Почти все органы груди и живота имеют left-right (LR) асимметрию анатомии, положения, а в некоторых случаях и физиологии. LR асимметрия сама по себе сильно законсервированне свойство у хордовых, даже если определенные детали анатомической асимметрии, такие как сторона расположения (sidedness) венозной системы, варьируют у разных видов. Наиболее удивительным аспектом LR асимметрии является то, что все нормальные индивиды данного вида имеют идентично ориентированную асимметрию органов. Несмотря на это среди нормальных здоровых людей лишь 1 на 8500 имеет полное заркальное обратное расположение висцеральных органов (situs inversus). Если висцеральные органы обнаруживают очевидную асимметрию, то stereotypic LR асимметрия обнаруживается в головном мозге и нервной системе людей; интересно было бы узнать как LR асимметрия последних сказывается на поведении и познаватьельной способности (cognition).

Концептуально возникновение LR асимметрии м. протекать в 3 фазы во время раннего эмбрионального равзвития (Рис. 1) (Hamada et al., 2002; Mercola and Levin, 2001). Во время первой фазы билатеральная симметрия раннего эмбриона нарушается и LR ось оказывается ориентированной по отношению к передене-задней и дорсо-вентральной осям. Этот ранний паттерн перерабытывается и трансдуцируется в каскады асимметричной экспрессии генов, которые характерны для воторой фазы. Хотя асимметрические паттерны экспрессии генов отличюатся у разных видов, законсервированным признаком у всех изученных видов животных является продукция секретируемого TGFβ-подобного фактора Nodal (или гомолога Nodal) в левой латеральной пластинке мезодермы. Асимметричная экспрессия белка Nodal является критической, т.к. она создает связь с третьей фазой путём индукции экспрессии транскрипционного фактора Pitx2c. Во время третьей фазы белки, такие как Pitx2c контролируют локальные изменения в клеточной миграции, форме, пролиферации и выживании, что и обеспечивает стереотипическую асимметричную анатомию развивающихся тканей.

Proteins and structures involved in early LR asymmetry determination

Несколько белков или структур, по-видимому, являются компонентами процесса, который ориентирует ось LR асимметрии (Рис. 2). Большинство из них скорее всего действуют в близи amniote узелка или аналогичных структур у амфибий и рыб.

Monocilia
Узелок у мышей является структурой на дистальном конце E6.5 эмбрионов, состоящей из дорсального слоя эктодермы поверх вентрального слоя клеток, каждая из которые имет одиночный monocilium на их апикальной поверхности (Bellomo et al., 1996; Sulik et al., 1994) (Рис. 3). Хотя и отличается по структуре, но мышиный узелок обладает сигнальными свойствами, общими свойствам Гензеновского узелка у эмбрионов кур, Шпемановского Организатора у амфибий и щитка (shield) у рыбок данио. Определяющей характеристикой этой структуры является то, что конгда она трансплантируется в новое эктопическое место, то ткани хозяина принуждаются к образованию вторичной оси тела. Узелок образуется на переднем конце борозды, известной как первиная полоска, водь которой клетки раслаиваются, чтобы сформировать мезодерму. Линия, образуемая первичной полоской и узелок коррелируют с будущей дорсальной срединной линией эмбриона и соответствует продольной оси билатеральной симметрии.

