В поляризованных эпителиальных клетках млекоптающих PAR-3/ASIP, PAR-6 и aPKC (гомолог PAR-3, PAR-6 и РКС-3, соотв.) образуют комплекс, который локализуется в плотных (tight) соединениях (Рис. 2с). Функциональные исследования показывают, что этот комплекс важен для установления полярности эпителиальных клеток через формирование плотных соединений. Экспрессия доминантно-негативного аРКС или различных форм PAR-6 разушают плотные соединения, тогда как избыточная экспрессия PAR-3/ASIP способствует формированию плотных соединений. Кроме того, активность аРКС важна для созревания de novo плотных соединений. Очевидно, что результатом этих взаимодействий белков является регуляция киназной активности аРКС. Связывание Cdc42 с PAR-6, по-видимому, потенциирует киназную активность аРКС, тогда как PAR-3 ингибирует активность аРКС. У
гомологи PAR-3, PAR-6 и РКС-3 функционируют вместе в некоторых разных типах клеток (напр., в поляризации ооцитов и неробластов). Одной из функций их в нейробластах является, по-видимому, локализация белка поддержки (scaffold) Inscuteable, чтобы ориентировать митотическое веретено (Рис. 2b). У рыбок аднио гомолог аРКС, называемый heart and soul, необходим для формирования и поддержания zonula adherents junctions во время раннего развития эпителия и играет также роль в ориентации веретена в сетчатке.
PAR-1 млекопитающих (mPAR-1) также, по-видимому, обладает законсервированной функцией поляризации клеток. В поляризованных эпителиальных клетках mPAR-1 локализуется в латеральном домене мембраны (Рис. 2с), а экспрессия варианта mPAR-1 без без киназного домена нарушает адгезию и полярность клеток. Исследование PAR-1 у
Drosophila впервые позволило предположить, что установление эмбриональной полярности м.б. законсервированным процессом. Как и у эмбрионов
C. elegans PAR-1 локализуется на заднем конце ооцита
Drosophila. Анализ par-1 мутантов выявил две различные функции в развитии ооцитов. PAR-1 необходим для ранней детерминации ооцита и позднее для установления передне-задней полярности ооцита. Отсутствие поздней функции PAR-1 ведет к дизорганизации микротрубочкового скелета ооцита, указывая тем самым, что микротрубочки или ассоциированные белки м.б. мишенями для PAR-1 киназы. В самом деле, в клетках млекопитающих PAR-1-подобные киназы, называемые microtubule-affinity regulating kunases (MARKs), фосфорилируют белки, ассоциированные с микротрубочками, spsdfz из диссоциацию от микротрубочек и увеличивая динамику МТ. Однако, пока не идентифицированы ассоциированные с микротрубочками мишени у
Drosophila. Более того, недавняя идентификация двух PAR-1 мишеней показала, что PAR-1 выполняет дополнительную роль помимо контроля цитосклета из микротрубочек. Во-первых, PAR-1 фосфорилирует белок Oskar, это ведет к его стабилизации на заднем конце ооцита, где он управляет формированием полярных клеток. Во-вторых, PAR-1, по-видимому, фосфорилирует Dishevelled (Dsh) белок и действует как регулятор пердачи сигналов Wnt. Продположено существоание PAR-1 партнеров по связыванию и идентифицирован гомолог
C. elegans PAR-5, белок 14-3-3. Белки 14-3-3 регулируют многочисленные клеточные процессы благодаря связыванию фосфорилированных консенсусных сайтов в белках-мишенях. Однако,
Drosophila PAR-5 связывает PAR-1 в области, отличной от его фосфосвязывающего кармана. Показано, что PAR-1 фосфорилирует 14-3-3 консенсусный сайт в белках-мишенях, создавая тем самым сайт связывания для 14-3-3. Ассоциация между PAR-1 и PAR-5, по-видимому, позволяет доставлять PAR-5 к сайту после фосфорилирования. В соответствии с этой моделью область в 30 аминокислот Dsh содержит фосфорилированный сайт с 14-3-3 консенсусной последовательностью. Далее, С-ТАК1 (cdc25C-associated kinase 1), PAR-1-подобная киназа млекопитающих, генерирует 14-3-3 сайт связывания после фосфорилирования белков-мишеней Cdc25 или KSR (kinase supressor of Ras).
