"The pattern which connects is a metapattern, a pattern of patterns." Gregory Bateson

Развивающееся сердце является сильно модифицированным мышечным сосудом. Раздельные, но анатомически слитые насосы, обслуживающие общий и легочный круги кровообращения, являются интегральными частями этой формы. Его стуктура и функция базируется на интегральном развитии многочисленных модулей, включая камеры (предсердия и желудочки), магистральные сосуды,клапаны, коронарное кровообращение и специализированную проводящую систему (Box 1). У людей молекулярные и мофологические события образования сердца, очевидно, чувствительны к генетическим нарушениям и врожденные пороки сердца встречаются в ~1% живорожденных.

Heart morphogenesis: an overview

Образование сердца у позвоночных проходит несколько хорошо известных превращений (Box 2). У млекопитающих клетки предшественники сердца м.б. распознаны морфологически в виде отдельной популяции в кранио-латеральной мезодерме на поздней ст. GASTRULATION. "nb клеЭти принимают форму полумесяца, распространяющегося латерально почти до соединения между эмбриональной и внеэмбриональными областями (Рис. 1a; Box 2a). Линейная сердечная трубка, которая постепенно формируется (Box 2c,d) является временной структурой, которая состоит из внутренней эндотелиальной трубки, окруженной миокардиальным слоем. Различные полости и сужения, которые присутствуют в линейной сердечной трубке, которые уже отпечатались на ее структуре, невольно предопределют события формирования паттерна. Даже до того как образование сердечной трубки будет закончено каудально, начинается удлиннение сердца, чтобы принять (adopt) форму правосторонней спирали в ходе процесса образования кардиальной петли (looping) (Box 2e,f). Во время looping будущие желудочки становятся различимыми и расширяются (balloon outwards), a атриальная область и системные венозные притоки (tributaries) смещаются дорсально и краниально (Box 2e,f); это приводит к расположению примитивных камер, необходимому для их дальнейшей интеграции (Box 2g,h). Предшественники трехстворчатого и митрального клапанов закладываются во время петлеобразования (looping). Клапаны образуются на уровне атриовентрикулярного канла (Box 2) fиз клеток эндокардиального слоя сердца, которые мигрируют и пролиферируют, чтобы сформировать оппозитные тканевые массы, называемые эндокардиальными подушками (cushions) (Box 2f). Эндокардиальные подушки формируются также в области оттока сердца (Box 2f), давая аортальные и pulmonary клапаны. NEURAL CREST CELLS, которые возникают в заднем мозге, мигрируют в подушки оттока и участвуют в их разделении. Наружный слой сердца (эпикард), коронарное кровообращение (Box 1a) и интерстициальные фибробласты сердца происходят из мезенхимной популяции, расположенной в основании развивающегося сердца из т.наз. про-эпикардиального органа.

Shaping the heart precursor zone

Пространственные координаты клеток предшественников сердца у эмбрионов до гаструляции были картированы у нескольких позвоночных. Во время гаструляции у амниот предшественники сердца движутся через область NODE AND ORGANIZER и PRIMITIVE STREAK перемещаясь латеральными миграторными путями в направлении краниальной и краниолатеральных частей эмбриона, чтобы сформировать кардиальный полумесяц (crescent), который начинает экспресировать кардиальные транскрипционные факторы (Рис. 1a,b; Box 2a,b). Сам процесс гаструляции м.б. относительно неоязательным для предопределения судьбы кардиальных клеток. Напр., клетки мышинного EPIBLAST м. дифференцироваться в кардиомиоциты, если трансплантированы непосредственно в сердце-формирующую область пост-гаструляционных эмбрионов, а клетки из кардиального полумесяца, перенесенные обратно в эпибласт, будут ре-гаструлировать и вносить вклад в разыне клоны, включая и сердце. Однако, такие эксперименты выявляют высокую пластичность ранних мезодермальных клеток, при помещении их в новую среду, отличной от им предназначенной. Предопределение сердечных клонов прогрессивное, пространственно сложное и сильно зависит от участия паттерн-формирующих процессов и динамических движений клеток при гаструляции. Гаструляция смещает сердечные мезодермальные клетки в др. эмбриональные ниши, из которых они м.б. использованы в разное время и разными способами для внесения в структуры сердца.