Показатели дефектов латеральности коррелируют с неподвижностью или отсутствием узелковых monocilia. Мутации в генах, кодирующих тяжелые цепи dynein у мышей [lrd, известные также как iv (Okada et al., 1999; Supp et al., 1997)] или у людей [Dnahc5 (Olbrich et al., 2002)] ассоциируют с зеракальной реверсией внутренних органов и у мышей это ведет к образованию неподвижных узелковых моноцилий. Сходным образом потеря Polaris [известным также как Tg737, гипоморфный аллель которого является orpk (Murcia et al., 2000)], который необходим для для обеспечения эпителиальной полярности вентральных клеток узелка, и ценленаправленное разрушение генов kinesin Kif3a или Kif3b (Marszalek et al., 1999; Nonaka et al., 1998; Takeda et al., 1999) у мышей вызывает отсутствие узелковых моноцилий, что коррелирует с LR дефектами. В элегантном исследовании Nonaka et al. визуализировали ротационные движения узелковых моноцилий, помещая флюоресцентные микросферы во внеклеточные пространства эмбрионов, поддерживаемых в культуральной среде (Nonaka et al., 1998). Они покоазали, что вихревые (vortical) движения цилий создают направленный налево ток жидкости в узелке, на основании этих данных было предположено, что ток жидкости увеличивает концентрацию неких диффундирующих детерминант на левой стороне узелка. Направление тока жидкости возможно не предопределяется направлением ротационнных движений цилий, а внутренне присущими свойствми узелка, такими как его треугольная форма или вообще наклоном цилий. Подтверждение модли тока жидкости получено в наблюдениях с экспериментальной накачкой жидкости в противоположном направлении, что сопровождалось (Nonaka et al., 2002). Этот эксперимент оказался критическим аргументом, что направленный влево поток жидкости диктует LR асиметрию скорее, чем она является результатом LR отличий (chirality) моноцилий. Важзно помнить однако, что генетические эксперименты и, что более важно, смена ассиметрии за счет накачивания жидкости, не говорят о том, как именно ток жикости инициирует асимметрию, но демонстрируют, что движения моноцилий важны. Тем не менее, использование врожденной chirality ротации моноцилий, чтобы подтвердить LR ориентацию, является концептуально удовлетворительной моделью для инициальной ступени у мышей.

Участвуют ли узелковые monocilia в детерминации ассиметрии и у др. видов? Используя антитела к ацетилированому тубулину, Essner et al. наблюдали моноцилии в вентральных узелековых клетах у эмбрионов кур, в клетках дорсального бластопора Xenopus ранней нейрулы и в дорсальных forerunner клетках в щитке рыбок данио в конце гаструляции (Рис. 4) (Essner et al., 2002). Во всех случаях, monocilia появлялись до ассиметричной экспрессии гомолога Nodal, это подтверждает, что они обладают эволюционно законсервированной функцией. Однако в противоположность ситуации у мышей, ассиметричная экспрессия др. генов у эмбрионов кур и Xenopus происходила до появления моноцилий (Levin, 1998; Levin et al., 1995) и ассиметрии в распределении мРНК H⁺/K⁺-ATPase у Xenopus или функции у эмбрионов кур. Более того, исследования по трансплантации и регенерации показали, что возникающие узелки у эмбрионов кур получают сигнал к LR асимметрии от окружающей ткани, а в отсутствие этого сигнала формируется аномальная асимметрия (Levin and Mercola, 1998a; Levin and Mercola, 1999; Pagan-Westphal and Tabin, 1998; Psychoyos and Stern, 1996; Yuan and Schoenwolf, 1998). Следовательно, хотя их присутствие и в самом деле законсервировано, но моноцилии врядли инициируют LR асимметрию у всех видов.

Gap junction communication

Фармакологические или генетические пертурбации эндогенных общений с помощью щелевых соединений у ранних эмбрионов кур или Xenopus нарушали обычную односторонюю экспрессию генов и меняли положение органов (Levin and Mercola, 1998b; Levin and Mercola, 1999). Эндогенный пространственный паттерн общений через щелевые соединения, по-видимому, является критическим, т.к. инъекции доминантно негативного коннексина в дорсальные бластомеры эмбрионов Xenopus или коннексинов дикого типа в вентральные бластомеры (но не наоборот) затрагивает латеральность; это указывает на то, что сигнал распространяется через дорсальные бластомеры и задерживается вентральной срединной линией. Эффект этих манипуляций на экспрессию ранних генов, также как и временное окно, когда эмбрионы чувствительны к лекарствам, подтверждает, что общение через щелевые соединения являются критическим для стадии ранней полоски у эмбрионов кур и между стадиями дробления и гаструлы у Xenopus (Рис. 2). Щелевые соединения состоят из 12 трансмембранных коннексинов, по 6 у каждой оппозитной клетки. Существуют многочисленные коннексины и из них Connexin43 , по-видимому, является критическим для асимметрии у эмбрионов кур: он присутствует в клетках, окружающих узелок, а его устранение с помощью антисмысовых олигонуклеотидов не смещает (unbiases) стороны (sidedness) экспрессии Sonic hedgehog (Shh) и Nodal (Levin and Mercola, 1999).