Поскольку не найдено четких гомологов PAR-2 у др. организмов, то м.б., что PAR-2 играет специфическую роль в поддержании локализации PAR-3-PAR-6-PKC3 комплекса только у одноклеточных эмбрионов
C.elegans. Гомологи PAR-4 обнаружены у
Drosophila, Xenopus , мышей и человека. У людей PAR-4 гомолог LKB1 (или STK11) мутантен при синдроме Peutz-Jeghers, нарушении с предрасположенностью к полипозу и раку ЖКТ. Роль PAR-4 в формировании клеточной полярности продемонстрирована недавно на дрозофиле.
Microtubules and polarity establishment
Белки, рассмотренные выше, участвуют в становлении и поддержании клеточной полярности, но как полярность инициируется? У
C. elegans ооциты не имеют предетерминированной полярности. Вхождение спермия при оплодотворении является существенным индуцирующим полярность событием. Спермий вносит центросомы, которые становятся местом возникновения (nucleate) МТ, а полярность, по-видимому. индуцируется благодаря взаимодействию звездочек спермия с кортексом. Это взаимодействе предопределяет задний конец и ведт к ассиметричному распределению PAR белков. Слабые мутации компонентов anaphase promoting complex (APC) или гена RNA interference, кодирующего separin, обнаруживают неправильную ассоциацию звездочек спермиев с пронуклеарным комплексом в кортексе. У таких мутантов PAR-2 обнаруживается в цитоплазме в виде точек, а PAR-3 униформно распределен по кортексу, указывая тем самым, что подобное кортикальное взаимодействие нуждается в АРС и сепарине для поставки PAR-2 или удаления PAR-3 или обоих.
Набюдение у ранних живых одноклеточных эмбрионов белков PAR-2 и PAR-6 слитых с GFP, показало их униформное распределение по кортексу. Однако, во во время роста звездочек спермиев GFP:PAR-6 удалялся из кортекса в области его контакта со звездочками. Это удаление не зависело от PAR-2. Напротив, GFP:PAR-2 начинали окружать место контакта звездочек спермия с кортексом. Далее было установлено, что NMY-2, non-muscle myosin, необходим для эмбриональной полярности и существенне для инициального исключения PAR-6. Было высказано предположение, что взаимодействие микротрубочек из звездочек спермия с кортикальным актиновым цитоскелетом удаляет PAR-6 и облегчает локализацию PAR-2 на заднем конце. Известно, что PAR-2 и PAR-3-PAR-6-PKC-3 комплекс действительно исключают др. др. и что это являются частью механизма поддержания PAR асимметрии. Остается нерашенным вопрос, как взаимодействие Мт с кортексом влияет на локализацию PAR? А также как PAR белки соединяются с кортеексом? В эпителиальных клетках млекопитающих PAR-3/ASIP соединяется с JAM-1 трансмембранным junction белком, участвующим в адгезии клеток, это указывает на то, что JAM-1 м. направлять комплекс в плотные соединения.
В противоложность
C.elegans ооциты
Drosophila высоко поляризованы. Полярность возникает во время развития ооцита. Неполные асиммпе5тричные деления стволовых клеток зародышевой линии дают цисты из 16 взаимосвязанных клеток. Одна из них предназначена стать ооцитом, возможно благодаря асимметричному наследованию структуры, богатой мембранами, названной 'fusome'. Остальные 15 клеток становятся питающими, колторые поставляют компоненты растущему ооциту. Интактный микротрубочковый цитоскелет необходим для детерминации ооцита, т.к. разрушение микротрубочек ведет к образованию 16 питающих клеток и отсутствию ооцита.
Инициальная передне-задняя поляризация ооцита сильно зависит от поляризованного расположения МТ; а стабильный МТОС, формируемый в задней части, направляет каудально движение специфичных для ооцитов факторов, таких как Orb, Bicaudal D и Egalitarian. Позднее цитоскелет из микротрубочек реполяризуется, чтобы управлять асимметричной локализацией детерминант Bicoid и Oskar на переднем и заднем концах ооцита соотв. Инициальня поляризация ооцита нуждается в PAR-1б PAR-5, BAZ/PAR-3, PAR-6 и аРКС. Показано, что МТ необходимы для аккумуляции вновь направляемой изоформы PAR-1 (N1S) в ооците. Интересно, что после детерминации ооцита происходит локализация PAR-1 изоформы в задней части раннего ооцита комплементарно Baz/PAR-3 у эмбрионов