У большинства позвоночных клетки предшественники сердца расположены рядом с предшественниками головы. У лягушек и млекопитающих тканевые слои, которые ответственны за индукцию сердца и головы топологически отличны, но скорее всего функционально аналогичны. Развитие головы нуждается, чтобы передача сигналов с помощью bone morphogenetic proteins (BMPs), Wnt и Nodal лигандов была блокирована и это достигается специфическими ингибиторами во внеклеточной среде, которые секретируются индуцирующими тканями. Напротив, сердечные клоны индуцируются на латеральных краях зоны предшественников головы, где передач сигналов Wnt все еще ингибирована, но передача сигналов BMP уже поддерживается (Рис. 2). Энтодерма, которая непосредственно контактирует с кардиальной мезодермой, привлекает внимание как сердце-индуцирующая ткань у определенных видов и, в самом деле, члены семейства BMP экспрессируются в энтодерме, а также в соседней эктодерме и во внеэмбриональных тканях. Выявлена ключевая роль передачи сигналов BMP в спецификации и/или поддержании миокардиального клона. Более того, BMP-рецепторами регулируемые транскрипционные факторы Smad family, по-видимому, непосредственно активируют гены, которые кодируют кардиальные транскрипционные факторы. В мультипотентной линии клеток P19, которая происходит из мышиной эмбриональной карциномы, dimethylsulphoxide-индуцированный кардиогенез обеспечивается BMP и BMP-регулируемыми Smads, и с помощью basic-leucine-zipper (bZIP) Smad-взаимодействующего белка, activating transcription factor 2 (Atf2), который м.б. фосфорилирован и активирован с помощью mitogen-activated protein kinase kinase kinase, Tak1. Путь Tak1/Atf2 одни из потенциальных авеню для интеграции BMP с др. сигнальными импульсами (inputs). Одни из таких импульсов м.исходить из fibroblast growth factor Fgf8, который экспрессируется в энтодерме и, по-видимому, индуцируется с помощью BMPs. Fgf8 и BMPs необходимы для индукции кардиогенеза. Ингибиторы Wnt из семейств Frizzled-like и Dickkopf также экспрессируются в энтодерме, которая примыкает (juxtaposed) к сердечной мезодерме, и в ткани nodal/organizer (Рис. 2). Хотя ингибиторы Wnt необходимы для индукции сердца, но пока неясно, могут ли они действовать непосредственно на кардиальную мезодерму или они действуют косвенно, наделяя краниальными характеристиками энтодерму. Однако кардиомиогенная программа м.б. активирована и в задней некардиальной мезодермеэмбрионов кур и лягушек в присутствии и BMP и Wnt ингибитора; у лягушек таки условия м. приводить к формированию эктопической сокращающейся сердечной трубки, которая выстлана эндотелиальными клетками.

Кардиальный полумесяц у амниот принимает свою форму не только под действием позитивных влияний, которые обеспечиваются BMPs, Fgf8 и Wnt антогонистами, но и негативными влияниями со стороны Wnts, которые экспрессируются в нейральной трубке, и от ингибиторов передачи сигналов BMP, которые экспрессируются в аксиальных тканях (Рис. 2). BMPs также м. действовать концентрационно-зависимым способом, чтобы индуцировать илирепрессировать кардиогенез. Очень возможно, что баланс Wnts и Wnt антогонистов м.б. критическим для предопределения судьбы клеток. В ответ на индуктивные сигналы кардиальный полумесяц активирует несколько транскрипционных регуляторов кардиальной программы - включая Gata4/Gata5/Gata6, Nkx2-5 (NK2 transcription-factor related, locus 5), myocyte enhancer factor (Mef2b/Mef2c), Hand1/Hand2 (heart and neural crest derivatives expressed transcript 1 or 2) and T-box 5/20 (Tbx5/Tbx20) — и устанавливается позитивная кардиальная перекрестная регуляторная сеть. Некоторые исследования показывают, что необходимы сигнальные импульсы в дополнение к BMPs для собственно экспрессии этих генов транскрипционных факторов. Напр., экспрессия Nkx2-5, по-видимому, нуждается в некоторых, различающихся по времени сигналах. У Xenopus, блокирование BMP-обеспечиваемого кардиогенеза за счет избыточной экспрессии доминантно-негативных форм BMP рецепторов, блокирует только поддержание, но не индукцию экспрессии Nkx2-5. Напротив, у мышей, на ранней, но не на поздней фазе экспрессия Nkx2-5 ингибируется у эмбрионов, мутантных по гену Smoothened (Smo), который кодирует связанные с мембраной сигнальные белки Hedgehog-related лигандов. Это указывает на то, что передача сигналов Hedgehog м.б. связана с инициацией кардиогенной программы у млекопитающих. Один Hedgehog лиганд Indian hedgehog экспрессируется во время гаструляции в энтодермальных слоях, которые контактируют с кардиальной мезодермой. Indian hedgehog м. также индуцировать экспрессию гена Bmp4 и это согласуется выше описанной ролью гена на кардиогенном пути.

Early lineage decisions

Как только возникает зона кардиальных предшественников, то образуется внутриэмбриональный целом — полость, которая подразделяет предшественники на сердечную мезодерму вентрально и перикардиальную мезодерму дорсально (Рис. 1c). Примерно в это же время происходит дальнейшее клональное расщепление в кардиальном мезодермальном слое, которое отделяет миокард — мышечный слой сердца — от эндокарда, его эндотелиальной выстилки. Эндокардиальные клетки впервые появляются между миокардиальным и эндокардиальным слоями (Рис. 1b,c) и, у эмбрионов кур, они экспрессируют миокардиальные и эндокардиальные маркеры. Подлежащая энтодерма необходима для их образования. Это указывает на то, что клетки кардиального полумесяца м.б. общими предшественниками для миокардиальных, перикардиальных и эндокардиальных клеток сердца. В самом деле, клональный анализ судьбы клеток в кардиальном полумесяце мышей с использованием Cre/Lox системы показал, что все три типа клеток, в одной и той же точке, активируются миогенным транскрипционным фактором Nkx2-5 (Рис. 1c), который первым экспрессируется в кардиальном полумесяце до образования внутри-эмбрионального целома. Однако отслеживание судьбы одиночных клеток у эмбрионов кур не выявило общих для миокардиальных и эндокардиальных клеток предшественника. Когда метили эндотелиальные предшественники, то они давали только эндотелиальное потомство, указывая тем самым, что эндокард м.б. уже специфицирован в поле сердца. Возможным объяснением этой кажущейся дихотомии является то, что эндотелий имеет др. происхождение, а исследования эмбрионов птиц показывают, что определенная популяция эндотелиальных предшественников мигрирует в формирующуюся сердечную трубку.