Polycystin-2

Polycystin-2, продукт гена PKD2, мутантен при аутосомно доминантном поликистозе почек и является Ca²⁺-проницаемым катионовым каналом (Cai et al., 1999; Gonzalez-Perret et al., 2001; Koulen et al., 2002). Помимо кардиальных и почечных нарушений целенаправленное разрушение PKD2 у мышей вызывает признаки LR нарушений, которые включают рандомизацию эмбрионального поварота, правый легочный isomerism (напр., левое легкое обдадает делением на доли, типичным для правого лёгкого), аномальное петлеобразование в сердце (включая dextrocardia) и дефекты образования складок кишечника (Pennekamp et al., 2002). Важно, что обычно лаво-расположенная экспрессия nodal, lefty2 и Pitx2 в передней латеральной пластинке мезодермы отсутствует у эмбрионов PKD2^–/–, это указывает на то, что polycystin-2 действует выше асимметричной экспрессии генов. Согласуется с этой возможностью и тот факт, что мРНК polycystin-2 экспрессируется строго в или вблизи узелка, хорды и донной пластинки (Pennekamp et al., 1998) (R. D. Trelles, M. Levin and M. Mercola, unpublished).

Пока неясно, как polycystin-2 влияет на латеральность. Интересно, что повышенные уровни Ca²⁺ предупреждают calmodulin от взаимодействия с INV (Morgan et al., 2002; Yasuhiko et al., 2001), белком, который, если мутантен, то вызывает у мышей обратное зеракальное расположение органов и вызывает медленный и запутанный ток жидкости поперёк узла (но не меняет направление тока на обратный). Помимо функции потенциального регулятора INV, polycystin-2 не связан с др. белками, участвующими в обеспечинии LR асиметрии. Мутации или polycystin-2 или INV однако вносят вклад и в аномальный рост почечных канальцев и протоков, что ведет к образованию кист. Моноцилии на поверхности эпителиальных клеток канальцев и протоков, как полагают, действуют как сенсоры диаметра канальцев и запускают волны внутриклеточного кальция, которые негативно регулируют клеточную пролиферацию и увеличение просвета (Praetorius and Spring, 2001; Praetorius and Spring, 2003; Schwartz et al., 1997). Идея, что сходный механизм м. оперировать и при регуляции асимметричной экспрессии генов вблиз узелка, была предложена в качестве альтернативы модели тока жидкости (Brueckner, 2001).

The H⁺/K⁺-ATPase

Биологический скрининг малых молекул, затрагивающих ионные каналы и насосы, в отношении их способности вызввать дефекты в петлеобразовании сердца, петлеобразования кишечника и положения желчного пузыря у ранних эмбрионов Xenopus eпоказало, что некоторые соединения, которые вызывают дефекты латеральности, ингибируют H⁺/K⁺-ATPase, насос, которые обменивает H⁺ и K⁺ через мембрнаы (Levin et al., 2002). Окошко чувствительности к лекарству указывает на то, что H⁺/K⁺-ATPase является самым ранним из известных компонентов детерминации LR aсимметрии и у Xenopus и у эмбрионов кур (Рис. 2). Помимо изменения положения органов, ингибирование или неправильная экспрессия H⁺/K⁺-ATPase не меняет (unbiases) асимметричной экспрессии генов, включая Shh, fgf8 (кодирующие fibroblast growth factor-8) и Wnt8c (кодирующий секретируемый белок семейства Wingless/Wnt) в узелке эмбрионов кур. Неожиданно мРНК H⁺/K⁺-ATPase α сама избирательно исчезала на левой вентральной строне у эмбрионов Xenopus на стадии 4-клеток, т.е. задолго до начала эмбриональной транскрипции (которая происходила во время перехода к средней бластуле, когда в эмбрионе оказываджось уже около 1000 клеток), это делает её самой ранней из известных асимметрических мРНК указывает на то, что формирование LR паттерна происходит во время первого клеточного цикла.