C. elegans . Т.о., МТ, по-видимому, важны для установления асимметричного распределняи PAR.
У мышей перводе деление дробления подразделяет эмбрион на две клетки с разной судьбой. Одна клетка дает эмбиональную часть бластоциста ( и стремится делитьс первой), а др. дает внеэмбриональную часть. Показано, что ориентация первого митотического веретена предопределяется местом последнего мейотического деления. Используя специальную фиксацию обнаруживались 'стабильные' МТ обеих митотических звездочек в контакте с областью мейотического midbody. Цейт-траферная съёмка веретена позволила увидеть движение к области параллельно мейотическому midbody перед делением. Т.о., взаимодействие МТ с кортикальным сайтом пердопределяет плосткость первого деления дробления, которая подразделеяет эмбрион на две клетки с разной судьбой.Следовательно, в одноклеточном эмбрионе мыши локализованы компоененты, которые дифференциально распределяются между дочернми клетками. В этой модели кортикальный сайт, содержащий МТ во время последнего мейотического деления (мейотическое midbody), м. играть роль и в организации полярности и в ориентации деления.
Поляризованное раннее деление дробления указывает на сущетвование молекул, обеспечивающих полярность и было бы интересным установить участие в этом процессе бенлков PAR. Нужно однако иметь в виду, что это "ассиметричное" деление не является предопределяющим. Ранне развитие мыши является высоко регулятивным, так что индивидуальные бластомеры способны сформировать полную мышь. Как осуществляется такая регуляция, неизвестно. Возможно, что ориентация веретена через взаимодействие с мейотическим midbody м. повторно восстанавливать асимметрию во время регулятивного развития.
Dynein and spindle positioning
Исследования разных систем показывают, что направленный к минус концам МТ моторный белок динеин и функционально связанный dynactin комплекс, участвуют в ориентации митотических веретен. У почкующихся дрожжей динеин и динактиновый комплекс необходимы для astral-microtubule sliding (скольжения) по кортексу. У мутантных по динеину и динактину клеток расположение митотического веретена в шейке почки дефектно ( у дрожжей веретено включено в ядро), а организация МТ аномальна с избыточным ростом и с изгибами МТ. Это указывает на то, что динеин и динактин обеспечивают взаимодействие между МТ и кортексом, которое необходимо для движения веретена в шейку почки.
У
C. elegans после установления полярности звоздочками спермия материнский пронуклеус мигрирует, чтобы встретиться с отцовским в задней части эмбриона. Пронуклеусы и ассоциированные с ними центросомы затем мигрируют в центр клетки. Эта миграция сопровождается 90
о ротацией нуклеоцентросом, которая ориентирует центросомы располагаться вдоль передне-задней оси (Рис. 2а). Снижение активности динеина или компонентов диактинового комплекса ингибирует эту ротацию.
Исследования клеток млекопитающих и
Drosiphila подтвердили роль динеина в ориентации веретена. В астроцитах динеин необходим доя переориентации МТОС, процесса, который также контролируется CDC-42 и аРКС. В поляризованных эпителиальных клетках млекопитающих динеин локализуется в окружающих слипчивые соединения языках (Рис. 2с). Избыточная экспрессия LIS1 нарушете локализацию динеина и динактина и это ведет к неправильной ориентации митотического веретена. Сходным образом в нецилиндрических жпителиальных клетках крыс ориентация митотических веретен вдоль длинной оси ингибируется инъекцией антител против динеина. Наконец, динеин необходим для правильной ориентации веретена во время делений стволовых клеток зародышевой линии у
Drosophila.
Spindle regulation via heterotrimeric G proteins
Пространственный контроль ориентации и расположения веретена д. соответствовать общей полярности клеток. Установлено, что гетеротримерные G белки являются предатчиками информации о полярности к митотическому веретену. Мишени для G белков неизвестны.