Migration of heart precursors

Две волны миграции клеток привносят кардиальных предшественников в вентральную срединную линию, где формируется сердечная трубка. Первая волна, составная гаструляции, перемещает (mobilizes) сердечную и головную мезодерму из узла/организатора (node/organizer) и первичной полоски в направлении кардиальных областей, чтобы сформировать кардиальный полумесяц. Это событие нуждается в Fgf8, а также в basic helix–loop–helix (bHLH) транскрипционных факторах Mesp1 и Mesp2 (mesoderm posterior 1 and 2). Fgf4 подавляется у мышей, которые мутантны по Mesp1 и Mesp2 генам, указывая тем самым, что Fgf4 м.б. их общей мишенью. Более того, FGF рецептор, Fgfr1, играет ключевую роль в миграции во время гаструляции. Передача сигналов FGF через эти рецепторы активирует ген транскрипционного фактора Snail, который затем индуцирует эпителиально-мезенхимный переход клет ок эпибласта за счет репрессии экспрессии гена, кодирующего кальций-зависимую молекулу клеточной адгезии E-cadherin. Это м.б. законсервированным механизмом клеточной миграции, т.к. FGF рецептор Heartless необходим для миграции сердечной мезодермы у мух и FGFs широко используются в миграции клеток в др. развивающихся системах. Вторая волна миграции переносит возникшие кардиальные клетки-предшественники вентрально для образования сердечной трубки. Эти движения зависят от градированного распределения фибронектина вдоль кранио-каудальной оси и этот градиент фибронектина закрепляется во внеклеточном матриксе на мезодермально-энтодермальном интерфейсе (interface). Блокирование взаимодействия между фибронектином и интегрином у эмбрионов птиц — напр., антителами — или у мышей с помощью мутаций гена фибронектина, ведет к полной или частичной неспособности кардиальных примордиев сливаться (cardia bifida). Более тяжелые проявления обнаруживаются у некоторых Fn1 мутантов мыши на генетическом фоне инбредной линии 129Sv, у которых кардиальные клетки достигают краниальной области, формируют полумесяц и нормально экспрессируют гены миозина, но никогда не мигрируют вентрально для образования сердечной трубки. Как градиент фибронектина устанавливается неизвестно, хотя он м.б. сформирован нижестоящим морфогеном и/или градиентами транскрипционных факторов, которые возникают в формирующейся сердечной трубке.

Правильная дифференцировка эмбриональной энтодермы обязательна для второй фазы миграции и некоторые мутации, затрагивающие энтодерму у эмбрионов рыбок данио и мышей частично нарушают этот процесс, приводя к различным степеням тяжести cardia bifida. У мышей Gata4 и рыбок данио Gata5 , напр., кодируют транскрипционные факторы семейства цинковых пальчиков, которые необходимы в энтодерме для миграции клеток-предшественников сердца к срединной линии, а также для транскрипции хозяйских кардиальных генов. Влияние энтодермы м.б. связано с общим отсутствием вентрального морфогенеза и формирования кармана передней кишки (foregut-pocket) и/или созревания энтодермы, которая является критическим источником кардио-индуцирующих и миграторных факторов. Роль Gata4 в энтодерме м. существенно отличаться от ее роли в мезодерме, из-за взаимодействия между Gata4 и кофактором, Fog2, необходимым только в мезодерме. Мутация рыбок данио miles apart, которая также обусловливает cardia bifida, картирована в гене, кодирующем G-protein-coupled рецептор для sphingosine-1-phosphate, биоактивного липида. Члены этого семейства рецепторов, как известно, обеспечивают хемотаксис человеческих эндотелиальных и аортальных гладкомышечных клеток, а также во многих др. биологических процессах. Miles apart необходим и для др. клеток помимо кардиальных предшественников, указывая тем самым, что его генный продукт, по-видимому, непрямо усиливает способность сердечных клеток к миграции.