У эмбрионов кур мРНК H⁺/K⁺-ATPase впервые обнаруживается рядом с первичной полоской и разивающимся узлом, но её экспрессия симметрична. Тем не менее, imaging исследования указывают на то, что H⁺/K⁺-ATPase функционирует на правой, но не левой стороне полоски и узелка для поддержания потенциалов клеточных мембран. Домен деполяризованных клеток м.б. выявлен по повышенной флюоресценции potientiometric окраски DiBAC₄(3) на левой стороне разивающейся полоски и узелка. Воздействие BaCl₂ или omeprazole, которые влияют на ток K⁺ и активность H⁺/K⁺-ATPase, соотв., обусловливая появление зеркального домена справа. Это указывает на то, что H⁺/K⁺-ATPase обычно поддерживает отрицательный мембранный потенциал справа, это согласуется с её физиологическими свойствами. Т.о., хотя она и функционрует на правой стороне у обоих видов, но регулируется она на уровне мРНК у Xenopus и пост-транскрипционно у эмбринов кур. Несмотря на её важность у эмбрионов кур и Xenopus для предопределения ассиметрии, однако отсутствуют доказательства, указывающие на то, действует ли H⁺/K⁺ ATPase выше узелковых моноцилий, щелевых соединений или polycystin-2 или она инициирует параллельный сигнальный путь.

Epithelial structural proteins

N-cadherin и claudin также существенны для нормальной LR асимметрии. N-cadherin экспрессируется асимметрически в узелке эмбрионов кур: он экспрессируется на высоком уровне на переднем правом и заднем левом краях узелка, соответствующих асимметричной форме самого узелка (Garcia-Castro et al., 2000). Важно, что асимметрическая экспресия N-cadherin предшествует асимметрической экспрессии Shh (левая передняя часть узелка), но испытывает также влияние со стороны Shh. Добавление блокирующих антител к N-cadherin на стадии 3-4, но не позденее, влияет на морфогенез сердца и экспрессию Pitx2. Курьёзно то, что экспрессия Nodal и lefty не затрагивается; т.о., N-cadherin, по-видимому, функционирует на пути, параллельном тому, что используется этими белками. Claudins являются важными клеточными адгезивными молекулами плотных соединений, которые непосредственно участвуют в межклеточном скреплении. Избыточная экспрессия или интактного белка или C-терминально укороченной версии у Xenopus вызыввает heterotaxia и билатеральную экспрессию Nodal гомолога XNr-1 (Brizuela et al., 2001). Несмотря на то, что эти эксперименты были проделаны у разных видов, они показали важность N-cadherin и claudins для эпителиальной интеграции при нормальной детерминации LR асимметрии.

Syndecan-2

Yost и др. показали, что цитоплазматический домен heparin-sulphate proteoglycan syndecan-2 фосфорилируется в клетках анимальной шапочки (презумптивной эктодерме) справа, но не слева у эмбрионов Xenopus во время гаструляции [на ст.11 (Kramer et al., 2002)]. Фосфорилирование, как полагают, влияет на способность syndecan-2 обеспечивать формирование LR патерна в мезодерме, которая приходит в контакт с эктодермой во время гаструляции. Как syndecan-2 м. передавать сигналы мезодерме, неясно, но он м. участвовать в локализации белков, сходных с ростовыми факторами, внутри сигнального комплекса на клеточной поверхности (Bernfield et al., 1999). Идея, что синдеканы обеспечивают перенос LR информации от эктодермы к мезодерме, особенно интересна, правда возникает вопрос , оперирует ли сходный механизм в др. видах помимо Xenopus.

A model uniting monocilia, gap junction communication and polycystin-2 into a signalling pathway