У
C.elegans помимо динеина и динактивого комплекса несколько др. молекул необходимы для события ротации, которое ориентирует первое митотическое веретено. У мутантов по некоторым par генам первая ротация иногда отсутствует, указывая тем самым, что эти молекулы полярности необходимы для локализации ротационной активности. В регулярной ротации, по-видимому. участвует Gβ субъеджиница гетеротримерного G белка: у Gβ мутантов ротация иногда отсутствует, но локализация и др. активности PAR белков неизменены, это указывает на то, что Gβ действует ниже PARs. Мутации в гене let-99 lf.n фенотип, очень сходный с таковым у Gβ мутантов с потерей ротации пронуклерного, центросомального комплекса. Вместо раотации у таких мутантов происходят преувеличенные движения пронуклеарно/центросомального комплекса в направлении разных кортикальных регионов, указывая на то, что это м. непосредственно регулироваться взаимодействиями МТ и кортекса. Белок LET-99 содержит DEP (Dishvelled/EGL-10/pleckstrin) домен, который обнаруживается в многочисленных регуляторах G белков. LET-99 преобладает в диске, окружающем область PAR-2 в одноклеточном эмбрионе (Рис. 2а) и эта локализация зависит от функции PAR белка. Преувеличенные движения пронуклеарно/центросомного комплекса у мутантов let-99 нуждаются в активности динеина. Предполагается, что LET-99 (возможно вместе с Gβ) локализует динеином-обеспечиваемые отталкаивающие силы за счет ингибирования их в области диска LET-99 (Рис. 2а).
После ротации пронуклеарно/центросомного комплекса первое митотическое веретено первоначално располгается центральнро. Но затем веретено смещается в каудальном направлении во время метафазы и анафазы. Это ведет к асимметричности первого делния с образованием большого переднего бластомера (АВ) и маленького заднего (Р1), каждый с различной даленйшей судьбой. Белки PAR контролируют эту асимметрию веретена за счет регуляции отталкивающих сил, действующих на полюсах. Показано, что у эмбрионов дикого типа имеется сильные отталкивающие силы, действующие на заднюю звездочку и слабые силы, действующеие на переднюю; к par-2 и par-3 мутантов силы одинаковы на каждом из полюсов, одинаково слабые у par-2 и одинаково сильные у par-3 мутантов. Белки PAR м. контролировать силы веретена с помощью регуляции двух пперекрывающихся Gα субъединиц гетеротримерного G белка. Когда функция Gα снижена, то митотическое веретено неспособно двигаться каудально, но др. аспекты клеточной полрности нормальны. Гетеротримерный G белок, по-видимому, регулируется посредством механизма, назависящего от рецепторов. Ингибирование ags-3.2 и ags-3.3, двух удаленных гомологов Ags3, независимого от рецепторов активатора передачи сигналов G белка у млекопитащих, ведет к фенотипу, идентичному с фенотипом потери Gα. Т.о., PAR полярность трансдуцируется на митотическое веретено посредством молекул Gα и Ags3, которые контролируют силы, действующие полюсы веретена с помощью еще неизвестного механизма.
Контроль расположения ветерена с помощью гетертримерных G белков и Ags3-подобных молекул законсервирован, т.к. они участвуют в этом процессе и в нейробалстах
Drosophiila . PAR белки Baz/PAR-3, PAR-6 и аРКС необходимы для полярности эпителиальных клеток. Нейробласты, вычленяющиеся из слоя эпителиальных клеток, наследуют PAR полярность от материнской клетки (Рис. 2 b). В таких нейробластах 90
о ротация ориентирует митотические веретена перпендикулярно по сравнению с таковым в эпителиальном слое. Этот проесс ротации также зависит от гетеротримерного G белка и Ags3-подобной молекулы, наз. Pins ()Partner of Inscuteable).
Т.о., в противопложность C.elegans гетеротримерные G белки затрагивают и позиционирование веретена и общую полярность в клетках дрозофилы. У некоторых мутантов полярности Drosophila (напр., inscuteable и pins) полумесяц кортикальных джетерминантов формируется, который не соответствует аномально ориентированному митотическому веретену. Однако, непосредственно пред делением в процессе, наз. 'telophase rescue', полумесяц оказывается в соответсвии с ветереном, это указывает на то, что сигнал полярности от веретена ориентирует полумесц, содержащий детерминанты. Это нашло подтверждение. У мутантов spn-4 C.elegans ротация нуклосом/центросомного комплекса отсутствует в Р1 клетке. У таких эмбрионов PAR-2 и зародышевые Р гранулы инициально локализованны нормально по отношению к задней Р1 клетке (но латерально по отношению к неправильно ориентированному веретену); однако, перед делением происходит перераспределение одного из двух полюсов, так что они оказываются првильно расположенными только в одной дочерней клетке. Перераспределение Р гранул отсутствует у Gβ мутантов, это говорит о том, что гетротримерные белки G м. контролировать полярность веретена. С этим согласуется то, что избыточная экспресся Gαi в неробластах дрозоилы также предупреждает telophase rescue.