The primary heart field

Во время миграции, предшественники сердца уже существуют в морфорегуляторном поле. Выявлены новые важные аспекты развития сердца. Морфорегуляторное поле описывается как динамическая область с онтогенетическим потенциалом ("a dynamic region of developmental potency") для формирования органа или структуры. Поле обычно определяется экспреиментально путем выявления потенциала малых тканевых эксплантатов (explants), взятых из самой области предшественников или ее окружения, чтобы дифференцировать их в определенные структуры in vitro. Ключевым является то, что поля часто больше, чем область, которая предназначена стать специфической тканью и являются регулятивными, в том смысле, что клетки поля, которые лежат вне действительной зоны предшественников м. компенсировать полное удаление или повреждение этих предшественников. У Xenopus, регулятивное поле сердца занимает область кранио-вентральной и латеральной мезодермы, которая очень напоминает домен экспрессии Nkx2-5. Экспланты из этой области обладают сердце-формирующим потенциалом, однако потенция постепенно ограничивается областью, соответствующей в точности этим предшественникам, которые будут формировать сердце при нормальном развитии, а ограничение происходит в точке, которая находится ниже экспрессии Nkx2-5. Клетки поля сердца, которые лежат вне популяции дефинитивных предшественников, располагаются более латерально и обычно вносят вклад в дорсальный мезокардий (mesocardium) и дорсальную перикардиальную мезодерму (Box 2d). Имеются эпителиальный слой, который первоначально непрерывен с миокардиальным слоем сердечной трубки на ее дорсальной стороне, где он связан с вентральной частью перденей кишки. Время миогенной дифференцировки и ограничение миогенного потенциала в латеральных (регуляторных) клетках поля, по-видимому, обеспечивается передачей сигналов Notch, которые влияют на принятие решения о судьбе клеток у многих организмов. Интересно, что Serrate (который кодирует один из Notch лигандов) репрессирован в миогенных клетках сердца, т.к. они дифференцируются благодаря петле негативной обратной связи, которая актививруется в ответ на передачу сигналов Serrate/Notch. Итак, ткане-специфическая интерпретация передаваемых сигналов Notch является центральной для выделения миогенного и не-миогенного доменов.

The secondary heart field

Регулятивные поля сердца у амниот не определены. У эмбрионов кур, напр., удаление части или всего поля сердца вызывает соотв. дефекты в формирующемся сердце. Даже головная мезодерма, которая м. автономно дифференцироваться в сердечную мышцу in vitro, когда удаляется из ингибирующей ткани, неспособна к регуляции in vivo. Однако, дорсальный мезокардий (mesocardium) и перикардиальная мезодерма — ткани, являющиеся регуляторными для сердца лягушек - экспрессируют гены кардиальных транскрипционных факторов Nkx2-5 и Gata4, указывая тем самым, что они м. составлять персистирующее (или вторичное) поле сердца. В самом деле, клетки из этой области эмбриона, как теперь известно, вносят вклад в формирование тракта оттока, определенного кардиального сегмента, который добавляется к сердцу спустя некоторое время после того как будут сформированы области желудочков и притока. Было установлено, что клетки, которые являются дорсальными по отношению к сердцу — которые должны включать потенциально дорсальный мезокардий и перикард — а также к мезенхиме BRANCHIAL-ARCH, мигрируют в сердце; они используются для строительства тракта оттока и возможно у мышей правого желудочка (Рис. 3). Использование эксплантатов показало, что близость дорсальных клеток к ткани правого желудочка демаскирует их латентную миогенную потенцию. Клетки вторичного поля сердца экспрессируют Fgf8 и Fgf10, которые м. повлиять на их миграторыне совйства и/или поддержание миогенного потенциала. Эти исследования выявили происхождение полного сегмента сердца и путь, с помощью которого клетки в поле м.б. поддерживаться для использования в позднем развитии. Дефекты этого процесса м. лежать в основе обнаружимых уродств тракта оттока у эмбрионов мыши, у которых отсутствуют ключевые кардиальные транкрипционные факторы, такие как Nkx2-5, Hand1 и Mef2c, эти аномалии тракта оттока в популяциях людей составляют треть от врожденных пороков сердца. Эти данные объясняют также время задержки образования тракта оттока и м. иметь отношение, частично, к видимым различиям в способе транскрипционной регуляции некоторых индивидуальных генов в разных компартментах сердца. Природа взаимодействий между клетками вторичного поля сердца и мигрирующими клетками нейрального гребня, которые заполняют тракт оттока и участвуют критически в его подразделении на на аортальную и пульмональную артерии, теперь активно исследуется. Дорсальная мезенхима вносит также вклад в формирование предсердий, указывая тем самым, что клетки вторичного поля сердца м. дополнять первичный миокард с обоих полюсов развивающегося сердца.

Heart patterning in the cardiac crescent

Кардиальный полумесяц дает несколько популяций прдешественников, каждый из которых предопределяет специфическую ткань и клеточное поведени. Эти подразделения маркируют начало формирования паттерна сердечной трубки и оказывают выраженное влияние на форму и функцию сердца. Региональные паттерны экспресии генов, обнаруживаемые в кардиальном полумесяце, проливают свет на эту точку зрения. У мышей гены Fgf8 и Fgf10, а также Fgf10-сцепленный LacZ репортерный трансген, экспрессируются в определенном домене, который соответствует клеткам миокардиальных предшественников, которые локализуются наиболее близко к срединной линии (Рис. 3, самая левая панель). Этот домен соотвествует предшественникам дорсального мезокардия и перикардиальной мезодермы — клеткам, которые составляют часть вторичного поля сердца. Итак, возможно, что клетки вторичного поля сердца уже выделены и обладают определенным клеточным поведением на стадии кардиального серпа. Др. трансген мыши — один из тех, что контролируется специфическим энхансером гена GATA6 кур — экспрессируется в клетках кардиального серпа, которые наиболее удалены от срединной линии (Рис. 4a,b). В позднем развитии, экспрессия этого трансгена преимущественно маркирует клетки, которые дифференцируются в проводящую систему сердца, которая ответственна за соотв. распределение электрических импульсов во время сердцебиений (Рис. 4c). Итак, уникальные регуляторные домены уже существуют в кардиальном полумесяце и подтверждаеют мнение, что это происходит в тот период, когда закладывается паттерн кардиальных элементов.

