналов Notch, дорсальная аорта все же присутствует в соответ. положении, это указывает на то, что дефект дифференцировки артериальных эндотелиальных клеток скорее всего имеет место, чем неспособность ангиобластов мигрировать и сливаться для образования этого сосуда.
Кроме того путь Notch, по-видимому, супрессирует также венозную судьбу клеток. У рыбок VEGF (vascular endothelial growth factor) receptor-3 гомолог (fms-related tyrosine kinase 4) првоначально экспрессируется во всех ангиобластах, когда сформируются основные сосуды туловища, его экспрессия оказывантся ограниченной венами. Ген рыбок данио, которые кодирует предполагаетмый рецептор для efnb2a, ephB4a, также экспрессируется в задней кардинальной вене. У эмбрионов, у которых отсутствует активность Notch, и ephB4a и flt4 экспресируются эктопически в дорсальной аорте, это указывает на то, что функция notch5 м. заключаться в репрессии венозной судьбы клеток в развивающихся артериях. Так, активация пути Notch м. репрессировать flt4 во всей васкулатуре. В дополнение, активированная форма Notch5, управляемая с помощью специфического для сосудов (friend leukaemia integration 1) промотора, м.репрессировать экспрессию flt4 в венозных эндотелиальных клетках, это подтверждает автономную для эндотелиальных клеток роль notch5 в этом процессе.
Способность легко видеть васкулатуру у эмбрионов рбок данио (Boxes 2,3) позволяет анализировать в деталях дефекты морфологии сосудов, вызываемые потерей функции Notch. У такх эмбрионов плохо формируется дорсальная аорта и задняя кардинальная вена (Рис. 2), это часто приводит к . Кроме того, межсегментны сосуды, которые обычно идут вдоль вертикальных границ сомитов у всех эмбрионов позвоночных (Рис. 2), эктопически распространяются в окружающую ткань. Интересно, что оба эти дефекта обнаруживаются и у эмбрионов мышей, лишенных ,
а также у эмбрионов Xenopus laevis, которые экспрессируют доминантно-негативную форму Ephb4 .
Идентифицирована мишень для пути Notch у рыбок данио, которая необходима для развития сосудов. Эмбрионы рыбок, которые несут мутацию гена gridlock () не способны обеспечивать циркуляцию крови в туловище,
из-за неполного образования латеральной аорты (Рис. 2), которая обычно соединяет основной тракт оттока сердца с сосудистой сетью туловища. Ген grl кодирует basic helix–loop–helix белок из семейства hairy and enhancer of split транскрипционных репрессоров, он является мишенью сигнального пути Notch у мышей и рыбок данио. Также как notch5, сосудистая экспрессия grl ограничена дорсальной аортой у эмбрионов рыбок, а инъекции мРНК grl в эмбрионы рыбок данио дикого типа м. репрессировать экспрессию flt4, т.к. м. активировать notch5. Однако, grl экспрессируется в дорсальной аорте эмбрионов и при отсутствии активности Notch, и как отмечено выше, эктопическая экспрессия flt4 в дорсальной аорте очевидна в этом случае. Кроме того, grl и flt4 экспрессируются одновременно в течение всего раннего развития сосудов. Это указывает на то, что grl м. и не быть функциональным репрессором flt4 in vivo и подтверждает существование др. родственных hairy транскрипционных факторов, которым м. обеспечивать репрессию flt4 ниже пути Notch. Снижение активности Grl с помощью антисмысловых олигонуклеотидов элиминирует экспрессию в артериях efnb2a, хотя это часто ассоциирует с неспосоностью формировать дорсальную аорту подобно тем эмбрионам, которые мутантны по grlm145, аллелю gridlock. Интересно, что артериальноая дифференцировка, по-видимому, осуществляется нормально у grlm145 эмбрионов, хотя дефекты в морфогенезе сосудов туловища очевидны. Все это указывает на важную роль grl в формировании дорсальной аорты. Однако, его роль в дифференцировке артериальных эндотелиальных клеток остается неясной.
Shh and Vegf act upstream of
notch5
Sonic hedgehog (Shh) является растворимым фактором, который важен для детерминации типа клеток в структурах, которые расположены рядом с ,такими как и (Рис. 2). Мутантные рыбки данио sonic you (), которые несут мутацию в локусе Shh, имеют дефекты в формировании сомитов и циркуляции в туловище, хотя общие эндотелиальные маркеры, по-видимому, экспрессируются нормально. Однако, экспрессия артерий-специфических генов, таких как efnb2a и notch5, отсутствует у syu мутантных эмбрионов, указывая, что Shh необходим для дифференцировки артерий. Напротив, избыточная экспрессия Shh м. индуцировать образование эктопических efnb2a-позитивных клеток и кровеносных сосудов у эмбрионов рыбок данио. Боле того, дорсальная аорта и задняя кардинальная вена неспособны формироваться у мутантов syu, а вместо этого присутствет одиночный сосуд, который продолжает экспрессировать венозный маркер flt4. Это наблюдение указывает на то, что Shh является важным для артериальной дифференцировки эндотелиальных клеток и для собственно морфогенеза кровеносных сосудов во врмя развития.