Как (и в самом ли деле) эти очень разнообразные белки и структуры работают вместе, чтобы создать или распространить информацию LR асимметрии? Модель тока жидкости предполагает, что действие моноцилий запускает внеклеточные детерминанты. Др. возможность, что моноцилии инициируют сигнал, такой как волна Ca²⁺, которая распространяется через слой клеток, окружающий узелок. На Рис. 5 показано, как моноцилии, щелевые соединения и polycystin-2 м. функционировать скординировано, чтобы распространить межклеточную волну Ca²⁺. Межклеточные волны Ca²⁺ хорошо известны [напр., в эндотелиальных, глиальных и печеночных эпителиальных клетках (Sanderson, 1995)] и они м. также влиять на самую раннюю асимметричную экспрессию генов внутри и вокруг узелка эмбрионов кур, таких как Shh, fgf8 и Wnt8c [сходная модель была недавно предложена (Tabin and Vogan, 2003)]. В отдельности от вовлечения моноцилий, щелевых соединений и polycystin-2 в LR асимметрию и экспрессию вблизи узелка, получены доказательства в пользу модели при изучении аутосомно доминантного поликистоза почек, это заболевание, как известно, затрагивает каждый из этих белков и струуктур. В нрмальных почечных канальцах и протоках моноцилии локализуются на апикальной поверхности эпителиальных клеток, определяя, по-видимому, диаметр просвета путём детекции изменений динамики жидкости (Nauli et al., 2003; Praetorius and Spring, 2001; Praetorius and Spring, 2003). Изгибание моноцилий запускает приток Ca²⁺ через цилиарные или соседние каналы, это в свою очередь обусловливает высвобождение Ca²⁺ из inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins(1,4,5)P₃]-чувствительных внутриклеточных хранилищ. Сигнал распространяется как волнапо окружающим клеткам посредством диффузии вторичных мессенджеров [таких как Ins(1,4,5)P₃] через канылы щелевых соединений. Polycystin-2 ко-локализуется с моноцилиями почек (Pazour et al., 2002; Yoder et al., 2002), где он м. оказаться каналом, который позволяет вступать внеклеточному Ca²⁺. Локализация polycystin-2 однако всё ещё служит предметом спора, одни полагают. что он функционирует и как Ca²⁺ канал в цитоплазматической мембране (Hanaoka et al., 2000) и как внутриклеточный высвобождаюещий канал, чувствительный к Ins(1,4,5)P₃, на ER (Koulen et al., 2002).

При поликистозной болезни почек отсутствие или polycystin-2 или моноцилий вызывает фокальную пролиферацию эпителиальных клеток, которая в конечном итоге и даёт расширения кист. Если это приложить к детерминации LR асимметрии в узелке, то модель позволяет сделать несколько предсказаний: (1) polycystin-2-зависимая волна Ca²⁺ д.б. видимой вблизи узелка и д.б. асимметричной; (2) распространенеие сигнала Ca²⁺ должно зависеть от щелевых соединений и моноцилий; и (3) сигнал Ca²⁺ д.влиять на асимметричную экспрессию генов. Из них только моноцилии в первую очередь связаны с детерминацией асимметрии, участие остальных ещё необходимо подтвердить. Модель не предсказывает, м. ли сигнал Ca²⁺ распространяться в направлении налево, в направлении направо или в обоих направлениях. Направление распространения обеспечивает простейшую связть с экспрессией нижестоящих генов, но если это так, то что предопределяет ориентацию? Tabin and Vogan недавно предположили, что существуют два типа моноцилий в узелке мышей: один набор генерирует лево-направленный ток жидкости, а второй набор ощущает его (Tabin and Vogan, 2003). Согласно этому мнению д.б. врожденная асимметрия узелковых моноциллярных структур, генерирующая асимметрию эмбриона, это м.б. приложимо к мышам, у которых направленный налево ток жидкости явяляется самым проявлением асимметрии. Однако трудно согласовать это заключение, что врожденное свойство узелка мыши генерирует асимметрию эмбриона с наблюдениями, что развивающийся узелок эмбринов кур приобретает LR паттерн от окружающих тканей (см. выше). Поэтому разумнее предположить, по крайней мере для цыплят, что любая sidedness monocilia/polycystin-2-зависимого сигнала Ca²⁺ м.б. продиктована вышестоящим сигналом, вообще одной зависимой от H⁺/K⁺-ATPase активностью, которая поддерживает клеточный voltage потенциал на правой стороне узелка и полоски в онтогенетическом окне, который перекрывается по времени с моментом, когда выявляются моноцилии. Контроль над распространением сигнала Ca²⁺ также м. достигаться путём регуляции некоторых свойств эпителиальной структуры или физиологии, необходимых для получения или распространения вторичного мессенджера. Это м.б. связано с тем, что мРНК Cx43 экспрессируется асимметрично на правой сторолне узелка эмбрионов кур и м., следовательно, навязывать направленность, но его роль в этом процессе плохо изучена помимо наблюдаения, что антисмысловое истощение мРНК Cx43 mRNA затрагивает асимметрию экспрессии нижестоящих генов (Levin and Mercola, 1999).