Heart-tube patterning: the cranio-caudal axis

Регионализация в кардиальном полумесяце м. также обнаруживаться вдольего кранио-каудальной оси. Региональные различия м. б. продемонстрированы у эмбрионов кур в виде градиента скорости, с которой сластеры миоцитов контрактируют после эксплантации из различных позиций вдоль поля сердца. Это функциональное поведение м. иметь отношение к градиентам opposing экспрессии Atp2a2 (ATPase, Ca²⁺ transporting, cardiac muscle, slow twitch 2) и Pln (phospholamban) — генов, которые кодируют белки, что регулируют ток внутриклеточного кальция и время возбуждения и контракции. Более того, только миоциты, которые эксплантируются из каудальной области поля сердца, активируют миозиновый ген, который обчычно экспрессируется только в каудальных (синоатриальных) миоцитах сердечной трубки.

Известно, что избыток ретиноидов вызывает ряд врожденных дефектов у позвоночных. Более того, модели недостаточности витамина А у птиц и крыс, а также одиночные и множественные нокауты у мышей по ядерным генам retinoic acid receptor (RAR) и retinoid-X receptor (RXR), показывают, что ретиноиды функционируют во многих аспектах кардиального развития. Наследуемые кранио-каудальные отличия в кардиальном серпе чувствительны к пертурбациям с помощью ретиноевой кислоты (RA), а у мышей, TERATOGENIC эффекты от избытка RA на сердце, эффективны только во время ст. кардиального полумесяца. Недавние исследования подтвердили ключевую роль передачи сигналов RA на самые ранние стадии формирования паттерна сердца. Распределение retinaldehyde dehydrogenase type 2 (RALDH2), которая ответственна за действительно весь эмбриональный синтез RA и за паттерн экспрессии чувствительных к ретиноидам трансгенов, показывает, что и синтез и активность RA ограничены синоатриальной областью поля сердца и формирующегося трубчатого сердца (Рис. 5a,b). Более того, сердца от витамин А-дефицитных эмбрионов перепела закрыты с кауддальной стороны и, по-видимому, лишены синоатриальной ткани, включает его венозные притоки, которые позднее дают вклад в полые вены. Эмбрионы мыши, обработанные ингибитором синтеза RA или антогонистом pan-RAR также лишены синоатриальной ткани. Специфичность этих воздействий подтверждена генетически, на эмбрионах мышей, которые имеют мутации в гене RALDH2 (Aldh1a7), обнаруживая отсутствие петлеобразования сердца, которое лишено определенной синоатриальной области (Рис. 5c,d).

Правильное синоатриальное развитие нуждается также в Tbx5, гене T-box семейства транкрипционных факторов, которые мутантны при Holt–Oram syndrome у людей. Tbx5 экспрессируется градировано вдоль кранио-каудальной оси формирующегося сердца, с наивысшими уровнями в каудальной области. Т.к. Tbx5 индуцируется RA и его градированное равпределение в сердце сравнивается у Aldh1a7-мутантных эмбрионов, то передача сигналов RA м. играть роль в установлении его паттерна. Сердце и др. ткани, как известно, чрезвычайно чувствительны к изменениям в дозе T-box генов, а градированные паттерны экспрессии, как это видно на примере Tbx5, м.б. критическими для формирования паттерна. В самом деле, у гомозиготных Tbx5-нокаутных мышей, синоатриальное развитие сильно укорочено, а трансгенная избыточная экспрессия Tbx5 в желудочках ведет к аномальной морфологии желудочков и подавлению специфичных для желудочков генов. Эти последние эффекты м.б. мягким примером более сильно выраженного фенотипа, обнаруживаемого у эмбрионов мышей и кур, которые обрабатывались избытком RA на ст. кардиального серпа, на которой предшественникаи сердцабыли неправильно слиты и большинство тканей сердца обнаруживало атриальные характеристики (Рис. 5e,f).

События формирования паттерна в кардиальном серпе очень динамичы и связаны как с пространственными, так и временными миграторными событиями гаструляции. Аномалии во времени онтогенетических событий часто игнорируются как возсожная причина врожденных пороков сердца.