Vegf необходим для развития сосудов у позвоночных, а потеря только одного алелля Vegf летальна у мышей. Показано, что у мышей основную роль Vegf играет во время образования кровеносных сосудов, которая заключается в специфической индукции образования артерий скорее, нежели вен. Напр., постнатальные мвши,которые экспрессируют только Vegf188 изоформу, но не доминирующие Vegf164 или Vegf120 изоформы, обнаруживают снижение количества Efnb2-позитивных в их сетчатках, но количество их и капиляров не изменено. Кроме того, ангиобласты м.б. индуцированы к артериальной дифференцировке in vitro за счет культивирования с сенсорными нейронами, процесса, который м.б. ингибирован воздействием растворимых Vegf рецепторов. Это согласуется с данными, полученными на рыбках данио, что редукция активности Vegf с помощью morpholino олигонуклеотидов вызвает в результате отсутствие экспрессии генов артериальных маркеров в дорсальной аорте. Итак , Vegf, по-видимому, необходим для собственно артериальной дифференцировки во время развития кровеносных сосудов
Vegf также, по-видому, достаточен для индукции артериальной дифференцировки непосредственно и, по-видимому, независимо от его способности индуцировать пролиферацию или выживаемость клеток. Напр., инъекции или Vegf121 или Vegf165 мРНК в эмбрионы рыбок данио м.индуцировать эктопическую экспрессию efnb2a в задней кардинальной вене. Мыши, которые несут Vegf164 трансген, который управляется промотором тяжелой цепи миозина, обнаруживают повышенные количестваEfnb2-позитивных капилляров и соотв. снижение Ephb4-позитивных кровеносных сосудов в сердце. Утановлено, что только ~10% ангиобластов, которые происходят от эмбрионов мыши ст. Е10.5 , спонтанно становятся Efnb2 позитивными in vitro в отсутствие Vegf, но что добавление или Vegf120 или Vegf164 увеличивает количество эндотелиальных клеток, которые экспрессируют Efnb2, до 50%. Кроме того, самые низкие концентрации или Vegf изоформ вызывали индукцию экспрессии Efnb2не затрагивая количества клеток ли их жизнеспособности. Следовательно, Vegf продуцирует важный сигнал для артериальной дифференцировки путем прямой индукции генов, специфичных для артерий.
Сходный сосудистый фенотип, ассоциируемый с потрей передачи сигналов Shh, Vegf или Notch , указывает на то. что эти пути функционируют вместе, индуцируя дифференцировау артерий. Т.к. микроинъекции мРНК или morpholinos м.б. использованы у мутантных и трансгенных эмбрионов рыбок данио, то они возможно затрагивают эти сигнаьные компоненты одновременно и помещают их в генетические пути, ответственные за дифференцировку артерий. Показано, что Shh действует выше Vegf, индуцируя артериальную эндотелиальную дифференцировку. Экспрессия vegf усиливается воздействием Shh и у эмбрионов мыши и рыбок данио, тогда как его экспрессия исчезает в отсутствие функции Shh. Это указывает на то, что потеря экспрессии генов артериальных маркеров в отсутствие Shh м.б. обусловлена сопутствующей потрейvegf. Микроинъекции vegf121 или vegf165 мРНК в эмбрионы рыбок данио м. восстановить экспрессию efnb2a в отсутствие активности Shh, это указывает на то, что Vegf является главным нижестоящим эффектором Shh во время артериальной дифференцировки.
Показано также, что передача сигналов Notch необходима ниже Vegf, чтобы индуцировать артериальную дифференцировау (Рис. 3). Микроинъекции Vegf121 мРНК вызывают эктопическую экспресиию efnb2a в задней кардинальной вене эмбрионов данио дикого типа, но не способны вызывать этот эффект у мутантных mib эмбрионов, у которых отсутсвует активность Notch (Рис. 3a). В противоположность из экспрессии у syu мутантов, vegf и его рецептор flk1 экспрессируются у mib мутантов и, по-видимому, функционируют в отсутствие активности Notch. Более того, при использовании комбинации с morpholino, чтобы снизить функцию Vegf и в индуцибельной GAL4–UAS системе активировать путь Notch, оказалочь возможным показать, что активации пути Notch достаточно в отсутствие функции Vegf, чтобы индуцировать артериальную дифференцировку (Рис. 3b). Все это показывает, что передача сигналов Notch является важным медиатором артериальной дифференцировки ниже Vegf.
Other signals
Некоторые наблюдания на данио и джр. видах позвоночных показывают, что действие др. молекул также м. вносить вклад в этот процесс. У эмбринов птиц neuropilin-1 () экспрессируется специфически в артериальных, но не в венохных эндотелиальных клетках, тогда как экспрессия receptor tyrosine kinase TIE2 ограничивается венами. Neuropilin-1 является Vegf ко-рецептором и необходим для Vegf во время артериальной дифференцировки, это указывает на то, что neuropilin-1 м. помогать трансдуцировать сигналы, важные для этого процесса. Однако, NRP1, как полагают, является ко-рецептором только для Vegf165 изоформы, но обе изоформы м. индуцировать артериальную дифференцировку у мышей и рыбок данио.