Conclusions and perspectives

The past few years have seen remarkable progress towards understanding how LR asymmetry is patterned and the next few should be as impressive. Clearly, the speculative and incomplete model that associates monocilia, gap junctions and polycystin-2 into a signalling pathway needs to be evaluated and refined. It is important to learn if (and how) upstream signals, such as generated by the H⁺/K⁺-ATPase, are coupled to signalling at the node and whether such signalling operates only in chick and Xenopus but not in the mouse. Indeed, a major challenge is to resolve whether early LR patterning information is initiated and processed similarly in different species. Differences in the timing of axial patterning, early cleavage and gastrulation, and the anatomy of key signalling centers, such as the node or analogous structures, make the possibility of diverse mechanisms quite likely. Divergent chick, frog, fish and mouse evolution might have provided selective advantages that favored the orientation of LR asymmetry as early as the first cell cycle in animals such as the frog. Similarly, whether the node functions to initiate LR patterning, as monociliary motion might do in the mouse, or respond to earlier cues, as might occur in chick, could reflect divergent architectures of the node (Dathe et al., 2002), and this possibility needs to be addressed functionally. The application of recent advances in reverse genetics, such as RNAi, is certain to provide answers to these fascinating questions.

Another longstanding issue to be resolved is why nearly 100% of homozygous inv mutant mice exhibit LR inversions (Yokoyama et al., 1993). The mutation deletes nearly the entire coding region of the cytoplasmic INV protein (Mochizuki et al., 1998; Morgan et al., 1998) and, in its presumed absence, nodal fluid flow has been described as slowed, but not reversed (Okada et al., 1999), thus frustrating attempts to couple INV to monociliary function. Perhaps related, therefore, are the observations that homozygous inv mutant embryos exhibit abnormal epithelial thickening on the edges of the node (Okada et al., 1999) and develop kidney cysts resembling those in polycystic kidney disease (PKD) (Mochizuki et al., 1998; Morgan et al., 1998; Yokoyama et al., 1993), which suggests that disturbances in epithelial character might affect the ability to propagate signalling downstream of monociliary function. Nonetheless, why these alterations would lead to reversals remains puzzling.

Finally, it is important to distinguish between when LR asymmetry information is first generated and when it can be regenerated. The mammalian embryo, for instance, has a considerable ability to reconstitute axial pattern after experimental intervention, such that removal or addition of blastomeres of pre-implantation embryos can lead to perfectly normal animals. This plasticity has been misinterpreted as meaning that axial patterning occurs relatively later than in more `mosaic' embryos, such as those of the frog, as a result of interactions between blastomeres. Careful studies, however, have indicated that the animal-vegetal axis in the fertilized mouse egg, defined by the location of the polar body, correlates with the future long axis of bilateral symmetry in the blastocyst and, if left undisturbed, presages the anteroposterior body axis of the fetus (Gardner, 2001; Johnson, 2001). Any LR information laid down this early and perturbed experimentally might also be reconstituted during subsequent development. An example of this plasticity is the apparent de novo generation of asymmetry in Xenopus embryos by manipulations that act at multicellular stages. Fertilized Xenopus embryos normally acquire LR asymmetry by the two- to four-cell stage, as revealed by the selective depletion of H⁺/K⁺-ATPase α mRNA from the ventral left blastomere (Levin et al., 2002). Yet previous studies showed that forced expression of the transcription factor Siamois (which mimics endogenous dorsal Siamois after the 1000 cell stage) induces secondary body axes on the ventral side of the embryo that are oriented ventral to ventral with respect the primary axis (belly-to-belly twins) and that these secondary axes can have normal LR asymmetry (Nascone and Mercola, 1997). The observation that manipulated embryos can bootstrap LR information well after the initial orientation event normally occurs suggests that multiple mechanisms might exist to discriminate left from right in the early embryo.

Left-right asymmetry: Nodal pointsMark Mercola (mmercola@burnham.org)Journal of Cell Science 116, No 16, 3251-3257 (2003)

Left-right asymmetry: Nodal points
Mark Mercola (mmercola@burnham.org)
Journal of Cell Science 116, No 16, 3251-3257 (2003)