Establishing boundaries on the cranio-caudal axis

Сердце часто рассматривается как сегментированная структура, хотя имеется мало доказательств METAMERIC строения. Поэтому можно ли или как имеющую онтогенетические границы, и если так, то как они формируются и ка связаны с передачей сигналов ретиноидов? Ген млекопитающих Hey кодирует члена bHLH сверхсемейства транскрипционных факторов, которые гомологичны hairy/enhancer of split генам Drosophila, которые, как известно, действуют на Delta/Notch путь. Hey1 и Hey2 находятся также среди тех генов, которые регионально экспрессируются в предшественниках сердца во время или перед слиянием сердечной трубки. На поздних стадиях, экспрессияHey1 ограничивается предсердиями и трактом оттока, а Hey2 желудочками — комплементарность, которая обнаружи ватеся и в др. тканях. Белки Heys, подобно их Drosophila родственникам, которые активны на пути Notch,по-видимому, являются транскрипционными репрессорами. Более того, Hey1 и Hey2 , как было показано, действуют ниже Delta/Notch signalling во время SOMITOGENESIS и in vitro. Hey белки м. гетеродимеризоваться др. с др., а также с определенными bHLH белками, включая Hand1 и Hand2,которые м. также действовать как транскрипционные репрессоры. Генетические исследования на мышах и рыбках данио показали, что Hand гены существенны для спецификации и/или жизнеспособности кардиомиоцитов, котиорые ассоциируют со специфическими камерами. В самом деле, у эмбрионов мыши, которые являются двойными мутантами по Nkx2-5 и Hand2, у которых Hand1 (и Hey2) также подавлены, и левый и правый желудочки пордвергаются апоптозу, как только они специфицируются. Система передачи сигналов Notch м. амплифицировать и стабилизировать различия между клетками — даже небольшие различия между во всем остальном идентичными клетками — формируя в результате границу, дивергенцию судьбы клеток и влияя на клеточный цикл. Hey гены м. работать таким образом в сердце, напр., создавая стабильные различия между миокардом разных камер или создавая границы между ними. Врожденные пороки сердца, обнаруживаемые у людей, которые несут мутации в Jagged1, который кодирует один из Notch лигандов, указывая на вовлечение как вышестоящих, так и нижестоящих элементов пути Notch в сердце.

Chamber formation

У амниот показано, что специализированная форма миокарда (работающий миокард камер сердца) первоначально специфицируется в определенной зоне на наружной кривизне looping сердечной трубки. Эти данные указывают на то, что работающий миокард м. формироваться в ответ на интеграцию кранио-каудальной и дорсо-вентральной (D/V) patterning информации формирующегося сердца.

Одним из принципиальных морфологических проявлений спецификации желудочков на наружной кривизне является появление трабекулярного миокарда (trabeculae; Box 2f,h), губко-образного внутреннго мышечного слоя, который менее пролиферативен и более дифференцирован, чем наружный слой. Во время онтогенеза очень возможно, что трабекулы генерируют большую часть контрактильных сил сердца и служат также для быстрого распределения электрических импульсов, индуцирующих контракцию желудочков целиком. У кур ориентация трабекул чрезвычайно упорядочена и это интригующее свойство архитектуры сердца эксплуатируется. Некоторые гены, экспрессируемые на наружной кривизне в доменах, которые прекрывают, по крайней мере, частично трабекулярную зону. Сюда входят гены, которые кодируют транскрипционные регуляторы, такие как Hand1, Cited1 and Irx1/Irx3/Irx5 (Iroquois-related homeobox), вазоактивный гормон atrial natriuretic factor (Anf), проводящие белки из семейства коннексинов и мышце-специфические цитосклетные белки Chisel. Пока невозможно определить наружную кривизну и субдомены на ней как отдельные транкрипционные компартменты сердца. Более того, показано, что миокард камер формируется как специализация более примитивных форм мышц, которые присутствуют в первичной трубке сердца и активируют проводящие белки и цитоскелетные элементы, которые соответствуют нуждам их специализированных функций.

Как эти паттерны возникают? Сигнальная система neuregulin/Erbb существенна для формирования трабекул. Neuregulin1 экспрессируется в эндокарде и передает сигналы своим связанным с мембранами tyrosine kinase co-receptors Erbb2 и Erbb4, которые экспрессируются в миокарде. Эндокард отделен от миокарда комплексом протеогликанов и матриксом, богатым glycosamino-glycan, называемым кардиальным гелем, и эндокард осуществляет контакты с миокардом в многочисленных местах посредством проникающих отростков. Neuregulin1 signalling м. происходить в этих точках контактов и/или через матрикс кардиального геля посредством диффузионных изоформ. Почему трабекулы образуются только на наружной кривизне сердца, по-видимому, является частью вопроса, как специфйицируется рабочий миокард. Эта пространственная спецификация, по-видимому, не управляется локальной экспрессией neuregulin co-receptor Erbb2, т.к. глобальная экспрессия гена Erbb2 в миокарде посредством целенаправленной интеграции в локус Nkx2-5, по-видимому, не распростраяется на зону работающего миокарда. Ассоциация и функциональное купирование (coupling) Erbb2 с CD44, мембранным сигнальным белком, который использует компоненты кардиального геля, такие как hyaluronan в качестве лигандов, указывает на то, что элементы матрикса являются важным аспектом спецификации наружной кривизны (curvature). В самом деле, трабекулы полностью теряются у эмбрионов мыши, которые мутантны по гену hyaluronan synthetase-2 (Has2). Интересно, что serotonin 2B receptor также необходим для собственно роста и трабекуляции желудочков и для нормальных уровеней экспрессии Erbb2. Этот рецептор действует посредством гетеромерной GTPases Gα_q и Gα₁₁, а эмбрионы, которые являются двойными мутантами по этим кодирующим генам также обнаруживают вентрикулярные дефекты. Изучение эпидермального фактора роста (EGF) receptor, др. члена семейства Erbb, указывает на то, что внутриклеточный домен Erbb рецепторов м. действовать как интегрирующая платформа для предачи сигналов через различные типы лиганд/рецептор, включая G-protein-coupled рецепторы, которые активируют mitogen-activated protein kinase путь. Понять эти взаимодействия необходимо для полного понимания процесса образования камер.