У данио T-box transcription factor экспрессируется специфически в дорсальной аорте. Интересно, что экспрессия специфичная для артерий tbx20 не затрагивается потерей сигналов Notch, в противоложность efnb2a и notch5. Кроме того, deltaC, предполагаемый лиганд для notch5, также экспрессируется специфически в дорсальной аорте эмбрионов данио, а лигнад для Notch Dll4 (delta-like 4) имеет сходный паттерн экспрессии во времяэ эмбриогенеза мыши. Гибридизация in situ с использованием эмбрионов данио привела к идентифиукации новых специфичных для сосудов маркеров.
Установлено, что путь передачи сигналов TGF-β также м.б. важным в детерминации артериальной судьбы клеток. Эмбрионы мыши без TGF-β type I рецептора имеют дилятированные магистральные сосуды и артерио-венозные уродства, сходные с теми, что обнаруживаются у данио при отсутствии функции Notch или Vegf. Отсутствие Acvrl1 показывает, что они неспособны экспрессировать Efnb2 в своих артериях, хотя эмбрионы данио, которые несут нулевой аллель acvrl1 экспрессируют нормльные уровни efnb2a в дорсальной аорте. Интересно, что мутации в гомологах человека acvrl1 ведут к наследственной haemorrhagic telangiectasia type II (HHT2), которая характеризуется изменчивым присутствием артеио-венозных уродств и , указывающих на возможную роль артериальной дифференцировки в патологии данного заболевания.
Arterial/venous cell fate determination
Итак, сложные взаимодействия между различными сигнальными путями ответственны за артериальную дифференцировку эндотелиальных клеток (Рис. 4). В серединие сомитогенеза рыбок данио Shh экспрессируется в хорде и индуцирует в соседствующей с сомитами ткани экспрессию vegf. В свою очередь, экспрессия vegf в тесной близи к ангиобластам, которые к этому времени начинают мигрировать к срединной линии (midline) (Рис. 4a). На ст. 16–18 сомитов, ангиобласты начинают слипаться в презумптивную дорсальную аорту и заднюю кардинальную вену. В это время, воздействие на презумптивные артериальные клетки Vegf индуцирует передачу сигналов Notch, возможно путем управления экспрессии notch5, которая вызывает в результате экспрессию важных функциональных генов, специфичных для артерий, таких как efnb2a (Рис. 4b). Кроме того, активация пути Notch ведет к репрессии венозной судьбы клеток, на это указывает потеря экспрессии flt4 в дорсальной аорте спустя 24 ч после оплодотворения.
Хотя недавние исследования показывают, что Vegf способен индуцировать специфическую артериальную дифференцировку, не нарушая пролиферации или жизнеспособности клеток, но как это осуществляется неизвестно. У рабок данио, это м. б. просто различия в положении, т.к. ангиобласты мигрируют в направлении срединной линии — те, которые достигают первыми, возможно получают др. сигналы в отличие от более дистальных клеток, это м. служить базой для оппозитной детерминации судьбы клеток. Альтернативно, артериальная или венозная спецификация м. осуществляться до воздействия Vegf. Артериальные, но не венозные предшественники д.б. предрасположены к реакции на Vegf за счет индуцкии экспрессии notch5 и нижестоящих artery-специфических генов. Во всяком случае, др. сигналы. по-видимому, играют роль в детерминации чувствительности эндотелиальных клеток к сигналам Vegf и Notch. Напр., в отсутствие Vegf, активированный Notch1 восстанавливает экспрессиюefnb2aболее полно в дорсальной аорте, чем в задней кардинальной вене, хотя активированный Notch в этом случае экспрессируется во всем эмбрионе>. Более того, восстановление экспрессии efnb2a с помощью Vegf у данио, у которыхt отсутсвует Shh, часто обнаруживается в значительно большей степени в дорсальной аорте
Why be different?
Главные артерии и вены образуются в непосредственной близости др. к др., образуясь из первоначально гомогенной популяции ангиобластов. В результате возникновения ранних различий в этих клетках становится возможной их сортировка для образования артерий и вен. Так, у эмбрионов рыбок данио, у которых Vegf или Notch сигналы редуцированы обнаруживают несоответсвующие циркуляторные соединения между дорсальной аортой и задней кардинальной веной, которые указывают на на неспособность закончить полное образование разных типов сосудов.
И Efnb2 и Ephb4 также необходимы для собственно помещения кровеносных сосудов в соотв. им место во время ангиогенеза, это указывает на то, что артериальная и венозная спецификация м.б. целью для соотв. формирования паттерна васкулатруы у позвоночных. У эмбрионов мышей и лягушек назрушение функции или Efnb2 или Ephb4 дает в результате эктопическое проникновение кровеносных сосудов в окружающие ткани, это указывает на то, что эти молекулы м. функционировать как отталкивающие сигналы ведения (guidance) , что сходно с их ролью в нервной системе.