Некоторые транскрипционые факторы участвуют в формировании зоны наружной кривизны, которая становится работающим миокардом. Holt–Oram T-box factor, Tbx5, взаимодействует непосредственно с гомеодоменом фактора Nkx2-5 и, in vitro, эти факторы кооперативно активируют экспрессию генов Anf (Nppa) и connexin 40 (Gja5) — маркеров работающего миокарда в эмбрионе. И Tbx5 и Nkx2-5 также участвуют в формировании работающего миокарда. У гомозиготных нулевых Nkx2-5 мутантов, все тестированные маркеры наружной кривизны, включая Nppa, Cited1, Chisel и Hand1 отсутствуют или сильно подавлены. Мутантные сердца недоразвиты и сохраняют молекулярные признаки, которые сходны с теми, что встречаются в первичном трубчатом сердце. Tbx5-мутантные сердца также слабо looped и гипопластичны, а экспрессия гена Nppa отсутствует. Установлено, что мыши, у которых путь передачи сигналов neuregulin1 поддерживает экспрессию Nkx2-5 и Tbx5, а также многочисленные др. транскрипционные факторы и стоящие ниже гены в развивающемся левом и возможно правом желудочках. Рудиментарный фенотип сердца обнаружен также у эмбрионов мыши, у которых отсутствует forkhead box H1a (Foxh1a), ген, который кодирует Fast2, winged helix ДНК-связывающий и Smad-взаимодействующий фактор, который действует ниже в сигнальном пути transforming growth factor-β (Tgf-β. Fast2 выполняет ключевую роль в формировании мезодермы и формировании кранио-каудального паттерна во время гаструляции и многие мутанты не образуют сердца вообще. Однако, те, которые формируют сердце, неспособны экспрессировать маркеры работающего миокарда это верно и для кардиомиоцитов, которые получаются в результате in vitro дифференциации гомозиготных мутантных эмбриональных стволовых клеток.

Подтверждена важная репрессивная роль T-box фактора Tbx2 в предопределении доменов экспрессии Nppa в работающем миокарде. Tbx2 экспрессируется в миокарде формирующегося сердца, паттерн которой всегда реципрокный паттернц экспрессии Nppa. Более того, Tbx2 м. формировать репрессивный комплекс с Nkx2-5 на проксимальной части промотора Nppa, котоорый конкурирует с Tbx5–Nkx2-5 комплексом, который позитивно регулирует экспрессию Nppa. Итак, интеграция позитивных и негативных modalities Nkx2-5 и Tbx путей позволяет предопределять работающий миокард в раннем сердце. Как передача сигналов через Fast2 интегрируется с этими путями пока неизвестно.

The left–right frontier

Одним из наиболее неприятных аспектов биологии сердца является вклад эмбриональной лево-правосторонней (L/R) осевой системы формирования паттерна и морфогенеза сердца. Эта система предопределяет латеральную асимметрию тела и его органов. Ее точный вклад в морфогенез сердца охарактеризован плохо; однако, м. говорить о путях, детерминирующих L/R различия в морфологии предсердий и их венозных притоков, и не совсем уверенно о направлении и качестве вентрикулярного изгибания. Спектр причудливых аномалий возникает, если асимметрия нарушена. Это и зеркальное отражение асимметрии тела (situs inversus) и isomerisms, при котором и левая и правая части органа, такого как сердце и легкие, развиваются целиком с левыми или правыми характеристиками. В сердце, только атриальные придатки (Box 1) м. иметь действительный изомеризм, т.к. они происходят из бевого и правого кардиального примордия, соотв. Левый (systemic) и правый (pulmonary)желудочки возникают при развитии в кранио-каудальном направлении (arrangement) и строятся как из левой, так и правой популяций кардиальных предшественников. Само по себе образование петли (looping) помещает желудочки в L/R конфигурацию. Эти фундаментальные различия в развитии L/R предсердиев и желудочков нуждаются в дальнейшем исследовании.

C момента первого описания L/R молекулярной асимметрии в peri-node/organizer области гаструлы эмбрионов кур, идет быстрый прогресс по выявлению молекулярный путей, поддерживающих L/R асимметрию тела. У всех исследованных животных моделей один или более генов кодируют член семейства Tgf-β, Nodal, который экспрессируется в левой LATERAL-PLATE MESODERM (LPM), сдвигая на левцю сторону поле сердца(Рис. 6a). Nodal рассматривается как принципиальный трансдуктор асимметрии (laterality) информации на и в левосторонние предшественники висцеральных органов, при этом выявляютмяч тонкие регуляторные влияния на систему Nodal. Напр., передача сигналов Nodal непосредственно индуцирует гены, которые кодируют Nodal ингибирующие белки Lefty1 и Lefty2. Nodal м. диффундировать на расстояние нескольких диаметров клеток в эмбрионах, хотя быстрая индукция Lefty белков ограничивает ранг и продолжительность перадачи его сигналов. В формирующемся сердце Nodal и Lefty2 экспрессируются вдоль левого дорсального мезокардия и перикардиальной мезодермы, вторгаясь в миокард только в синоатриальной области.

Laterality and the Pitx2 gene. Ключевой мишенью для передачи сигнала Nodal в левой LPM и сердце является гомеобоксный ген paired-like homeodomain transcription factor 2 (Pitx2) (Рис. 6a), известный ранее как ген, который мутанте при аутосомно доминантном Rieger syndrome^{у людей. Функция Pitx2 неизвестна, хотя избыточная экспрессия Pitx2 в правой LPM у эмбрионов кур индуцирует образование симметричного unlooped сердца, указывая тем самым на возможную ключевую роль этого гена в петлеобразовании (looping) сердца. Интересно, что желудочки изгибаются нормально в право у Pitx2-нокаутных мышей, хотя мутантные сердца имеют дефекты образования пергородок и клапанов, которые сопровождают правый pulmonary и atrial isomerism, что указывает на потерю левосторонних качественных особенностей (identity). Избыточная пролиферация в мезодерме туловища и стенки тела у Pitx2 мутантов указывает на возможную роль этого гена в регуляции клеточного цикла. Отсутствие связи между экспрессией Pitx2 и направлением изгибания желудочков обнаруживается и в др. моделях, в которых N-cadherin блокирован и у IV/IV-мутантных мышей.
Кажущийся парадокс в Pitx2-мутантном фенотипе вызывает вопросы к L/R полю. Рандомизация looping сердца ассоциирует с аномалиями L/R пути во многих системах. На этом базируются influential теории происхождения асимметрии (laterality), согласно которым laterality обеспечивается в своей основе во всем остальном случайной генерацией молекулярной и морфологической асимметрии скорее, чем непосредственно предопределяет природу looping сердца. Это указывает на то, что все необходимые морфогенетические процессы looping являются внутренне присущими сердцу. Ясно, что ситуация более сложна и необходимо рассматривать отдельно инициацию отклонений от симметрии у ранних эмбрионов и интерпретацию асмимметрии предшественниками органов. Во многих моделях нарушения laterality у разных организмов, обычно рассматривается лево-сторонняя экспрессия эффекторных генов laterality, таких как Nodal и Pitx2 , а транскрипты, обнаруживаемые лишь временами на левой, правой или обеих сторонах, не рассматриваются вообще. Ничего удивительного, что сложные нарушния асимметрии возникают именно в таких условиях. Однако, у эмбрионов мыши, которые мутантны по некоторым генам, которые действуют прямо или косвенно на пути laterality, включая T (brachyury), Gdf1 (growth differentiation factor 1), Cfc1
(cripto, FRL1, cryptic family 1), Acvr2b (activin receptor 2b) и компаундные гетерозиготы Nodal- мутантных аллелей, поток laterality информации налево блокирован скорее, чем зашифрован. В разных мутантных линиях вентрикулярное изгибание оценивается как случайное, если оно направо или отсутствует. Важно, однако, где у эмбрионов этих линий выявляется правосторонний изомеризм в предсердиях и, т.к. не бывает настоящей реверсии looping сердца, т.к.сохраняется левым и правым желудочками их кранио-каудальное положение(arrangement) (Рис. 6c). Аномальная laterality у таких мутантов ведет к различным серьезным кардиальным аномалиям.
Можно ли сказать, что вентрикулярный перегиб контролируется с помощью пути laterality? Скорее следует сказать, что laterality не является основополагающим механизмом, но вносит существенный вклад в морфогенез сердца. Очевидно, looping сердца, осуществляемое на базе L/R аксиальной системы и передаче сигналов L/R, специализирует архитектуру кардиальной структуры. Однако, отсутствие связи между экспрессией Pitx2 и воспринятым направлением вентрикулярного изгиба вызывает сомнения относительно ценности этой системы оценки как метода, определяющего эффекты нарушения асимметрии на сердце. Возникают также вопросы относительно степени, с которой асимметрия м. вносить вклад в морфогенез вентрикулярной области сердца. С др. стороны, направление вентрикулярного пергиба оказывает дестабилизированым, если laterality в каудальной части сердца недетерминирована или изомеризована. Альтенативно, крупные нарушения вентрикулярного пергиба, которые возникают у эмбрионов, у которых отсутствует левосторонняя передача сигналов Nodal, указывают на то, что асимметрия, по-видимому, все-таки вносит вклад в морфологию желудочков. В самом деле, экспрессия некоторых генов в дополнение к Nodal, Lefty2 и Pitx2 увеличена с левой или правой стороны желудочков во время looping у разных видос (Рис. 6a). Возможно, что существуют градированные серии клеточных состояний, которые устанавливаются поперек желудочков в ответ на информацию о laterality, причем передача сигналов справа должна быть ключевым свойством системы.
<вшdiv ass=ct10>Summary and perspectives

Связь морфологии сердца и молекулярных механизмов с врожденными пороками сердца - важная цель. Установлено, напр., что доминантные мутации в одиночных генах кардиальных транскрипционных факторов у человека дают целый спектр кардиальных аномалий столь отличных как ATRIAL SEPTAL DEFECT и TETRALOGY OF FALLOT это подчеркивает недостаточность наших знаний о морфогенезе сердца. Недавние открытия существенной регенеративной способности в сердце открывают новое измерение в биологии развития сердца и подчеркивают факт, что онтогенетическая калька, однажды нарисованная, сохраняется до определенной степени в структуре законченного органа.}

PATTERNING THE VERTEBRATE HEART Richard P. HarveyNature Reviews Genetics 3, 544 -556 (2002)

"The pattern which connects is a metapattern, a pattern of patterns." Gregory Bateson

PATTERNING THE VERTEBRATE HEART
Richard P. Harvey
Nature Reviews Genetics 3, 544 -556 (2002)